Name: מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: למדו מעקב תאים חיים באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים ניתנים להמרת צבע בדג זברה. שיטה זו מאפשרת ניטור אירועים תאיים במהלך התפתחות העובר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר Ian C. Scott על אספקת קו דגי הזברה הטרנסגני Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 בבית החולים לילדים חולים (Hospital for Sick Children) בטורונטו, קנדה. אנו מודים למרכז המיקרוסקופיה הקונפוקלית ודו-פוטונית (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine) ولد"ר Zoltan Cseresnyes, על סיוע טכני מצוין ותמיכה כללית בדימיון. S.A.-S. נתמכת על ידי מלגת Heisenberg של ה-Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). עבודה זו נתמכה על ידי מענק DFG מספר SE2016/7-1.

<ol><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-rational+engineering+of+a+coral+fluorescent+protein+into+an+efficient+highlighter%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter.</a> EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).</li>
<li>Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li>
<li>Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+invasion+is+a+spatially-ordered+progression+into+the+head+with+higher+cell+proliferation+at+the+migratory+front+as+revealed+by+the+photoactivatable+protein%2C+KikGR%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR.</a> Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).</li>
<li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).</li>
<li>Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+iUBC-KikGR+photoconvertible+transgenic+mice+for+live+time-lapse+imaging+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development.</a> Genesis. 49, 591-598 (2011).</li>
<li>Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green-to-red+photoconvertible+fluorescent+proteins%3A+tracking+cell+and+protein+dynamics+on+standard+wide-field+mercury+arc-based+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes.</a> BMC Cell Biol. 11, 15(2010).</li>
<li>Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3, e3944(2008).</li>
<li>Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-associated+protein%2C+supervillin%2C+accelerates+F-actin-dependent+rapid+integrin+recycling+and+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility.</a> Traffic. 11, 782-799 (2010).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish%3A+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).</li>
<li>Lazic, S., Scott, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mef2cb+regulates+late+myocardial+cell+addition+from+a+second+heart+field-like+population+of+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish.</a> Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of zebrafish development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).</li>
<li>Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Foxd3+and+Mitf+regulates+cell+fate+plasticity+in+the+zebrafish+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest.</a> Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).</li>
<li>Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconvertible+fluorescent+protein+EosFP%3A+biophysical+properties+and+cell+biology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications.</a> Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
</ol>

לא הצהירו על ניגודי עניינים.

בשנים האחרונות פותחו מודלים של בעלי חיים טרנסגניים לביטוי של חלבונים בעלי יכולת המרה פוטו-כימית (photoconvertible proteins) כגון Kaede או KikGR. בעלי חיים אלה מתפתחים באופן תקין, מה שמעיד כי לחלבונים אלו אין השפעות רעילות על ההתפתחות העוברית. הדיווח הראשון על בדיקת המרה פוטו-כימית למעקב אחר תאים בעוברים של בעלי חיים בוצע על ידי Hatta ועמיתיו, באמצעות הזרקת mRNA או DNA המקודדים ל-Kaede לעוברי דגי זהב בשלב התא הבודד לצורך ביטוי רחב (ubiquitous expression), או באמצעות ביטוי של Kaede ו-KikGR ברקמה עצבית באמצעות מערכת Gal4-UA...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;חומרים:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">ציוד נחוץ לגידול דגים ואיסוף ביצים (ראו את ה-Zebrafish Book22 לפרטים).</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>Lecia MZ6 Stereomicroscope</td><td>מצויד בלייזר הפועל ב-488 nm</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td>מצויד בלייזרים הפועלים ב-488 nm, 561 nm, ו-405 nm</td></tr><tr><td>בלוק חימום</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זוג פינצטות Dumont #5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית בעלת תחתית של זכוכית כיסוי</td><td>MatTek Corp</td><td></td><td>Ashland MA USA</td></tr><tr><td>טיפים לפיפט Microloader</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ורטקס</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;ריאגנטים:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;תווך מי ביצים&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>60 &amp;mu;g/ml מלחים של Instant Ocean ב-ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;תווך E3 &lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>5 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.17 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.00001% (w/v) Methylene Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;תמיסת מלאי Tricaine בריכוז 4 mg/ml &lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>400 mg Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>97.9 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.1 ml 1M Tris (pH9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כוון ל-pH 7, חלק לאליקוטות ושמור ב- -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;1% LMA (אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה, Lonza)&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>1g LMA/100 ml תווך E3 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חלק לאליקוטות ושמור ב- 4 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מעקב נייד באמצעות חלבוני photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

העתק embryogenesis הוא תהליך דינמי שניתן לחקורו בצורה הטובה ביותר באמצעות טכניקות המאפשרות תיעוד של שינויים התפתחותיים in vivo. השימוש בחלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית התגלה כאסטרטגיה בעלת ערך להבהרה של תהליכים מורפוגנטיים דינמיים בעודם מתרחשים באורגניזם שלם. במהלך העשור האחרון, פיתוחם של חלבונים פלואורסצנטיים המופעלים על ידי אור (photoactivatable) וניתנים להמרה פוטוכימית (photoconvertible) פתח את האפשרות לחקור את גורלן של תתי-אוכלוסיות מובחנות של חלבונים מסומנים1. בניגוד לחלבונים המופעלים על ידי אור, חלבונים פלואורסצנטיים ניתנים להמרה פוטוכימית (PCFPs) ניתנים למעקב ולדימות בקלות במצב הפליטה הטבעי שלהם לפני ההמרה הפוטוכימית, מה שמקל על זיהוי ובחירת אזורים באמצעות בדיקה אופטית. PCFPs, כגון Kaede2, KikGR3, Dendra4 ו-EosFP5, יכולים להשתנות מירוק לגוון אדום בעקבות חשיפה לאור UV או לאור כחול, וזאת בשל רצף טריפפטיד His-Tyr-Gly היוצר כרומופור ירוק שניתן להמיר באופן פוטוכימי לכרומופור אדום על ידי β-elimination המזורז על ידי אור והרחבה עוקבת של מערכת π-conjugated3. PCFPs והוריאנטים מונומריים שלהם הם כלים שימושיים למעקב אחר תאים6-10 וללימוד דינמיקה של חלבונים11-14, בהתאמה. בשנים האחרונות, PCFPs בוטאו במודלים שונים של בעלי חיים, כגון דג זברה (zebrafish)6, תרנגולת7,8 ועכבר9,10, לצורך מעקב אחר גורל תאים. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול להמרה פוטוכימית ספציפית לתאים של PCFPs בעובר דג זברה חי, ומעקב המשך אחר חלבונים שעברו המרה בשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר. מתודולוגיה זו מאפשרת לחקור, באופן ספציפי לרקמה, אירועים ביולוגיים של תאים העומדים בבסיס המורפוגנזה במודל בעל החיים של דג הזברה.

כאן אנו מציגים שיטה להפעלה פוטו-אקטיבית של חלבוני פלואורסצנציה הניתנים להמרה פוטו-כימית (PCFPs) בעובר דג זבוב חי, ומעקב המשך אחר החלבון שהומר בנקודות זמן ספציפיות במהלך ההתפתחות. מתודולוגיה זו מאפשרת ניטור של אירועים ביולוגיים תאיים העומדים בבסיס תהליכי התפתחות שונים באורגניזם חולייר חי.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

אמבריוגנזה היא תהליך דינמי שניתן לחקורו בצורה הטובה ביותר באמצעות טכניקות המאפשרות תיעוד של שינויים התפתחותיים in vivo. השימוש ב...

המטרה הכללית של הליך זה היא למעקב אחר תאים שעברו המרה פוטו-כימית בעובר דג זברה חי. הדבר מושג תחילה על ידי הטמעה של עובר, המבטא חלבון פלורסצנטי פוטו-המירי ספציפי לרקמה, באגרוז בעל טמפרטורת התכה נמוכה. לאחר מכן, החלבון בתוך אזור העניין עובר המרה פוטו-כימית מלאה.לאחר מכן מוציאים בזהירות אתו העובר מה-aros ושומרים אותו במי ביצים בטמפרטורה של 28.5 °C עד לשלבים מאוחרים יותר. לבסוף, העובר שעבר המרה פוטו-כימית מוטמע שוב ב-aros בעל טמפרטורת התכה נמוכה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי ניתן לזהות במדויק תאים שעברו המרה פוטו-כימית בשלבים מאוחרים יותר, הודות לנוכחות היציבה של החלבון שהומר פוטו-כימית, באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.אנו סבורים כי השיטה שנציג היום תהיה יעילה מאוד בהקשר של ביולוגיה של התא וביולוגיה התפתחותית. לכן, אנו מאמינים ששימוש במתודולוגיה זו בהקשר של נדידת תאים, דינמיקה של רקמות והתנהגויות תאיות אחרות יהיה מועיל מאוד. את הפרוצדורה תדגים ורוניקה לומבארדו, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי, לאחר הכלאה של דגי זברה טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בעל יכולת המרה פוטו-כימית.יש לבחור את העוברים הזוהרים ביותר שהם הומוזיגוטים ולגדל אותם בטמפרטורה של 28.5 °C עד שיגיעו לשלב הרצוי. השתמשו בפינצטה כדי להסיר מהם את מעטפת הביצה (dec oate) בתוך כלי זכוכית עם מי ביצים להרדמת העוברים. השתמשו בפיפטת זכוכית או בקצה פיפטה חתוך כדי להעביר אותם אחד אחד לתוך trica.העבירו עובר שהורדם אל מכסה של צלח תרבית ושמרו את העובר בתוך הנפח הקטן ביותר האפשרי של מדיום. העבירו את העובר לתוך agros על ידי פיפטינג עם 1% low melting temperature agros עם trica בטמפרטורה של 30 °C, והניחו אותו בתוך צלח תרבית בעל תחתית של זכוכית כיסוי. השתמשו בטיפ פלסטיק חלק כדי לכוון את העובר לאחר שה-agros התמצמץ (polymerized).כסו זאת בתמיסת Trica תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך המצויד במקור לייזר של 405, 488 ו-561 ננומטר ובעדשה אובייקטיבית של 20x. השתמשו בלייזרים של 488 ו-561 ננומטר כדי להפיק Z stack של כל מבנה הדגימה, כולל אזור העניין. בחרו בכלי סדרת הזמנים והגדירו שני מחזורים ללא מרווח, אחד לפני ואחד אחרי המרת הפוטו.בחר את כלי האזור והגדר אזור עניין אחד או יותר להמרה פוטוغرافית. לאחר מכן, בחר את כלי ההלבנה (bleaching) והגדר תחילת הלבנה לאחר סריקה. אחד משני הלייזרים המשמשים כאן הוא לייזר דיודה של 30 milliwatt באורך גל של 405 nanometer.בצעו אופטימיזציה קפדנית כדי להשתמש בכמות המינימלית של אור לייזר הדרושה להמרה פוטוכימית מלאה, זאת על ידי שינוי עוצמת אור הלייזר, מספר חזרות הסריקה של אזור העניין ומהירות הסריקה. סרקו את הדגימה באמצעות לייזרים של 488 ננומטר ו-561 ננומטר כדי להמחיש את שאריות הפלואורסצנציה הירוקה ואת הפלואורסצנציה האדומה שהומרה פוטוכימית של החלבון הפלואורסצנטי הניתן להמרה. לאחר ההמרה הפוטוכימית, השליכו את התמיסה ובעזרת מחט או קצה פלסטיק חלק הוציאו בזהירות את העובר מהאגרוס.שמר את העובר במי ביצים בחושך בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius עד לשלב ההתפתחות הרצוי. טמיע את העובר פעם שנייה, ולאחר מכן צור Zack של הדגימה, כולל את אזור העניין, שוב באמצעות לייזרים של 488 ו-561 nanometer. מכיוון שפרוטוקול זה אינו משפיע על ההתפתחות הנורמלית, ניתן להבחין בעובר שעבר פוטו-המרה בשלבים מאוחרים יותר.להלן דוגמה לבדיקת המרה פוטוכימית. תאי אנדותל נמעמדו במהלך התפתחות דגי זבוב מ-48 עד 72 שעות לאחר ההפריה, באמצעות קו דגי דגם טרנסגני המבטא kick G בתוך גרעיני האנדותל, כפי שמוצג כאן. לפני ההמרה הפוטוכימית, kick G בוטה ברקמה האנדותליאלית וניתן היה לזהותה רק כפלואורסצנציה ירוקה באמצעות לייזר ארגון של 488 ננומטר. סריקות בקרה עם לייזר של 561 ננומטר לפלואורסצנציה אדומה לא זיהו kick GR שהומר פוטוכימית לפני ביצוע ההמרה.לאחר מכן, האזור המבוקש עבר המרה פוטוכימית מלאה באמצעות לייזר דיודה בנצילות של 405 nanometer בעוצמה של 10%, למשך 20 חזרות, וכלי הדם בראש נסרקו שוב באמצעות לייזרים בנצילות של 488 nanometer ו-561 nanometer. בלוח זה, ה-green kick G עבר כולו לצבע אדום בתוך האזור המבוקש, כדי לעקוב אחר התאים האנדותליאליים שעברו המרה פוטוכימית בשלבים מאוחרים יותר. העובר נצפה 24 שעות לאחר ההמרה הפוטוכימית, שהן כ-72 שעות לאחר ההפריה, בתוך רקמות אנדותליאליות שמקורן באזור המבוקש שעבר המרה פוטוכימית.נצפו both חלבוני kick G שאינם מומרים ואלו שהומרו באופן פוטו-כימי, וזאת בשל היציבות של kick G המומר פוטו-כימית שפולט פלואורסצנציה אדומה, ובשל סינתזה של kick G ירוק חדש שאינו מומר לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה ההתפתחותית לחקור ביולוגיה של התא ושחזור רקמות במספר מיני דגים.

cell-tracking-using-photoconvertible-proteins-during-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת שליטה של ​​פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה עם חדירה עמוקה אופטי phototoxicity מופחת. אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו עבור תיוג תא חי עוברי דג הזברה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לזירוז, תמונה של אור תגובה מולקולות שונות.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

סרטון זה מדגים מעקב אחר גיוס לויקוציטים באמצעות זחלי דגי זברה טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק הניתן להמרה פוטו-מיטבית. הזרקה מראש של חיידקים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי אדום לתוך שלפוחית העין וגרימת המרת אור מאפשרת תצפית על נדידת לויקוציטים, פגוציטוזה ופיזורם בכל הגוף, ומספקת תובנות חשובות לגבי דינמיקת התגובה החיסונית.

מעקב לויקוציטים מבוסס פוטו-המרה בדגי זברה טרנסגניים נגועים בחיידקים

רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo.

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

הקמנו את מערכת ה-PSmOrange הניתנת להמרה ככלי רב עוצמה, ישר קדימה וזול למעקב אחר תאים in vivo ברקעים טרנסגניים של GFP. פרוטוקול זה מתאר את יישומו במערכת המודל של דג הזברה.

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה רב-תכליתית המאפשרת הדמיה ארוכת טווח של התפתחות הגוף האחורי של עוברי דג זברה חיים מבלי להפריע להתפתחות תקינה.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

פרוטוקול זה מתאר שיטה photoconversion של חלבון פלואורסצנטי קאךה בתאים endocardial של החיים העובר דג זברה המאפשרת המעקב של תאים endocardial במהלך תעלת atrioventricular ופיתוח שסתום הלב atrioventricular .

הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

למדו מעקב תאים חיים באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים ניתנים להמרת צבע בדג זברה. שיטה זו מאפשרת ניטור אירועים תאיים במהלך התפתחות העובר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

גלה סרטונים נוספים