למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית דרוזופילה זחלים

מטרת הליך זה היא לנתח תפקודים מוחיים גבוהים. במודל פשוט, לביאות DFA באמצעות תיאבון, למידה ריחית אסוציאטיבית. דבר זה מושג תחילה על ידי איסוף של 30 לביאות בגיל השלישי (third instar) מבקבוקון מזון.

בשלב הבא, הזחלים מאומנים במשך חמש דקות על גבי צלחת פטרי עם פרוקטוז כגמול ומכלי ריח בכל צד המכילים octal אחד כגירוי חולחולתי. לאחר מכן, מבוצע שלב אימון שני של חמש דקות על גבי צלחת ללא גמול פרוקטוז ועם מכלי ריח בכל צד המכילים Amal acetate. לאחר שלושה חזרות של שני שלבי האימון, הזחלים נחשפים למכלי ריח בצדדים מנוגדים למבחן בן חמש דקות ללא גמול.

בסופו של דבר, העדפת ריח יחסית של ריח אחד מול Amal acetate מעידה על כך שזחלי דרוזופילה יכולים ליצור קישור בין גירויים הריחיים לבין תגמול של סוכר, וניתן להשתמש בכך כדי לחקור למידה אסוציאטיבית במערכת גמישה גנטית. שיטה זו, בשילוב עם התערבות גנטית בתפקוד העצבי, יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הלמידה והזיכרון, כגון מהם הנוירונים המאותתים על תגמול, או מהם הנוירונים הנחוצים או המספיקים לרכישה או לשליפה של זיכרון חוזר? הדגמת הפרוצדורה תהיה anti a postop.

סטודנט לדוקטורט מהמעבדה שלי הכין תחילה צלחות פטרי עם 2.5% aros ללא פרוקטוז. כדי להכין את צלחות הפרוקטוז, יש להוסיף את הפרוקטוז ל-aros המומס ולאחר מכן לצקת אותו לתוך הצלחת. לאחר מכן, סמן כל אחת מהצלחות הללו בסמל שונה כדי להבטיח שהניסוי יתבצע באופן סמיח (blinded).

הצלחת המכילה פרוקטוז היא תגמול ההתניה, והצלחת הרגילה היא הלא-תגמול. עבור גירויי ההתניה, הכינו סה"כ שלושה מכלים מותאמים אישית מטפלון לריחות עם 10 µL של one octal טהור. המכסים כוללים חורים קטנים המאפשרים אידוי של הריח.

שנית, הכין שלושה מכלים נוספים של ריח עם 10 µL של amyl acetate המדולל ביחס של 1:50 בשמן פראפין. דילול זה מושך באותה מידה כפי ש-10 µL של חומר טהור מושכים 30 זבובים הנמצאים במצב של הזנה ולא נדידה, החל מהאיסוף מתוך מבחנה של מזון.

ניתן לבצע פרוטוקול זה בכל שעה ביום. הוא אינו תלוי במקצבים צירקדיים. העבירו את הזחלים לצחנת פטרי המכילה מספר טיפות של מי ברז, והזיזו אותם בזהירות קדימה ואחורה בעזרת מברשת.

לאחר מכן, העבירו את הזחלים לצ그러ית פטרי שנייה המכילה גם היא מספר טיפות של מי ברז. בדקו אם קיימת משחת מזון על דפנות גופם של הזחלים. כעת הניחו את צ그러ית הפטרי במערך הניסוי כדי לאמן את הזחלים לקשר בין ריחות לבין רמז סוכר מסוים.

הניחו מכל ריח בצד שמאל ובצד ימין של אחד משני סוגי הצלחות ששימשו כגירויים. כאן מופיעה אחת שמינית, אך הבחירה היא שרירותית כיוון שהנסיין אינו יודע מהו הגמול. לאחר מכן, הניחו את קבוצת הזחלים במרכז הצלחת.

סגרו את המכסה והמתינו חמש דקות בזמן שהבעלי חיים נחשפים לגירויים. ודאו שהזחלים מסוגלים להתגבר על מתח הפנים של טיפת המים כדי שלא יילכדו ויוכלו לחקור בחופשיות. הניחו מיכל חדש של Amal acetate על צלחת פטרי נקייה.

לאחר חמש דקות, השתמשו במברשת לחה כדי להעביר את הזחלים לכלי מסוג הפוך, שבו נמצאים גירויים הפוכים בצדו השמאלי ובצדו הימני. במקרה זה, הריח הוא amal acetate. לאחר העברת הזחלים, סגרו את המכסה והניחו לבעלי החיים לחקור את הסביבה במשך חמש דקות.

כאשר זמן זה יסתיים, הושלב סבב האימון הראשון. בצע שני סבבי אימון נוספים באותו אופן כסבב הראשון. העבר את בעלי החיים באמצעות מברשת לחה וחשוף אותם לכל שילוב של גירוי וגמול שלוש פעמים בסך הכל.

עבור מקום הבדיקה הניסוית, הניחו מכלים עם ריח טרי, אחד מכל סוג גירוי, באתרים נגדיים בתוך צלחת פטרי סטרילית ללא ציפוי. העבירו את בעלי החיים המאומנים למרכז הצלחת. סגרו את המכסה והמתינו חמש דקות.

לאחר חמש דקות, השתמשו בתבנית מתחת לצלחת המגדירה בבירור שלושה אזורים בצלחת: שמאל, ימין ומרכז, וספרו את מספר הזחלים בכל אזור. האזור המרכזי מהווה ציון של חוסר העדפה, ובכך הוא הופך את הניתוח למגביל יותר ופחות נתון להטיה. לבסוף, כדי להשלים את הניסוי, בחרו 30 זחלים חדשים בגיל השלישי שמוזנים, וחזרו על האימון והבדיקה עם השילוב ההפוך של הגמול והגירויים.

המשך להשתמש באותם מכלים לריחות. נדרשים מספר מבחני ביקורת כדי לקבוע האם לבעלי חיים טרנסגניים יש עיבוד ריח תקין עבור גירויי התגמול. הבדיקה להעדפת ריח בבעלי חיים נאיביים מתחילה באיסוף ושטיפה של 30 זחלים, כפי שנעשה בשלבי האימון והבדיקה.

בשלב הבא, העבירו את הזחלים לצלחת פטרי עם agro rose שבה נמצא מבחנה אחת של גירוי בצד אחד. סגרו את המכסה והמתינו חמש דקות. לאחר מכן, בעזרת התבנית, ספרו את מספר הזחלים בצד הקרוב, במרכז ובצד הרחוק של הצלחת ביחס לגירוי.

בצע בדיקה זו עבור כל גירוי המשמש בניסוי כדי לבחון העדפה לסוכר במצב נאיבי. הכן פטריות חצייה-חצייה על ידי גזירת מחצית מהאגר של פטרית קורד ומילוי החלל הפנוי באגר מומס מהסוג השני. הקפד ששני החצאים יהיו שווים בנפחם ושלא ייווצר קו הפרדה מוגדר.

ייתכן שפעולה זו תדרוש תרגול עם צלחת חצויה שהוכן בטמפרטורת החדר, תוך הנחת 30 זבובים נאיביים שנוקו משאריות מזון. הנח זחלי כוכב במרכז הצלחת. סגור את המכסה והמתן חמש דקות.

לאחר מכן, באמצעות התבנית, ספרו את מספר הזחלים בכל צד וספרו את אלו שנמצאים במרכז. הנוהל המתואר שימש לאימון ובדיקה של זחלים טרנצ'גניים (trenchgenic). באמצעות גירויי הדוגמה, הנתונים נרשמו כמספר הזחלים באזורים השונים של פטריות הפטרי.

לאחר חמש דקות מחוץ להעדפה נתונים זו, חושבו מדדים ונגזרו מדדי ביצוע מהקבוצות שאומנו באופן הדדי. מכיוון שהזחלים שנבחנו היו טרנסגניים, הוצעה בחירה בין מיכל ריח מלא לבין אוויר, וכן בחירה בין ריחות טהורים לבין ריחות בתוספת סוכר. בחינה של המדדים שחושבו בתרשים קופסה גילתה כי בעלי החיים היו מסוגלים ללמוד להבדיל בין octal לבין ML acetate תוך שימוש בריחות פרוקטוז כחיזוק תאבוני.

החיות זיהו את שני הגירויים כמושכים והראו העדפה ראשונית לריח של פרוקטוז על פני ריח של אוויר. פרדיגמה ניסונית זו שימשה בהצלחה עם מגוון רחב של גירויים ריחויים וחזותיים, כמו גם עם מגוון רחב של גירויים מתגמלים ומענישים. פרדיגמה זו, בשילוב עם המניפולציות הגנטיות העוצמתיות הרבות הזמינות ב-drosophila, שימושית במיוחד בניתוח רשתות עצביות; לדוגמה, על ידי מניפולציה גנטית של קבוצות ספציפיות של נוירונים, המוגדרים על ידי תבניות ביטוי של gal4, ניתן להעריך את התפקידים הפונקציונליים של נוירונים אלו בלמידת תיאבון.

ניתן להשתמש בפרוצדורה זו, יחד עם הפרעה גנטית של התפקוד הנוירונלי, כדי לנתח את הרשתות העצביות של מוח הזחל המעורבות בלמידה ובזיכרון. בשל פשטותו של מוח הזחל, ניתן להשיג זאת עד לרמה של תא בודד.