מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר תאים שעברו החלפת תמונות בעובר דג זברה חי. זה מושג על ידי הטמעת עובר תחילה, המבטא תמונה ספציפית לרקמה, חלבון פלואורסצנטי הניתן להמרה בטמפרטורת התכה נמוכה. לאחר מכן, החלבון באזור העניין מומר לחלוטין לתמונות.

לאחר מכן מוציאים את העובר בזהירות מהעובר ונשמרים במי ביצים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד לשלבים מאוחרים יותר. לבסוף, העובר שהומר בתמונה מוטבע שוב בארוס בטמפרטורת התכה נמוכה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות כי ניתן לזהות במדויק תאים שהומרו בפוטו בשלבים מאוחרים יותר בשל הנוכחות היציבה של החלבון שהומר בפוטו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

לכן אנו חושבים שהשיטה שנציג היום תהיה שימושית למדי בהקשר של ביולוגיה תאית והתפתחותית. לכן אנו חושבים ששימוש במתודולוגיה זו בהקשר של נדידת תאים, דינמיקת רקמות והתנהגויות תאיות אחרות יהיה שימושי למדי. תדגים את ההליך ורוניקה לומברדו, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי לאחר הכלאה של דג זברה טרנסגני, המבטא חלבון פלואורסצנטי הניתן להמרה פוטו.

בחר את העוברים הבהירים ביותר שהם הומוזיגוטיים וגדל אותם ב-28.5 מעלות צלזיוס כאשר הם מגיעים לשלב הרצוי. השתמש במלקחיים כדי לכסות אותם במיכל זכוכית עם מי ביצים כדי להרדים את העוברים. השתמש בפיפטה מזכוכית או בקצה פיפטה חתוך כדי להעביר אותם בזה אחר זה לתוך טריקה.

העבירו עובר מורדם על כיסוי צלחת תרבית ושמרו על העובר בנפח המדיום הקטן ביותר האפשרי. העבירו את העובר לארוס על ידי פיפטינג עם אגרוס בטמפרטורת התכה נמוכה של 1% עם טריקה ב-30 מעלות צלזיוס, והניחו אותו בכלי תרבית עם תחתית זכוכית מכסה. השתמש בקצה פלסטיק חלק כדי לכוון את העובר כאשר האגרוס התפלמר.

כסו אותו בתמיסת Trica על מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך המצויד במקורות לייזר 405, 488 ו-561 ננומטר ומטרה של פי 20. השתמש בלייזרים של 488 ו-561 ננומטר כדי ליצור ערימת Z של כל מבנה הדגימה, הכולל את אזור העניין. בחר את כלי סדרת הזמן והגדר לשני מחזורים ללא מרווח, אחד לקדם ואחד להמרת תמונות לאחר מכן.

בחר את הכלי של האזור והגדר אזור עניין אחד או יותר להמרת תמונות. לאחר מכן, בחר את כלי ההלבנה והגדר להתחלת הלבנה לאחר הסריקה. אחד משני המשמשים כאן הוא לייזר דיודה של 30 מיליוואט 405 ננומטר.

מותאם בקפידה לכמות המינימלית של אור הלייזר הדרושה להמרת תמונות מלאה, המושגת על ידי שינוי עוצמת אור הלייזר, איטרציות הסריקה של אזור העניין ומהירות הסריקה. סרוק את הדגימה עם הלייזרים של 488 ננומטר ו-561 ננומטר כדי לדמיין את כל הירוק שנותר ואת הקרינה האדומה המומרת של החלבון הפלואורסצנטי הניתן להמרה בתמונה. לאחר המרת התמונות, השליכו את התמיסה ובעזרת מחט או קצה פלסטיק חלק הסירו בזהירות את העובר מהאגרוס.

שמור את העובר במי ביצים בחושך בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד לשלב ההתפתחותי הרצוי. הטמיעו את העובר בפעם השנייה, ואז צרו זאק של הדגימה, כולל אזור העניין, שוב באמצעות הלייזרים 488 ו-561 ננומטר. מכיוון שפרוטוקול זה אינו משפיע על התפתחות תקינה, ניתן לצפות בעובר שהומר בתמונה בשלבים מאוחרים יותר.

הנה דוגמה לבדיקת המרת תמונות. תאי אנדותל היו במעקב במהלך התפתחות דג הזברה בין 48 ל-72 שעות לאחר ההפריה באמצעות קו דיווח טרנסגני המבטא בעיטה G בתוך גרעיני האנדותל כפי שמוצג כאן לפני בעיטת המרת הצילום G באה לידי ביטוי ברקמת האנדותל וניתן היה לזהות אותה רק כפלואורסצנטיות ירוקה באמצעות סריקות בקרת לייזר ארגון 488 ננומטר עם לייזר 561 ננומטר לפלואורסצנטיות אדומה. לא זיהה שום תמונה שהומרה בעיטה GR לפני המרת התמונה.

לאחר מכן, אזור העניין הומר לחלוטין באמצעות לייזר דיודה של 405 ננומטר בעוצמה של 10%, 20 איטרציות וכלי הראש נסרקו שוב באמצעות לייזרים של 488 ננומטר ו-561 ננומטר. בפאנל זה, בעיטה ירוקה G עברה לחלוטין לאדום באזור העניין כדי לעקוב אחר תאי האנדותל שהומרו בתמונות בשלבים מאוחרים יותר. העובר נצפה 24 שעות לאחר המרת התמונה, כלומר כ-72 שעות לאחר ההפריה בתוך רקמות אנדותל הנובעות מאזור העניין של המרת התמונה.

גם חלבוני בעיטה G שאינם מומרים וגם לא מומרים בתמונה נצפו בשל יציבות הבעיטה G שהומרה בתמונה פלואורסצנטית אדומה, וסינתזה של בעיטה G ירוקה חדשה שלא הומרו לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לחקור ביולוגיה של התא ועיצוב מחדש של רקמות במספר דגים.