Name: ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: חקור את תפקידי האיתות האפיתל-מזנכימליים בהתחדשות זקיקי השיער באמצעות שיטת השתלה מהירה בעכברים. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה של פונקציית גנים בתהליכי התפתחות ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) ומענקי NIH AR052785 וAR046786 (AEO ווו-MW).

<ol><li>Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIM+and+cortactin+antagonism+regulates+ciliogenesis+and+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling.</a> Dev Cell. 19, 270-283 (2010).</li>
<li>Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+dermal+papilla+cells+in+hydrogels+reveals+intrinsic+differences+between+Sox2-positive+and+-negative+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).</li>
<li>Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+procedure+to+reconstitute+hair-producing+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).</li>
<li>Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+mouse+models+for+hair+follicle+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution.</a> Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).</li>
<li>Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+regulation+of+murine+hair+growth%3A+insights+from+grafting+defined+cell+populations+onto+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice.</a> J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).</li>
<li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li>
<li>Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+mouse+vibrissal+dermal+papilla+cells+and+de+novo+hair+follicle+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction.</a> Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).</li>
<li>Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+in+dermal+papilla+cells+is+required+for+their+hair+follicle-inductive+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties.</a> Genes Dev. 22, 543-557 (2008).</li>
<li>Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-lox-regulated+conditional+RNA+interference+from+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).</li>
<li>Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+hair+follicle+development+in+vivo%3A+determination+of+follicle+formation%2C+hair+growth%2C+and+hair+quality+by+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).</li>
<li>Woo, W. -M., Zhen, H. H., Oro, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+maintains+dermal+papilla+identity+and+hair+morphogenesis+via+a+Noggin-Shh+regulatory+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop.</a> Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).</li>
<li>Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+dermal+papilla+cells+into+inductive+spheroidal+microtissues+on+poly%28ethylene-co-vinyl+alcohol%29+membranes+for+hair+follicle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration.</a> Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).</li>
<li>Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+from+dissociated+cells%3A+generation+of+mature+cycling+hair+follicles+from+skin-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells.</a> J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

מבחני כינון מחדש שיער לספק מודל התחדשות איבר ייחודי לבחינת מנגנון היווצרות זקיק שיער דה נובו. כאן, אנו מתארים assay שיער קאמרי שונה שימושי לקביעת תפקוד גן במבנה זקיק שיער. הבדיקה שלנו מבוססת על הבדיקה דיווחה הקאמרית שיער הכינון מחדש 5, 6,11, שאנו שונים כדי להציג את טכניקת ביטוי lentiviral להשיג ביטוי יתר מציאת גן או באחד משני סוגי תאי עור או האפידרמיס. הבדיקה שלנו מספקת חלופה מהירה ליצירת נוקאאוט הגנטי רקמות ספציפיות. בדיקה זו מאפשרת לנו להפגין תפקוד גן במבנה זקיק שיער קטן כמו 3 שבועות מהדבקת תאים ראשוניים עם lentivirus לאוסף שתל. הבדיקה שלנו ניתן להאריך להתייחס אינטראקציות גנטיות באמצעות שילוב shRNA / משלוח cDNA ידי lentivirus לסוג תא אחד 12, כמו גם מאפשר בדיקה של איתות בין תאי העור האופייני ואפידרמיסes. בדיקת השיער שלנו היא מתאימה ביותר לאיתור רווח או פסד--of-פונקצית פנוטיפים חזקים בהתחדשות זקיקי שיער, ואילו פגמים עדינים קשים יותר לצפות. אנחנו הוכחנו הצלחת תפקוד גן מסוים עור של כמה גנים באמצעות assay התחדשות השיער שלנו 1,12. בהתבסס על סמן GFP שיתוף הביע מוקטור lentivirus להביע shRNA 10, הראינו כי shRNA להביע תורם בתאי עור התמיד בשתלי השיער מחדש. תאי ה-GFP חיוביים נכחו בפטמית עורי (DP) של זקיקי שיער ההתחדשות (איור 3). התאים העקורים סבירים כללו רמות שונות של מציאת גן כתאים הביעו רמות שונות של GFP, ובכך הפנוטיפ זקיק השיער שנצפה היה ממגוון הגנטי hypomorph לnull. שיפור אחד assay זה יהיה להקים בחירה מהירה ויעילה לתאים הגבוהים shRNA להביע לפני graftinז כגון שימוש FACS לטהר תאים חזקים GFP להביע-. אלטרנטיבה היא להחליף תאי נוקאאוט מוטציה או מותנים בבדיקת 9 זה. מצד השני, מערכת תרבות שיכול לשמר את תפקוד תא DP היא מאוד שימושית כעצמת DP היא אבדה בהדרגה את תאי עורי פעם אחת העיקריים הם passaged. מערכות תרבות אפשריות כוללות שימוש בחומרים ביולוגיים הנגזרים מנישה מלאכותית או תרבויות צבירה 2,7,8,13. שיפור נוסף יהיה ליצור שיטה אמינה אפידרמיס תא קפוא עם שיעור החלמה גבוהה תא כמו זה יהיה להפחית את השימוש בסט השני של גורי עכברים (צעד 7) כדי לייצר הקרטינוציטים טריים באובדן או ספציפי לעור רווח-of- מחקרי פונקציות. בדיקת שיער תא זה מייצרת צפיפות ואיכות דומה לעור עכבר רגיל זקיק שיער, למרות שצמיחת שיער היא מעט פחות מסונכרנת וכיוון זקיק הוא יותר אקראי. כמה מגבלות של הבדיקה הגנטית התחדשות שיער includדואר הדרישה של כמות גדולה של lentivirus ומספרים סלולריים, וזה מאוד עבודה אינטנסיבית במונחים של שיטות ניתוחיות בהשוואה לצורות אחרות של מבחני כינון מחדש שיער כגון תיקון ומבחני דש 3,4,14. עם זאת, האיכות של זקיקי שיער וצייר זמן כדי לזהות צמיחת שיער היא מעולה למבחנים אחרים 4. assay התחדשות השיער הממוקד שלנו מספק לוויה מהירה ונוחה למודלים גנטיים קיימים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> CNT-07 </td><td> התא N Tec </td><td> CNT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> מוסף AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> רוש </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, סוג 1 </td><td> סיגמא </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> סיגמא </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> צלחת תרבית רקמה </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> מספריים מבתרים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> מצבטים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 10-275 </td><td> מעוקל </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex אספקה </td><td> GRF-2975 # 10 </td><td> אין גודל. 10 </td></tr><tr><td> Stainer התא מיקרומטר 70 </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> צינור צנטריפוגה חרוטים 15 מ&quot;ל </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> מטליות אלכוהול </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> מחט מד 23 </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> חומר סיכת עין </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> מטליות Providone-lodine </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> הסיליקון צ&#39;יימברס </td><td> רנר GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> תפרים </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> תחבושת גמישה </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> רוטב ללא חסיד </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> חומרים </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> שטוף את הפתרון PBS 500 מיקרוגרם / המ&quot;ל פניצילין / סטרפטומיצין 12.5 מיקרוגרם / המ&quot;ל Fungizone 100 מיקרוגרם / המ&quot;ל Gentamycin פתרון Dispase HBSS 2.5 מ&quot;ג / המ&quot;ל הסופי Dispase 100 מיקרוגרם / המ&quot;ל Gentamycin תקשורת המנטרלת HBSS 15% (v / v) FBS פתרון collagenase 0.25% (w / v) collagenase, סוג 1 ontent &quot;&gt; 100 מיקרוגרם / המ&quot;ל פניצילין / סטרפטומיצין 2.5 מיקרוגרם / המ&quot;ל Fungizone 50 מיקרוגרם / המ&quot;ל Gentamycin פתרון Polybrene HBSS 8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(w / v) Polybrene </td></tr></tbody></table>

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

המורפוגנזה שיער זקיק, תהליך מורכב הדורש אינטראקציה בין הקרטינוציטים epithelia נגזרות וmesenchyme הבסיסי, היא מערכת מודל אטרקטיבית ללמוד פיתוח איברים ורקמות איתות ספציפית. למרות התפתחות זקיק שיער היא ניתוח גנטי צייתן, מהיר ושחזור של גורמים חיוניים לתהליך זה עדיין מהווה אתגר. כאן אנו מתארים הליך כדי להפיק ביטוי יתר ממוקד או מציאת shRNA בתיווך של גורמים באמצעות lentivirus באופן רקמות ספציפי. שימוש בגרסה שונה של מודל התחדשות שיער 5, 6, 11, אנחנו יכולים להשיג רווח או חזק ניתוח אובדן-of-פונקציה בהקרטינוציטים עכבר עיקריים או תאי עור כדי להקל על מחקר של מסלולי אפיתל-mesenchymal איתות שמובילים להמורפוגנזה זקיק שיער . אנו מתארים כיצד לבודד הקרטינוציטים טריים עיקריים עכברים ותאי עור, המכילים תאי פטמית עור ובין קודמיהם, לספק lentivirus contaiנינג או shRNA או cDNA לאחת מאוכלוסיות התאים, ולשלב את התאים לייצר זקיקי שיער שנוצרו באופן מלא על גבם של עכברים בעירום. גישה זו מאפשרת ניתוח של גורמי רקמה ספציפיות הנדרשים ליצירת זקיקי שיער בתוך שלושה שבועות ומספקת לוויה מהירה ונוחה למודלים גנטיים קיימים.

באיור 1 אנו מראים את התוצאה של מציאת shRNA lentiviral עור ספציפית של יתפוגג (SMO), רכיב איתות ששש קריטי, בשתל שיער רגנרטיבית שבועות 3 ישן. שתלי שליטה באמצעות וקטור lentiviral לבד להראות צמיחת שיער חזקה (איור 1 א). לעומת זאת, מציאת עור ספציפי של תוצאות SMO באובדן צמיחת שיער (1B איור). Hematoxylin וeosin כתם מתארים את השלב של זקיקי שיער בשליטה ובתנאי ניסוי (האיור 1C, ד). הפנוטיפ צמיחת השיער מטיפולים דומים יכול להיות משתנה בין ניסויים, כולל שליטה החיובית עם דלקת לבד וקטור lentiviral. שתלי בקרה חיוביים לכן תמיד צריכים להיות כלולים בכל ניסוי כהפניה כ30% משתלים יכולים להיכשל כתוצאה מצלקות או קובץ מצורף שלם של שתלים. במקרה של בדיקת אינטראקציה בין שני גורמים כגון overexpressing cDNA של גורם אחד מחדשמציאת shRNA בתיווך scue של גורם נוסף, יש תמיד כוללת שתלים בלבד למציאת מניפסט תוצאת אובדן של תפקוד בכל ניסוי. זה יספק טווח נחוץ כדי לקבוע כיצד גן מסוים perturbs מסלול זקיק שיער התחדשות ואיך שני גני האינטראקציה. הסרה של החדר (איור 2 א) חייב להיעשות בזהירות. השתל חדש שנוצר צריך להיות מעט אטום עם משטח עמום (איור 2 ב &#39;). השתל עלול להידבק לקנה, אז הרים בעדינות צד אחד הוא חשוב לוודא השתל נשאר מחובר למיטת הפצע. השתל הוא די יציב לאחר שלושה ימים וצריך להציג את הקושי בעת הסרת האיפור. צמיחת שיער חזקה צריכה להיות שנצפתה לאחר שלושה שבועות (האיור 2C). השמטה או mDCs או KCs תגרום אתר פצע החלים ללא כל שיער (האיור 2D) 11. מוות של תאים או אובדן תא באחדסוגי תאים גם תוצאות לא שיער, בניגוד להתחדשות שיער מופחתת במציאת עור-SMO כפי שמוצג בתרשים 1B. כדי להבטיח assay מוצלח, זה קריטי כדי להשיג יותר מ 90% זיהום נגיפי של תאים עם ביטוי יתר מתאים או יעיל מציאה לפני ההשתלה. בשל אילוצי הזמן של הליך ההשתלה, אנו ממליצים יעילות זיהום ויראלי צרות ירי לפני התחלת ניסוי השתלה, ותמיד לשמור חלק קטן מתאים ביום של השתלת הליך כדי לוודא פסד או רווח, לביטוי. כייל lentiviral ישתנה בהתאם לשימוש, ולבנות צריך להיקבע לפני זיהום כדי להשיג יעילות 90-100%. אנו מנטרים את יעילות זיהום ויראלי עם GFP coexpressed מוקטור lentiviral. אנחנו לבצע באופן שגרתי כתם מערבי PCR ו / או כמותית כדי לקבוע את היקף מציאה או ביטוי יתר. ניצול וקטורים כפולי ביטוי עם תגי ניאון לתייגתאים נגועים באופן ויראלי מספקים דרך לדווח perdurance של אות ומספר התאים להביע מבנינו בשתלים בוגרים. אנו משתמשים GFP מונע על ידי אמרגן CMV מוקטור lentiviral pSicoR-CMV-GFP 10 בשילוב עם SMO shRNA. באיור 3, אנו מראים שתל ישן 3-שבוע עור ספציפי שבו GFP-הביע lentivirally בפטמית עור של זקיק שערה יציגה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> איור 1. ניתוח היסטולוגית של צמיחת זקיקי שיער. () צפה בשתל התחדשות שיער שליטה עם תאי עור נגוע בוקטור lentiviral ריק והקרטינוציטים שלא טופלו. (ב) מציאה תתפוגג באמצעות shRNA lentiviral בתאי עור בשילוב עם תוצאות הקרטינוציטים לא טופלו בהפסד של זקיקי שיער. (ג) Hematoxylin ומכתים eosin מראים f שיער anagen<html> ollicles בשתלי בקרה להאריך לתוך הדרמיס ו( ד &#39;) זקיקי שיער מציאה יתפוגגו יישארו ננסיים וברובו נעדר. כל התמונות הן שלושה שבועות לאחר ההשתלה. סרגל קנה מידה מציין 100 מיקרומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> איור 2. השתלת תאים ראשוניים. () עכבר נו / נו עם תאים תפר קאמריים דיור עיקריים עור והקרטינוציטים. (ב &#39;) להסרה של תאי עור שנוצרה חושפת הוא עמום ומעורפל בדמות חדשה. (C) שערות גדלו באופן מלא על שתל באמצעות פרועות הקלד תאים ראשוניים עור והקרטינוציטים בשלושה שבועות לאחר ההשתלה. (ד &#39;) תוספת של תאי עור ראשוניים ללא הקרטינוציטים מובילה לשום שיער לאחר שלושה שבועות. תוצאות דומות נצפו עם תוספת של הקרטינוציטים ראשוניים ללא תאי עור. עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig3.jpg" /> איור 3. תחזוקה של ביטוי של GFP בגבשושיות עור. תמונות confocal של גבשושיות עור משתל 3-בן שבוע מחדש. GFP לידי ביטוי באוכלוסיית תאי העור מוקטור lentiviral וזוהה בפטמית עורי (ירוק). Versican (אדום) תוחם את הגבשושיות וגרעיני עורי היו תווית עם Hoechst (כחול). GFP ההערה מתבטא במיוחד בתאי עור, אך לא בקרטינוציטים שמסביב. סרגל קנה מידה מציין 20 מיקרומטר.

ניתוח רקמות ספציפית של מודל התחדשות זקיקי שיער באמצעות lentivirus לתווך רווח או פסד--of-פונקציה.

מורפוגנזה של זקיקי שיער, תהליך מורכב הדורש אינטראקציה בין קרטינוציטים שמקורם באפיתל לבין המזנכימה שמתחת להם, היא...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את התפקודים הספציפיים לרקמה של מסלולי איתות הקריטיים להיווצרות זקיקי שיער. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד תאי עור ראשוניים מהדרמיס ומהאפידרמיס של עכברים רכים. לאחר מכן, הביטוי הגני משונה על ידי הדבקת התאים הראשוניים בלנטי-וירוס.השלב השלישי הוא שילוב אוכלוסיות התאים האפידרמליים והדרמליים לתוך תאים המקובעים למיטת פצע בעכבר עירום. לאחר מכן, השת transplanted ינוטר לבדיקת צמיחת שיער. בסופו של דבר, ניתן להעריך חזותית ובאמצעות צביעה היסטולוגית של אתר השתלה את השפעת המניפולציה הגנטית על היווצרות זקיקי השיער.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מודל נזאלי בעכברים, הוא שניתן להשלים את השתלת הרקמה תוך שלושה שבועות. שיטה זו יכולה לספק מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון האופן שבו גורמים ברקמה אחת יכולים להשפיע על האיתות והתפקוד ברקמה אחרת. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ביקשנו לבחון תפקודי רקמה ספציפיים של מולקולות Ceiling בהיווצרות זקיקי שיער, לאחר שטיפת עכבר שהורג על ידי חנק.גזרו כל גפה וכן את הזנב בבסיס הגוף באמצעות מספריים סטריליים. לאחר מכן, אחזו את הגוף בחוזקה בעזרת פינצטה מעוקלת ובצעו חתך לאורך העור הגבי, מהראש ועד הזנב, באמצעות סכין מנתחים. אין לחדור את הפסציה שמתחת לעור.כעת, קלפו בזהירות את העור מקו האמצע של העכבר. אחזו בחוזקה בעכבר החשוף בעזרת הצד הארוך של הפינצטה העקשושית, והכניסו זוג פינצטות עקשושיות נוסף מתחת לעור בקצה האחורי של העכבר. כעת קלפו בזהירות את העור לחלוטין מהעכבר בתנועה חלקה אחת והשליכו את הגופה.הניחו את העור בכלי הראשון של תמיסת השטיפה, כאשר צד הדרמיס פונה כלפי מטה. פרסו את העור בתוך התמיסה וערבבו אותו בעזרת הפינצטה. לאחר מכן, השאירו את העור בתמיסת השטיפה בזמן ביצוע הדיסקציה של העור הבא.לאחר הנחת העור המנותח הבא בצלחת הראשונה של תמיסת השטיפה, העבירו את העור הקודם לצלחת השנייה של תמיסת השטיפה. השאירו את העורות בתמיסת השטיפה השנייה עד לאיסוף כל העורות. לאחר השטיפה הסופית, העבירו עד חמישה עורות לצלחת המכילה תמיסת disbe קרה.שטחו את העורות כאשר צד הדרמיס פונה כלפי מטה והניחו להם לצוף במשך שמונה עד 16 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. העבירו עור אחד מכלי הקירור לכלי חדש. שטחו אותו כאשר צד הדרמיס פונה כלפי מטה.תפסו את האפידרמיס באמצעות פינצטה וקלפו אותו באיטיות מהדרמיס. האפידרמיס אמור להיקלף כיחידה אחת, הוא יהיה לבן ודק, והדרמיס אמור להיות חום, עבה יותר ובעל מרקם ג'לטיני. ייחסו את שני הרקמות לכלי תרבית נפרדים כדי להתחיל בבידוד התאים.כדי לבודד תאי עור (dermal cells), קצצו את הדרמיס לחתיכות קטנות מאוד, באמצעות שני סקלפלים. הדגרירו את רקמת הדרמיס הקצוצה עם תמיסת קולגנאז טרייה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה; בכל 10 דקות, ערבבו בעדינות את תערובת התאים. כאשר העיכול הושלם.הסספנזיה צריכה להיות מורכבת בעיקר מתאים בודדים, והתמיסה צריכה להפוך משקיפה לעכורה. כעת, יש להוסיף נפח של 10% של FBS לסספנזיית התאים. העבירו אותם דרך מסננת תאים של 70 מיקרון למבחנות של 50 מיליליטר.אספו עד 30 מיליליטר של נוזל זרימה (flow through) לכל מבחנה. המשיכו בבידוד תאי עור בהתאם לפרוטוקול הכתוב. כדי לבודד את הקרטינוציטים, חתכו כל שכבת אפידרמיס לשש עד שמונה חתיכות קטנות יותר.דגרו את הרקמה הפרוסה עם 0.05%tripsin EDTA שהופשר רגע לפני השימוש ב-37 °C למשך 15 דקות. המשיכו בבידוד הקרטנוציטים בהתאם לפרוטוקול הכתוב; הרדימו עכברה נקייה (nude mouse) נקבה בת 7 עד 12 שבועות באמצעות קטמין וקסילזין או בשיטה מועדפת אחרת. הקפידו למרוח חומר סיכוך לעיניים ולהניח את העכברה על משטח חימום.כעת חטאו את העור בגב באמצעות יוד, ולאחריו תחליט אלכוהול. בעזרת פינצטה, צבטו את העור בבסיס הצוואר וגזרו חור בקוטר של 1 cm בעור הצבוט. הניחו את התא על מצע הפצע וכסו את קצוות התא בעזרת העור שסביבו.קבעו את התא באמצעות כשישה תפרים לאורך קשריו בלבד; חברו תא אחד בלבד לכל עכבר. לאחר קיבוע התא, בדקו את תרחף התאים. אם הוא שקע בתחתית, השביחו אותו בעדינות באמצעות טיפ פפיתה של 1 mL.כעת סובבו בעדינות את תרחיף התאים ושאבו אותו לתוך מחט במידה 23 המחוברת למזרק של one milliliter. דקרו כל תא בעזרת המחט וטפטפו באיטיות את התאים התלויים ב-PBS על הפצע. כאשר העכברים יתעוררו מההרדמה, העבירו אותם לכלובים נקיים שעברו אוטוקלב, כאשר שני עכברים בכל כלוב.ודאו כי האנטיביוטיקה וה-Tylenol ניתנים דרך מי השתייה. לאחר שבעה עד תשעה ימים, הרדימו את העכבר ה-nude המטופל כפי שבוצע בעבר. חטאו את העור סביב התא באמצעות יוד ונקו אותו עם swabs של אלכוהול.גזרו בזהירות את התפרים והוציאו אותם מהתא. הסירו בעדינות את התא אם העור החדש נצמד אליו. הפרידו בעדינות את הש Transplant מהתא.החזיקו את הש Transplant למטה באמצעות פינצטה. במהלך הסרת התא, הש Transplant צריך להיראות עמום ולא שקוף. הניחו פד לא דביק עם שכבה דקה של אנטיביוטיקה על הפצע הפתוח ותפרו אותו למקומו באמצעות שתי תפרים.יש להקיף את העכבר בתחבושת כדי לקבע את הרפידה ולהגן על הפצע. תפרו את התחבושת למקומה. לאחר שלושה ימים, הסירו את התחבושות ואת הרפידה. אין צורך להרדימ את העכבר במהלך שלב זה.השתל צריך להיות יבש ובצבע עכור עד חום. יש לבדוק את השתל מעת לעת כדי לאתר צמיחת שיער, שאמורה להתחיל להופיע 16 ימים לאחר השתלת השתל. ביצוע knockdown ספציפי לעור של הגן smoothened, המהווה רכיב סיגנלי קריטי של sonic hedgehog, בוצע בתאי עור מבודדים.תאים אלה הועברו להשתמיות של שחזור שיער באמצעות הפרוטוקול המתואר. לאחר שלושה שבועות של צמיחה, השתמיות של ביקורת חיובית עם וקטור לנטי-ויראלי בלבד הראו צמיחת שיער חסונה. עם זאת, השתקה של הגן smoothened גרמה להפחתה חמורה בצמיחת השיער.השתלות של ביקורות שליליות, שבהן הושמטו תאי עור ראשוניים או קרטינוציטים, הביאו להתאוששות של אתר הפצע ללא צמיחת שיער. באופן דומה, מוות של תאים או אובדן תאים של אחד מסוגי התאים בהשתלה הובילו גם הם להיעדר צמיחת שיער. נמצא כי לווקטור הלנטיבי יש יעילות הדבקה טובה לפני ניסוי ההשתלה, והוא תוכנן להפיק GFP יחד עם Smoothened, S-H-R-N-A זה.לפיכך, בחינת הפפילה הדרמלית (dermal papilla) של זקיקי שיער תחת אופטיקה פלואורסצנטית שימשה כביקורת יעילה לאישור השרידות של ביטוי לנטיבירי. לאחר שלושה שבועות, נעשה שימוש בצביעת H&E כדי לתאר את שלב הצמיחה של זקיקי השיער בשתל הביקורת ואת שלב ההתפתחות המעוכב שלהם כאשר ביטוי ה-smoothened הושתק. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 14 שעות לאורך שלושה ימים, במידה ותבוצע כראוי. ניתן להרחיב טכניקה זו לחקר הקשר בין הגידול לסטרומה במהלך התקדמות הסרטן בתחום הביולוגיה של הסרטן.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחקור את תפקוד הגנים בהיווצרות זקיקי שיער. השתמשו במבחן השחזור המהיר של השערה שלנו כחלופה לביטול גנים (knockouts) גנטי מסורתי.

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר השתלת רקמות טכניקה שנועדה לבדוק את איתות ותכונות של דפוסים האאקטודרם משטח cephalic במהלך הפיתוח craniofacial.

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

שיטה פשוטה מתוארת לאינדוקציה של אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) במגוון רחב של סוגי תאים. שיטות לניתוח של תאים במדינות EMT ידי immunocytochemistry כלולים.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

עור של יונקים מכיל מערך מגוון של מבנים - כמו זקיקי שיער וקצות עצבים - שמפגינים דפוסים ייחודיים של ארגון המרחבי. ניתוח עור כמו הר שטוח מנצל את הגיאומטריה 2 ממדית של רקמה זו להפקת תמונות ברזולוציה גבוהה בעובי מלא של מבני עור.

הר הדמיה שטוחה של עור העכבר ויישומו לניתוח של שיער זקיק דפוסים וחושי אקסון מורפולוגיה

כתב יד זה מספק נוהל שלב אחר שלב לגזירה ותחזוקה של קרטינוציטים אנושיים משיער מרוט ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ללא אינטגרציה (hiPSCs) על ידי וקטורים אפיזומליים.

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

מודל אידיאלי לחקר ביולוגיה של תאי גזע בוגרים הוא זקיק שיער העכבר. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אוכלוסיות שונות של זקיקי שיער, תאי גזע וקרטינוציטים אפידרמיסיים, תוך שימוש בעיכול אנזימטי של עור הגב של העכבר ואחריו ניתוח FACS.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

דו"ח זה מתאר פרוטוקול מעוקב להבהיר ביופסיות עור עכבר בעובי מלאות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון, תאים מתרבים, ו sebocytes ברזולוצית התא הבודדה ב 3D. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של האנטומיה העור והפתולוגיה, ושל פנוטיפים אפידרמיס החריגים קווי עכבר מהונדסים גנטי.

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

אנו מציגים כאן שיטה תרבית תאים עבור גרימת מעברים-אפיתל mesenchymal (MET) בתאים סרקומה מבוסס על ביטוי אקטופי בשילוב של בני המשפחה microRNA-200 ו grainyhead דמוי 2 (GRHL2). שיטה זו מתאימה יותר להבנת ההשפעה הביולוגית של גמישות פנוטיפית על תוקפנות הסרטן וטיפולים.

אינדוקציה של מעברי אפיתל- mesenchymal בתאי סרקומה

אנו מתארים זרימת עבודה שיטתית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי β TGF על ידי לימוד ביטוי החלבון והגנים המעורבים במסלול איתות זה. השיטות כוללות סופג מערבי, בדיקת כתב לוציפראז, qPCR, וכתמי כשל חיסוני.

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיפוח שיטתי של כדורי אפידרמיס בתרבות השעיה תלת-ממדית. פרוטוקול זה כולל יישומים נרחבים לשימוש במגוון סוגי רקמות אפיתל ולדוגמנות של מספר מחלות ותנאים אנושיים.

הקמת מערכת תרבית אפידרמיס כדורית בעלת תפוקה גבוהה למודל פלסטיות תאי גזע קרטינוציטים

זקיק השיניים מכיל אוכלוסייה אפיתל ותאים mesenchymal. אוכלוסיית האפיתל נבחרה מתוך אוכלוסיית תאי הזקיק הדנטליים ההטרוגניים על ידי מתן מדיום תרבותי מובהק. תאי אפיתל שרדו ויצרו מושבות במדיום נטול סרום.

בידוד תאי אפיתל מזקיקי השיניים האנושיים

חקור את תפקידי האיתות האפיתל-מזנכימליים בהתחדשות זקיקי השיער באמצעות שיטת השתלה מהירה בעכברים. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה של פונקציית גנים בתהליכי התפתחות ביולוגיים.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

גלה סרטונים נוספים