Name: דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: למד פרוטוקול יעיל להפקת נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט multititre. השיטה מאפשרת ייצור מהיר של נוירונים עם בקרה על תהליך ההתמיינות למחקר במדעי המוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי אגודת מקס פלנק.

1. הכנת הצלחות Matrigel מצופות ומדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Matrigel הצלחות Matrigel המצופה כבר מצא להיות מצע מועדף לצירופה של הבחנת EBS וגם מקדמת היעילה התולדה של נוירונים מ10 אלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מיליליטר הפשרה של Matrigel הלילה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, מדלל דמוי הג&#39;לי Matrigel עם שני כרכים של DMEM/F-12 קר כקרח ולהכין aliquots של 1 מ&quot;ל ב15 צינורות חרוטי מ&quot;ל prechilled אשר עשוי להיות מאוחסן קפוא ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלט על פורמט צלחת להתמיינות עצבית. לדוגמה, כנקודת התחלה, אנו ממליצים לבצע סבב ראשוני של בידול בפורמט 12-כן. טרום מגניבות ארבע צלחות 12-גם ב 4 ° C. ממס aliquot אחד Matrigel הקפוא על ידי הוספת 9 מ&quot;ל של DMEM/F-12 מראש מצונן ואחרי pipetting מעלה ומטה עד שכל Matrigel prediluted כבר הפשיר ונמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז, להעביר את התוכן לתוך צינור חדש מ&quot;ל 50 המכיל 15 מ&quot;ל של DMEM/F-12 על קרח (דילול סופי Matrigel: 1:75). לאחר מכן יש להוסיף 0.5 מ&quot;ל של Matrigel המדולל לכל אחד גם מהצלחות מראש המקוררות 12-כן. לעטוף צלחות עם Parafilm ולתת לעמוד בRT בן הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להעביר צלחות עד 4 ° C. צלחות מצופות יכולות להיות מאוחסנות במשך מספר שבועות לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי תקשורת </li></ol> בינוני היווצרות EB (~ 15 מ&quot;ל צורך לבצע בידול באחד צלחת 96 היטב - ראה טבלה 1 וסכימה באיור 2): DMEM/F-12 עם 0.4% (PVA) 1x N2 1x B27 0.05% BSA 20 ng / ml FGF2 10 מיקרומטר Y-27632 1x PenStrepGln בידול בינוני (~ 30 מ&quot;ל הצורך לבצע בידול באחד צלחת 96 היטב, ואחרי היווצרות נוירון בצלחת Matrigel מצופית 1 12-כן, ראה טבלה 1): DMEM/F-12 1x N2 <br/&gt; 1x B27 0.05% BSA 0.5 מיקרומטר PD0325901 15 SB431542 מיקרומטר Dorsomorphin מיקרומטר 0.5 1x PenStrepGln 2. גיבוש EB כפייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בתנאי hPSCs מזין נטולי המועדפים שלך. אנו משתמשים במדיום MEF ממוזג על צלחות Matrigel מצופות 6-כן 15. עם זאת, מערכות תרבות אחרות כגון מדיה ביתית או מסחרית שהוגדרה צריכות גם לעבוד. בעת התחלת ניסוי בידול, hPSCs צריך להיות תת confluent ופעילה הולכים וגדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאני להסיר מושבות ספונטניות נבדלות באמצעות קצה פיפטה פלסטיק סטרילי תחת מיקרוסקופ סטריאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף מושבות עברו התמיינות נותרת באמצעות PBS ולעכל לתאים בודדים באמצעות Accutase המכיל 1X Y-27632. תאים גלולים בודדים על ידי צנטריפוגה XG ב 200 במשך 2 דקות, resuspend בנפח קטן של מדיום EB היווצרות ולקבוע titre תא באמצעות hematocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף aliquot של תאים כדיהבינוני נותר EB היווצרות כדי לגרום titre בין 40,000 ל 80,000 תאים למ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה רב, להעביר 100 μl להיטב לצלחת 96V בתחתית, וכתוצאה מכך 4,000 עד 8,000 תאים לכל היטב. ספין הצלחת 96-גם בצנטריפוגה צלחת נדנדה החוצה ב 400 XG ל1 דקות כדי לאסוף תאים בחלק התחתון של הבארות, ולהעביר לתא תרבות חממה. EBS יהווה בין הלילה, כפי שמוצג באיור 1. </li></ol> 3. אינדוקצית Neuroectoderm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (יום 0), לאסוף EBS מצלחת 96V תחת מיקרוסקופ והעברת סטריאו בנפח קטן לתוך צלחת חיידקים 3.5 סנטימטר המכיל 2 מ&quot;ל של מדיום בידול. עדינות להתסיס את המנה לכמה שניות כדי לשטוף את EBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של מדיום התמיינות לטובה של U-תחתון נמוך במיוחד-96-מצורף צלחת היטב. תחת stereomicroscope, ההעברה EBS בנפחים קטנים מתבשיל הכביסה ל96U הבארות (EB אחד לכולנוLL). צלחת המקום 96U לתוך תא תרבות החממה במשך 4 ימים כדי לאפשר היווצרות neuroectoderm. </li></ol> 4. גיבוש Neuron <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, להכין תבשיל כביסה כמו בשלב 3.1 ובנוסף להחליף DMEM/F-12 בצלחת שחוממה מראש Matrigel מצופת 12-היטב על ידי מדיום התמיינות (1 מ&quot;ל לטוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של EBS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף EBS מצלחת 96U, לשטוף אלה כאמורים לעיל, ובזהירות זרעם אחד אחד לתוך בארות של צלחת Matrigel המצופית 12-היטב (כ 8 EBS לטוב): EBS צריך להיות מופץ באופן שווה בתוך הבארות כדי לאפשר תולדה של הפרעה נוירונים במשך הימים הקרובים (ראה &quot;היום 5&quot; תמונה באיור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההעברה של גב הצלחת 12-גם לתוך החממה, תאפשר EBS לרפיון לצרף עבור סביב 10 דקות ב RT. ואז, להעביר צלחת 12-היטב בזהירות לתא תרבות חממה. הנוירונים יצמחו מEBS מצופה בצורה רדיאלית בתוך 4 הימים הבאים, כפי שshown באיור 2 (&quot;יום 8&quot; תמונה מהימין). </li></ol></li></ol> 5. גיבוש נוירון כmonolayers <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחלופה למדרגות נקודה 4), ביום 4 להליך, לאסוף EBS לתוך צלחת חיידקים 3.5 סנטימטר המכיל 2 מ&quot;ל של מדיום התמיינות, ולאחר מכן להעביר את EBS בנפח קטן לצלחת המכילה PBS, ולאחר מכן אל מנה נוספת המכילה Accutase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן לעכל לתאים בודדים, צנטריפוגה XG ב 200 במשך 2 דקות, resuspend בנפח קטן של מדיום בידול ולקבוע titre תא באמצעות hematocytometer. התאם titre ל1-2x10 6 תאים למ&quot;ל באמצעות מדיום התמיינות (ללא Y-27632). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים את הצלחת בצלחת שחוממה מראש Matrigel מצופית 12-כן (1 מ&quot;ל לטוב), והעברה לתא תרבות חממה. היווצרות נוירון כmonolayers נצפתה בין ימים 7 עד 8 ​​(האיור 3C). יש לציין, עם זאת, כי גרסה זו של monolayerהנוהל אינו מותאם באופן מלא בכל קשור להישרדות תא ומצע המתאים ביותר. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rosette-type%2C+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li>
<li>Pera, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation+by+BMP-2+and+its+antagonist+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin.</a> J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Activin%2FNodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).</li>
<li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+early+fate+decisions+in+human+ES+cells+by+distinct+states+of+TGFbeta+pathway+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity.</a> Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).</li>
<li>Greber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signalling+inhibits+neural+induction+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells.</a> EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).</li>
<li>Anderson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+dysautonomia+is+caused+by+mutations+of+the+IKAP+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene.</a> Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25, 929-938 (2007).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6, e18293(2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

רוב פרוטוקולי בידול מעורבי היווצרות EB מhPSCs, כולל ההליך שלנו שפורסם בעבר 10, מבוססים על קצירה ידנית או בסיוע של האנזים hESCs כאגרגטים, שמוביל בהכרח להטרוגניות בגדלי EB. עובדה זו מובילה לשונות ביעילות בידול עם כמה שורות תאים, ובכך הופך את הניתוח שיטתי קשה, במיוחד בקנה מידת תפוקה בינוני. יתר על כן, נתיחה ידנית היא עתירה עבודה שפוגעת בעצמו יכולת רחבה. לעומת זאת, בשיטה המתוארת כאן מבוססת על היווצרות EB מ...

hPSCs, המהווים עוברי מופקים תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע pluripotent מושרים (hiPSCs), הוא משמעות pluripotent שהם יכולים להצמיח שושלות תאים שונות במבחנת 1-2. סוגי תאים מובחנים רבים שנגזרים מhESCs עד כה, תומכים ברעיון כי התאים הללו מהווים כלים חשובים למחקר מדעי וגישות הקרנה מבוססות תאים, והבטחה עבור תרופות מבוססות תאים. פרוטוקולי בידול עצביים לhESCs הם בדרך כלל מורכבים ודורשים זמן רבים כפי שהם לעתים קרובות מבוססים על גורל 1 התרמה כולל עצבי, ואחרי בידוד ידני של אבות עצביים, ובידול מסוף רציף שסוג נוירון עניין מסוים 3-6. בהקשר מסוים, מורכבות זו אינה מפתיעה ובלתי נמנעת בהתחשב בכך שפרוטוקולי בידול מכוון כגון מדינה-of-the-art נוטים לחקות שלבי התפתחות אנושית מוקדמת, whicח הוא בעצמו מורכב ביותר. מצד השני, היא עשויה בחלקו גם משקפת חוסר ההבנה שלנו את התהליכים המולקולריים שבבסיס, וכתוצאה מפרוטוקולי בידול, כי הם עדיין רחוקים מלהיות מותאמים באופן מלא. בכל קשור להמרה של hPSCs עבר התמיינות לneuroectoderm, פרה et al. מצא כי דיכוי איתות BMP / SMAD1/5/8 משפר השראה עצבית של 7 hESCs. יתר על כן, איון של SMAD2 / 3 איתות הוכח לקדם היווצרות neuroectoderm 8. בהתאם לכך, בשילוב של איון שני מסלולים אלה נוטה להוביל להשראה עצבית יעילה יותר של hPSCs 4,9. לאחרונה, שהראינו כי מסלול איתות שלישית, FGF / ERK, משמש כמדכא חזקה של את הצעדים הראשונים של מחויבות neuroectodermal בhESCs. מנגד, דיכוי סימולטני של כל שלושה מסלולים אלו מובילים להמרה כמעט הומוגנית של hESCs לneuroectoderm עםבארבעה ימים בלבד 10. לאחר מכן, בידול מסוף היעיל ביותר לנוירונים פונקציונלי נצפה בתוך שמונה ימים. הנוירונים שהושגו היו עשויים להיות נוירונים חושיים של מערכת עצבים ההיקפית, שעשוי בחלקו להסביר הגזירה המהירה שלהם 10. ליקויים בתחזוקת נוירון חושית נחשבים סיבה להפרעות אדם מסוימות, כגון 11 דיסאוטונומיה משפחתית. לדוגמנות מחלות כאלה המבוססים על טכנולוגית hiPSC 12, לאפיון פונקציונלי נוסף, כמו גם למטרות שימושיות שלא דורשים כל סוג מסוים של תאי עצב, הליך הבחנה זו עשויה להציג בסיס שימושי. עם זאת, אסטרטגית הבידול העסקנו היווצרות מעורבת של גופים עובריים (EBS) במקור מגושים של מושבות hESC 10, וזה הביאה די מידת ההטרוגניות לגבי גדלי EB, והופיעה גם להתפשר יעילות היווצרות תא עצב בחלק ceקווי LL. יתר על כן, בשל ההטרוגניות בגדלי EB, היכולת השיטתית כדי לבחון השפעות של גורמי גדילה נוספים או מולקולות קטנות במהלך ואחרי היווצרות נוירון נראה היה מבולבלת במקצת. בדו&quot;ח זה, התאמן ההליך הקודם שלנו לטכניקה בינונית תפוקה תואמת, נאלצה צבירה מבוססת לייצר EBS באופן מאוד גודל מבוקר, כפי שהראה גם בהקשרים אחרים 13. כתוצאה מכך, נוצר EBS בבארות בצורת V של צלחות גם 96-הועברו לקובץ מצורף בצורת U נמוך במיוחד 96-גם צלחות, ליזום היווצרות neuroectoderm בהשעיה. ארבעה ימים לאחר מכן, EBS יכול להיות מצופה מהוליד הנוירונים נבדלים סופנים ביעילות גבוהה והומוגניות. לחלופין, יום-4 EBS היו ניתק לתוך תאים בודדים ומצופה כאמורים, אשר הביא monolayers צפיפות הנמוכה של תאי עצב אנושיים. תוצאות עקביות וכך התקבלו הרבה באופן עצמאי 2 דהקווים מבוקעים hESC, HuES6 וNCL3. כתנאי מוקדם, היווצרות EB המוצלחת הייתה בהחלט תלויה בשימוש בפולימר סינטטי, אלכוהול פוליוויניל (PVA), יחד עם מעכב ROCK Y-27632 הידועים כדי לקדם הישרדות hESC 13-14. כתוצאה מכך, ההומוגניות של EBS נוצרה ב96-V-צלחות היה משופר באופן משמעותי בהשוואה להיווצרות של EBS כתרבויות המוניות המבוססות על טכניקות פיצול אקראיות. מערכת זו ובכך מספקת פלטפורמה השתפרה באופן משמעותי להיווצרות neuroectoderm בתרבות השעיה, ואחרי היווצרות נוירון מבוקרת מאוד בתנאי חסיד.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Matrigel HC </td><td> הקיטון דיקינסון </td><td> 354263 </td><td> ראה טקסט לפרטים על הטיפול </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 21331-020 </td><td></td></tr><tr><td> פולי (ויניל אלכוהול) </td><td> סיגמא </td><td> 363170 </td><td> ממס ב 0.4% בDMEM/F-12 באמצעות waterbath קולי / למנוע התחממות יתר / יכול להיות כל זמן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות </td></tr><tr><td> מוסף N2 </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 17502-048 </td><td> 100X, לאחסן aliquots הקפוא </td></tr><tr><td> B27 מוסף </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 12587-010 </td><td> , חנות 50x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> שור הסרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A1595 </td><td> 10% = 500X, חנות כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> L-גלוטמין עם פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Paa </td><td> P11-013 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> Peprotech </td><td> 100-18B </td><td> להמס ב10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב0.1% BSA / PBS =, חנות 1000x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> ROCK המעכב Y-27632 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> עולים-129 </td><td> ממס ב 10 המ&quot;מ DMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Paa </td><td> H15-002 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Paa </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> 96-גם צלחות V-תחתונות </td><td> Nunc </td><td> 277143 </td><td></td></tr><tr><td> PD0325901 </td><td> אקסון Medchem </td><td> אקסון 1408 </td><td> להמס ב0.5 מ&quot;מ בDMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> SB431542 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> עולים-163 </td><td> להמס ב15 מ&quot;מ בDMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> Dorsomorphin </td><td> סנט קרוז </td><td> SC-200689 </td><td> להמס ב0.5 מ&quot;מ בDMSO =, חנות 1000x כaliquots קפוא </td></tr><tr><td> צלחות התקשרות נמוכות במיוחד תחתונות U-96-היטב </td><td> קורנינג </td><td> 7007 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן טובולין בטא שלישי (עכבר) </td><td> סיגמא </td><td> T8660 </td><td> להשתמש ב1:1000 </td></tr><tr><td> נוגדן טובולין בטא שלישי (ארנב) </td><td> Covance </td><td> PRB-435P </td><td> להשתמש ב1:2000 </td></tr><tr><td> נוגדן BRN3A (POU4F1) </td><td> סנט קרוז </td><td> SC-8429 </td><td> להשתמש ב1:500 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. &lt;/ Strong&gt; ריאגנטים וציוד ספציפיים. </td></tr></tbody></table>

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט multititre

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

פרוטוקולים קיימים לדור של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם (hPSCs) הם לעתים קרובות מייגעים שבהם נהלים רבים שלבים המעורבים הבידוד וההתרחבות של תאים מבשרים עצביים, לפני ההתמיינות סופנית. בהשוואה לגישות זמן רב אלה, שמצאנו לאחרונה כי עיכוב משותף של שלושה מסלולי איתות, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 וFGF / ERK, מקדם אינדוקציה מהירה של neuroectoderm מhPSCs, ואחריו בידול מיידי לנוירונים פונקציונלי. הנה, יש לנו הנוהל שלנו הותאמו לפורמט צלחת multititre רומן, כדי לשפר עוד יותר את השחזור שלה וכדי לעשות את זה תואם עם יישומי אמצע תפוקה. היא כוללת ארבעה ימים של היווצרות neuroectoderm בתחומים צפים (גופי embryoid), ואחריו ארבעה ימים נוספים של בידול לנוירונים בתנאי חסיד. רוב התאים שהושגו עם פרוטוקול זה להיראות נוירונים חושיים דו קוטביים. יתר על כן,ההליך הוא יעיל ביותר, אינו דורש מיומנויות מומחה מסוימות, והוא מבוסס על מדיום הגדרה כימית פשוט עם מולקולות קטנות חסכוניות. בשל תכונות אלה, ההליך עשוי לשמש כפלטפורמה שימושית לחקירה פונקציונלית נוספת וגם להקרנה מבוססת תאים מתקרב דורש נוירונים חושיים אדם או נוירונים מכל סוג.

בדו&quot;ח הקודם שלנו, בקו אחד עם רבים אחרים, EBS מhPSCs יכול להיות שנוצר פשוט על ידי replating אגרגטים בזמן חלוקה שגרתית של hPSCs למאכלים-התקשרות נמוכה 10. בדרך כלל זה גורם הפצה רחבה של גדלים וכתוצאה EB (האיור 1C, למעלה). בעיה נוספת שנובעת מכך היא שמרה EBS בהשעיה נוטה לצבור אחד עם שני, מה שמוביל להטרוגניות גבוהה אף יותר של גדלי EB. כדי להתגבר על בעיות אלו, ולכן אנו מנסים ליצור EBS על ידי ציפוי hPSCs היחיד להתקשרות נמוכה בארות של צלחות multititre <stron...

פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

פרוטוקולים קיימים ליצירת נוירונים מתאי גזע אנושיים פלוריפוטנטיים (hPSCs) הם לרוב מייגעים, הינם מהווים הליכים רב-שלביים...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לגזור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (H PSCs) לנוירונים באמצעות פורמט של פלטת טיטראציה מרובה. דבר זה מושג על ידי קציר והזרקה של תרחיף תאים בודדים של H PSCs לתוך פלטות 96 בארות בעלות תחתית בצורת V, כדי ליצור גופי עובר (EBs) במהלך הלילה.בשלב הבא, מעבירים את ה-EBS לפלטות בצורת U בעלות היספחות נמוכה מאוד (ultra-low attachment) המכילות מצע דיפרנציאציה, כדי להשרות היווצרות של נוירואקטודרם. לאחר מכן, זורעים את ה-EBS בצלחות מצופות מטריג'ל (matrigel) כדי לעודד צמיחה של נוירונים. ניתן לקבל תוצאות המראות נוכחות של סממנים נוירונליים טיפוסיים סביב היום השמיני באמצעות אימונופלואורסצנציה.פרוטוקולי צביעה להבחנה של תאי גזע אנושיים פלוריפוטנטיים לנוירונים הם לרוב מורכבים ומייגעים. באופן מקרי למדי, נתקלנו בהליך פשוט מאוד להפקת נוירונים מתאי גזע אנושיים פלוריפוטנטיים.מנקודת מבט טכנית, היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא קלה לביצוע, מהירה ויעילה מבחינת עלות. במקביל, את הפרוצדורה יעביר ד"ר MI Z מהמעבדה. הכין מצע להיווצרות EB ומצע דיפרנציאציה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.גדלו תאי PSCs אנושיים בתנאים ללא תאי מאכיל (feeder free), כגון מצע גידול מותנה ב-meth על צלחות מצופות matrigel, או באמצעות מערכות תרבית מוגדרות כימית בתנאי צמיחה פעילים מתחת לסף התבכירות (sub confluent). הסירו מכנית מושבות שהבדילו באופן ספונטני באמצעות מיקרוסקופ סטריאו וקצה של פיפטת פלסטיק סטרילית. שטפו את המושבות הבלתי מובדלות שנותרו ב-PBS והשתמשו ב-Accutane המכיל 1x rock inhibitor לפירוק לתאים בודדים.שקעו את התאים הבודדים על ידי סנטריפוגציה ב-200 G למשך שתי דקות והשעיו אותם בנפח קטן של מצע ליצירת EB. השתמשו במכשירי ספירת תאים (hemocytometer) כדי לקבוע את ריכוז התאים. הוסיפו תאים נוספים למצע יצירת ה-EB שנותר עד להגעה לריכוז של בין 40,000 ל-80,000 תאים למילילטר.בעזרת פיפט רב-ערוצי, העבירו 100 µL לכל באר בלוח 96 בארות בעובי תחתון (V bottom plate), כך שיהיו 4,000 עד 8,000 תאים לבאר. סבבו את הלוח בצנטריפוגה ללוחות עם ראש נתיב (swing up plate centrifuge) ב-400 G למשך דקה אחת כדי לרכז את כל התאים בתחתית הבארות. העבירו את התאים לאינקובטור והמתינו למשך הלילה להיווצרות EBS; ביום למחרת, בדקו את התאים תחת מיקרוסקופ סטריאו.אספו את ה-EBS והעבירו בנפח קטן לצלחת חיידקים בקוטר 3.5 סנטימטר המכילה שני מיליליטר של מדיום דיפרנציאציה. שטפו את התאים על ידי סיבוב עדין של הצלחת. הוסיפו 100 מיקרוליטר של מדיום דיפרנציאציה לכל באער בלוח בעל הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment).תחתית של פלטת 96 בארות תחת מיקרוסקופ סטריאו. העבירו EBS בנפחים קטנים מכלי השטיפה אל תוך 96 בארות מסוג U. דגרו את ה-EBS במשך ארבעה ימים כדי לאפשר היווצרות של נוירואקטודרמה (neuroectoderm) ביום הרביעי.שטפו את התאים במדיום דיפרנציאציה וזרעו אותם אחד אחד לתוך בארות של פלטה רב-תאית מצופה במטריג'ל (matrigel), כגון פלטה בעלת 12 בארות. יש להפיץ את התאים באופן שווה בתוך הבארות כדי לאפשר צמיחה רציפה של נוירונים. השאירו את ה-EBS להיקשר באופן רפוי למטריג'ל למשך כ-10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, העבירו בזהירות את הפלטה לאנקובטור. נוירונים יצמחו מה-EBS שהוצבו בפלטה באופן רדיאלי במהלך ארבעת הימים הבאים. בעבר הראינו, בדומה למחקרים רבים אחרים, כי ניתן להפיק EBS מתאי H PSCs פשוט על ידי זריעה מחדש של אגרגטים בעת פיצול שגרתי של H HPCs לתוך כלי בעלי הידבקות נמוכה.דבר זה מוביל בדרך כלל להתפלגות רחבה של גדלי תאים. בעיה נוספת היא ש-EBs המתוחזקים בסספנסיה נוטים להתרקב זה עם זה, מה שמוביל להטרוגניות גבוהה עוד יותר בגודל. כדי לעקוף זאת, ה-hPSCs הוכנסו לבארים בעלות הידבקות נמוכה, דבר שהוביל להיעדר היווצרות של EBs ולמוות של התאים. עם זאת, שילוב של המולקולה להישרדות תאים, Y 2 7 6 3 2, עם polyvinyl alcohol, אשר הוכח כמשפר את היווצרות ה-EBs מ-hPSCs, אפשר ל-EBs להיווצר מסספנסיות של תאי hESC בודדים במהלך הלילה.באופן נוח, ניתן היה לשלוט באופן הדוק בגדלי ה-EB בפורמט של פלטת ריכוזים מרובה זו על ידי הצבת מספרים שונים של תאים לכל באר. בניגוד לשימוש בטכניקות קונבנציונליות, לאחר העברת ה-EBs לפלטות 96 בארות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד, ה ownהוצרה של הנוירואקטודרמה הונעת באמצעות תערובת של מולקולות קטנות המורכבת ממעכבי F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA two ו-BP SMA one, מה שאיפשר לאחר מכן לזרוע את התאים על matrigel כדי להביא להיווצרות נוירונים. התחלת היווצרות ה-EB מכ-8,000 תאים הניבה את יכולת הבידול הנוירונלית הטובה ביותר, המאופיינת בצמיחה נוירונלית בולטת מה-ebs הזרועים.מרכזי EB נמקרוטיים מופחתיים לאחר הזריעה וביטוי גבוה של סממנים תחושתיים ופנ-נוירונליים כגון B rrn three A ו-beta three tubulin. נראה כי יעילויות ההבחנה הנוירונלית הכוללות דומות לפרוצדורה המקורית, אשר ישימה עד כה הן עבור HSCs והן עבור HI PSCs. שלושה קווי HPSC בלתי תלויים, תאי HES וכן תאי HIPS, נבחנו בהצלחה בפרוצדורה הרב-בארית, בעוד שבאופן כללי לא ניתן לשלול שונות התלויה בקו התאים ויעילויות הבחנה משתנות.איור זה מציג תאים נוירואקטודרמליים בודדים ומפוylיים מהיום הרביעי, אשר נזרעו כתאים בודדים והבדילו בהצלחה ביעילות של כ-60%. הטיפול ב-EBS בפלטפורמת ה-multi titter דורש מעט אימון בהתחלה, אך לאחר זמן מה תראו שזה די פשוט.

rapid-efficient-generation-neurons-from-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

הסרטון מציג שיטה לנתק ולשתול מחדש תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות אנזים מפרקי חלבון עדין. לאחר סינון וצנטריפוגה, הנוירונים מצופים מחדש על צלחת מרובת בארות מצופה לדגירה, קידום התקשרות והתבגרות.

ציפוי מחדש של תאי עצב ממוינים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

סרטון זה מדגים את תהליך התמיינות גופים עובריים (EBs) לצברים נוירואפיתליאליים וחלוקתם לאחר מכן לתאי עצב וגלייה. שיטה זו מאפשרת יצירה יעילה של תאי עצב וגליה במבחנה, המשמשים כמערכות בדיקה לבדיקת רעילות וכן להערכה של מסלולים שונים המעורבים ברעילות עצבית.

יצירת תאי עצב ותאי גליה מגופי עובר פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

סרטון זה מתאר שיטה להכנת כיסויי זכוכית המצופים בפוליאורניתין ולמינין כדי לשפר את ההידבקות והצמיחה של תאי גזע עצביים. הטכניקה כוללת דגירות רציפות ושטיפות, מה שמקל על היווצרות מטריצה תומכת המקדמת צמיחה והתמיינות של תאים עצביים, המחקה מבנים הנמצאים בנוירונים.

יצירת נוירונים פירמידליים קורטיקליים מתאי גזע עצביים אנושיים

כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

אנו לשנות וליישם פרוטוקול שפורסם בעבר המתאר את הבידול מהירה, לשחזור, ויעיל של תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) לתוך נוירונים בקליפת המוח מעוררים 12. באופן ספציפי, השינוי שלנו מאפשר שליטה של ​​צפיפות תאים עצבית ושימוש על מערכים מיקרו-אלקטרודות למדוד תכונות אלקטרו ברמת הרשת.

בידול העצבי המהיר של גזע תאים המושרה pluripotent למדידת פעילות רשת על מערכי מייקרו-אלקטרודה

Organoids מוחי לייצג מערכת מודל חדש לחקור מוקדם המוח האנושי לפיתוח במבחנה. מאמר זה מספק את המתודולוגיה מפורט לייצר ביעילות organoids הומוגנית מסוג הקדמי הגבי מתאי גזע pluripotent המושרה האנושי כולל שלבים קריטיים איפיון ואימות.

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט עבור השעיית מחדש ו culturing תא גזע אנושי נגזר שהיו הבדיל בעבר מושלתי עצביים בתוך מבחנה במשך שבועות מרובים. ההליך מאפשר הדמיה מבוססי מבוסס על neurites, סינפסות, וסמנים מאוחר ביטוי עצבי בפורמט תואם עם מיקרוסקופ אור והקרנת תוכן גבוה.

לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה

אנו מראים את האוטומציה של תרבויות תאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSC) הנגרמים על ידי בני אדם ובדיונים עצביים התואמים להדמיה וניתוח אוטומטיים.

ייצור אוטומטי של נוירונים קורטיים קורטיים ודופאמין נגזר תאי גזע המושרה על ידי תאי גזע אנושיים עם ניטור משולב של תאים חיים

למד פרוטוקול יעיל להפקת נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט multititre. השיטה מאפשרת ייצור מהיר של נוירונים עם בקרה על תהליך ההתמיינות למחקר במדעי המוח.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

גלה סרטונים נוספים