Antigen המלאכותי הצגת תא הפעלה (aAPC) מתווכות והרחבת תאי T קטלניים טבעיים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לייצר תאים מציגי אנטיגן מלאכותיים המבוססים על CD 1D, או A APC, לצורך הרחבה של תאי NK T. דבר זה מושג תחילה על ידי הוספת חלבונים כדי להעניק פונקציונליות לחרוזי המגנט. בשלב השני, מועשרת אוכלוסיית תאי ה-NK T הראשונית מדם פריפריאלי.

בשלב הבא, תאי T מועשרים מתורגלים בcoco-culture עם ה-A A PC. בשלב הסופי, מוערכים הפנוטיפ והתפקוד של אוכלוסיית תאי ה-A A PC. לבסוף, ניתן לקבוע את טהרת תתי-אוכלוסיות תאי ה-T שהורחבו באמצעות אנליזה של ציטומטריית זרימה. היתרון העיקרי של APCs על פני שיטות נוכחיות המשתמשות בתאי דנדריטיים הוא שבתאים דנדריטיים עלולה להיות שונות גבוהה בין תורמים.

APC מלאכותיות מספקות שיטה סטנדרטית, הניתנת לשחזור וזמינה לשימוש מיידי, להרחבת תאי NK T. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר עבדתי עם ד"ר Schneck ו-oaky ב-Johns Hopkins. הם היו חלוצים בתחום השימוש בקומפלקסים מלאכותיים מציגי אנטיגן להרחבת תתי-אוכלוסיות קלאסיות של תאי T מסוג CD8.

את הפרוצדורה ידגים ד"ר James East, פוסט-דוקטורנט, ובנו של ד"ר Wendy, עמית מחקר מהמעבדה שלי. התחל בהעברה של 1 mL של חרוזי dyna bead M four 50 epoxy אל תוך מבחנה בעלת הברגה מזכוכית בורוסיליקט שקופה בנפח 5 mL. לאחר מכן, שטוף את החרוזים עם 3 mL של sterile bore eight buffer במבחנה נפרדת למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL.

הוסיפו 100 µg של human CD 1D IG dimer, ו-20 µg של המולקולות הקו-סטימולטוריות הרצויות לתוך 1 mL של PBS ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, הניחו את המבחנה הזכוכית המכילה את החרוזים על מגנט ושאבו את בופר הבוראט. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת החלבונים למבחנה הזכוכית והחזירו את הפקק.

ערבבו את התמיסה באופן מיידי על ידי היפוך של הבקבוק, לאחר מכן כסו את הפקק בפאראפילם והניחו אותה ברוטטור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, הניחו את הבקבוק מזכוכית על המגנט שוב והוציאו בזהירות את תערובת החלבונים תוך הימנעות מהחרוזים. שטפו את החרוזים שלוש פעמים על ידי הוספת 3 mL של באפר לשטיפת חרוזים ודגירה שלהם ברוטטור בטמפרטורה של 4°C למשך חמש דקות.

כדי לאשר שהחלבונים נטענו באופן יציב על גבי החרו지를, צבעו מנה (aliquot) של החרוזים באמצעות נוגדנים ובצעו ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה. כעת, העבירו 5×10⁷ חרוזים למבחנה זכוכית קטנה בנפח 1.5 מיליליטר ושטפו את החרוזים עם 1 מיליליטר של PBS סטרילי. לאחר מכן, המתינו 48 עד 72 שעות לפני השימוש.

טען את החרוזים השטופים באנטיגן בתוך מיליליטר אחד של PBS סטרילי בזמן שהחרוזים נטענים באנטיגן. אסוף את ה-PBMC תחילה על ידי דילול דם התור המהפרין עם נפח שווה של PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף 15 מיליליטר של PHI בטמפרטורת החדר לשפופרות קוניות של 50 מיליליטר, והנח באיטיות 25 מיליליטר של תערובת הדם המדוללת מעל ה-phi.

בצעו זאת לאחר סבוב של הדגימות בצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-700 $\times$g ובטמפרטורת החדר, כאשר פונקציית הבלימה (break) כבויה. השתמשו בפיפטת פסטור כדי להעביר בזהירות את שכבת הממשק של הלימפוציטים למבחנה קונית חדשה של 50 מ"ל. לאחר מכן, שטפו את הלימפוציטים ב-50 מ"ל של PBS, השליכו את העלייה (supernatant) ואחדו את המבחנות מאותו תורם למבחנה אחת.

לאחר שטיפה חוזרת של ה-PBMC עם 20 milliliters של PBS, ספרו את התאים ולאחר מכן השעיו אותם בריכוז של 5×10⁷ תאים ל-milliliter ב-max buffer. כדי לבודד את פракציית תאי ה-T, דגרו 100 µL של תמיסת העשרה של תאי PAN T מתוך ערכת ההעשרה של תאי T אנושיים של EP עם שני milliliters של PBMC למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את התמיסה עם 100 µL של חרוזי מגנט בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות נוספות.

השלם את הנפח הסופי של הממס ל-2.5 milliliters ולאחר מכן הנח את המבחנה במגנט. לאחר חמש דקות, שפוך במהירות את הפרקציה החיובית CD three למבחנה קונית של 15 milliliters. כעת שטוף את התאים ב-5 milliliters של max buffer קר, וספור את התאים החיוניים.

הסיר מנה (aliquot) לצביעה לצורך אימות, כדי לבחור תחילה את התאים החיוביים ל-CD 1 61. השהה מחדש את תאי ה-T המועשרים ב-980 microliters של max buffer קר בקרח, ולאחר מכן הדגר את התאים עם 10 micrograms של נוגדן מונוקלונלי anti CD 1 61 למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. לאחר שטיפת התאים, השהה מחדש את המשקע ב-800 microliters של max buffer וב-200 microliters של anti-US IgG one microbeads.

דגרו תמיסה זו בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות נוספות. בזמן שהתאים מדגריים עם המיקרו-בידס (microbeads), הוסיפו 3 mL של max buffer כדי להשוות (equilibrate) עמודת LS. לאחר שטיפת פראקציית תאים זו, העבירו באיטיות בעזרת פיפט את התאים ב-3 mL של max buffer אל תוך העמודה.

כעת שטפו את העמודה שלוש פעמים עם 3 milliliters של max buffer טרי. לאחר מכן, הוסיפו לעמודה 3 milliliters נוספים של max buffer טרי והעבירו את העמודה למבחנה קונית של 15 milliliters. הוציאו את התאים המזוהים כ-CD 1 61 positive ו-CD three positive שפוּררו, ולאחר מכן ספרו את הפракציה המועשרת בתאי NKT.

התחילו שלב זה על ידי תרבית משותפת של 10⁶ תאי T מועשרים CD161+ CD3+ ו-10⁶ תאי AAPC ב-16 מיליליטר של מצע מלא. העבירו 160 µL מהתרבית המשותפת לכל באר בלוח 96 באערים מפסטירון עם תחתית בצורת U שעבר טיפול לתרבית רקמות, עם מכסה למניעת אידוי נמוך. ביום 12 עד 14, קצרו את התאים וספרו אותם. נתחו את האוכלוסיות באמצעות אנליזה של ציטומטריית זרימה, ולאחר מכן חזרו על תהליך התרבית המשותפת.

את תאי ה-NKT המורחבים, כפי שהודגם זה עתה, ניתן להקפיא עבור תאי NKT עודפים לאחר סבב ההרחבה השני. כדי לבחון את התפקוד של תאי ה-AAPC, יש לבצע ראשית תרבית משותפת של 5×10⁴ תאי NKT לבאר עם 5×10⁵ תאי AAPC בנפח סופי של 200 µL של מצע גידול מלא בתוך פלטת 96 בארות בעלת תחתית מעוגלת. לאחר 24 עד 48 שעות, יש לאסוף את העל-נוזל של תרבית התאים לצורך אנליזה באמצעות ELISA. איור זה מדגים כי חלבוני ה-CD1D IG מקובעים באופן יציב על פני השטח של החרו지를 המגנטיים, כפי שמוצג כאן.

נוגדני CD 1D IG ו-anti CD 28 מבוטאים שניהם על פני השטח של החרו지를 המגנטיים, כפי שמוצג בגרף זה. היברידומת תאי NK T של עכבר חיובי ל-V alpha 14 מסוג DN 30 2D three תורבתה יחד עם A A PC שאינו טעון באנטיגן alpha galera מסיס במדיום, או עם A A PC טעון ב-alpha gal. לאחר מכן נאספו העל-נוזלים של התרבית, וייצור IL two נמדד באמצעות Eliza, מה שסיפק שיטה פשוטה לבדיקת כל מנה של תאים מציגי אנטיגן. בניסוי זה, תאי T מדם פריפריאלי אנושיים חיוביים ל-CD 1 61 וחיוביים ל-CD three הועשרו באמצעות הפרדה בחרו지를 מגנטיים.

לאחר מכן, התאים עוררו פעם בשבוע במשך 14 ימים באמצעות A A PC טעון alpha galera, ונבדקו עבור ביטוי של V alpha 24 ו-V beta 11. באופן משמעותי, נמצא שגם עם אוכלוסיית תאי NKT ראשונית נמוכה יחסית של 0.03%, ניתן היה להרחיב את התאים לאוכלוסייה של כ-67% חיובית ל-V alpha 24 וחיובית ל-V beta 11. כאן, תאי C one R CD 1D דגרו עם תאי NKT ביחסים המצוינים, בנוכחות או בהיעדר אנטיגן Alpha Gal SER, בלוחות 96 בארות עם תחתית מסוג U למשך 20 עד 24 שעות.

ליזיס של תאי לימפומה מסוג B המתווך על ידי תאי NKT הוערך לאחר מכן באמצעות בדיקת שחרור כרום. תאי NKT שהורחבו ב-PC היו מסוגלים להליס את קו תאי הלימפומה זה. בנוכחות או בהיעדר alpha galera, תאי NKT הורחבו מ-PBMC של מתנדבים בריאים ומחולי סרטן, והטענו ב-alpha galera.

היה ניתן להרחיב את אוכלוסיות תאי ה-NKT משתי הקבוצות. כאשר משתמשים באוכלוסיית התחלה של 2 מיליון תאי T חיוביים ל-CD161 וחיוביים ל-CD3, ניתן להשיג למעלה מ-10⁷ תאים לאחר שני סבבי הרחבה. ניתן להשתמש בתאי NKT שהורחבו לניסויים תפקודיים, כפי שמוצג כאן.

תאי ה-NKT שהורחבו ex vivo נשארים תגובתיים לגירוי של Alpha GAL והם יצרנים חזקים של IL 17 A, TNF alpha ואינטרפרון גמא. יש לציין כי אם אוכלוסיית העשרת תאי ה-T הראשונית נמוכה ולא ניתן לבצע את שלב העשרה ה-CD 1 61 השני, ההרחבה המתווכת על ידי A A PC עשויה שלא להניב את התוצאות המצופות. עם זאת, אם אחוז תאי ה-NKT במחזור הדם גבוה מ-0.1%, עדיין ניתן להשיג הרחבה משמעותית של תאי invariant NKT.

במצטבר, נתונים אלה מדגימים כי ניתן להשתמש ב-A A PC המבוסס על CD 1D כדי להרחיב ולהמריץ ביעילות תאי NK T אנושיים ראשוניים לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון QPCR, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מהי קינטיקת ההפעלה של תאי NK T לאחר פיתוחם. טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום ההפטולוגיה לבחון את תפקידם של תאי NKT במחלת הכבד השומני.