Name: מחיקות Gene הגנום ב סטרפטוקוקוס sanguinis על ידי תפוקה הגבוהה PCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: למדו שיטה יעילה למחיקות גנים בגנום Streptococcus sanguinis באמצעות PCR בתפוקה גבוהה. הטכניקה מאפשרת מחקר מהיר של פונקציות גנים בחיידקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי R01DE018138 מהמכונים הלאומיים לבריאות (PX), ובחלקו, על ידי תכנית אוניברסיטת וירג&#39;יניה הנשיאותית מחקר תמריץ (PRIP) 144602-3 (PX). אנו מודים לבני זוג. ליי חן, Yuetan Dou וXiaojing ואנג לסיוע בבנייה של מוטציות רחבות הגנום. אנו מודים גם למתקן ליבת ה-DNA באוניברסיטת וירג&#39;יניה לרצפי DNA.

1. עיצוב פריימר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Primers תוכנן באמצעות תסריטים בבית המבוסס על ס רצף הגנום sanguinis SK36. שלושה זוגות של פריימרים, F1/R1, F2/R2, וF3/R3 מיועדים להגברה של רצף 1-kb במעלה הזרם של גן המטרה, התנגדות APHA-3 גן קידוד kanamycin (הק&quot;מ R) החלבון 3 ו 1 -KB רצף במורד זרם של גן המטרה, בהתאמה (איור 1). בין פריימרים אלה, F1 ו R3 תוכננו באמצעות ePrimer3 בסוויטת הבלטה של תוכניות <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">(http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html)</a> כדי להגביר אזורי איגוף מעלה זרם או במורד זרם של היעד גן. פריימרים הגן ספציפיים, R1 וF3, נועדו מבוססים על רצפים של גן היעד 5 &#39;3 ו&#39;. פריימרים R1 וF3 מכילים רצפי מתאם 25-BP בסוף 5 &#39;שלהם שמשלימים לAPHA-3גן. את טמפרטורת ההיתוך של כל צבע יסוד נועדה להיות קרוב ככל האפשר עד 60 ° C כדי לאפשר שימוש במדי חישול טמפרטורה לכל תגובות PCR בפורמט 96-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> F1, R1, F3 ופריימרים R3 מסונתזים בצלחות 96-כן בהתבסס על מנת גנים. כל צלחת מכילה סוג אחד של פריימרים באותו סדר הגן. לדלל את האלפונים ב96-גם צלחת פריימר פועל לריכוז סופי של 10 מיקרומטר להגברת PCR באמצעות פיפטה רבה ערוצים. </li></ol> 2. הגברת תפוקה גבוהה PCR וטיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגביר את התפוקה גבוהה 1-kb מעלה זרם או במורד זרם של היעד ס גני sanguinis, להרכיב תערובת קוקטייל PCR על קרח בצינור חרוטים 15-מ&quot;ל מכיל 1640 DDH 2 O μl, פידליטי 10xHigh μl PCR מאגר 250, 200 μl של תערובת 10 mM dNTP, 100 μl של 50 מ&quot;מ MgSO 4, 100 μl של 10 ng / μl ס הדנ&quot;א הגנומי sanguinis SK36 וμl פלטינום תקי DNA polyme 10rase איכות גבוהה והעברה 23 μl של התערובת לתוך כל באר על 96-גם צלחת PCR באמצעות פיפטה רבה ערוצים. העברת μl 1 מתוך כל F1 וR1 (או F3 ו R3) מתוך 10 מיקרומטר עבודת צלחות פריימר לצלחת PCR באמצעות פיפטה רבה ערוצים. לאטום את צלחת PCR ולבצע הגברה ב 94 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 54 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1% agarose ג&#39;ל המכיל רומיד ethidium עם טעינת 48 בארות הולמת רב ​​פיפטה. מערבבי 4 מוצר PCR μl μl עם 1 של חיץ טעינת 5xDNA בצלחת 96-היטב ולטעון את הדגימות על agarose ג&#39;ל באמצעות פיפטה רב 10-μl. הפעל אלקטרופורזה ב135 V למשך 30 דקות. בדוק את הלהקה בג&#39;ל תחת מערכת ניתוח ותיעוד UVP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצרי ה-PCR על ידי ערכת PureLink 96 PCR טיהור באמצעות צנטריפוגה פי ההוראות של היצרן. למשחררי DNA, להוסיף 40 μl סטרילי DDH 2 O אל באר בinding צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אקראי לקחת כמה amplicons מטוהר על הצלחת לבחון את ריכוזי DNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. התאם את הריכוז של amplicons על צלחת ל~ 10 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת r פלסמיד המכיל ק&quot;מ מתעכלת באמצעות EcoR כתבנית PCR. הפלסמיד מעוכל מטוהר על ידי ערכת טיהור PCR QIAquick וDNA פלסמיד לינארי מותאם לריכוז ה-DNA סופי 10 ng / μl. להרכיב תערובת μl 25 לamplicon קלטת r הק&quot;מ כולל 16.4 DDH 2 O μl, פידליטי 10xHigh μl PCR מאגר 2.5, 2 μl של תערובת 10 mM dNTP, μl 1 מתוך Mg 50 מ&quot;מימ SO 4, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר F2, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר R2, ה-DNA 1 μl יניארי פלסמיד ונאמנות 0.1 μl פלטינום תקי פולימראז ה-DNA גבוהה. בצע הגברת PCR ב 94 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך דקות 1. בדוק את מוצר PCR ידי אלקטרופורזה ג&#39;ל על 1% agarose. פותפזורת של la amplicon הק&quot;מ r הקלטת מ 10 פרט PCR מטוהר על ידי ערכת טיהור PCR QIAquick. התאם את ריכוז amplicon עד 10 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג את amplicon PCR רקומביננטי הסופי ליניארי, שלוש amplicons PCR בשילוב עם כל μl 1 (בכמויות כמעט שווה-טוחן) בצלחת אחת PCR גם תבנית ה-PCR. רכיבי PCR אחרים מתווספים כולל 14.4 DDH 2 O μl, פידליטי 10xHigh μl PCR מאגר 2.5, 2 μl של תערובת 10 mM dNTP, μl 1 מתוך Mg 50 מ&quot;מימ SO 4, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר F1, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר R3, האיכות גבוהה 0.1 μl פלטינום תקי DNA פולימרז. הגברת PCR מתבצעת ב 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך 3.5 דקות, ובסופו 68 המעלות צלזיוס במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחן PCR amplicons על agarose ג&#39;ל. לטהר ולכמת את amplicons PCR כפי שתואר לעיל. הקפא את amplicons PCR מורכב ב -20 ° C. </li></ol> 3. Comהכנת תאים petent <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוד יואיט המרק מוכן, חומציות מותאמת לשימוש 10 7.6 N NaOH, מחומם לרתיחה ולאחר מכן מקוררת לטמפרטורת חדר ועיקור באמצעות קלקר 0.22 מיקרומטר סינון 4. הוסף 300 סוס סרום μl חום מומת (ריכוז סופי של 2.5%) עד 11.7 מ&quot;ל טוד יואיט מרק בצינור חרוטים 15-מ&quot;ל כדי לפצות TH + בינוני HS. TH aliquot + HS הבינונית ל2 מ&quot;ל ו 10 מ&quot;ל בצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 μl של המנייה ס sanguinis SK36 קפוא ב -80 ° C לTH + בינוני 2 מ&quot;ל HS ודגירת תרבות הלילה עם המכסה בחוזקה על 37 מעלות צלזיוס, בליווי דוגר מראש 10 מ&quot;ל-TH + צינור HS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הלילה, להעביר תרבות μl 50 לתוך 10 המ&quot;ל TH + HS ודגירת הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות (מקביל לOD 660 של 0.07-0.08), תוך שימוש באופן מיידי לשינוי. </li></ol> 4. שינוי תא ובחירת אנטיביוטיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של 70 ng ס sanguinis SK36 compeפפטיד tence מגרה (CSP) וμl יניארי רקומביננטי PCR amplicon 2 (~ 50 ng) לאפנדורף צינורות על 96-גם בלוק ומראש החם ב 37 ° C. העברת 330 μl של 3 SK36 תרבות HR-מודגרות לכל צינור. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. החלף DNA עם DDH 2 O סטרילית כשליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הבלוק על קרח והתפשט 100 μl של כל שינוי על צלחת אגרה עירוי לב מוח (BHI) עם 500 מיקרוגרם / המ&quot;ל kanamycin. דגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ד בתנאי microaerobic. </li></ol> 5. אישור ואחסון מוטציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל מוטצית החלפה, באופן אקראי להרים 2 מושבות בודדות, לחסן את המושבה ל5 המ&quot;ל מכיל 500 מיקרוגרם BHI / kanamycin מ&quot;ל ודגירת בידוד microaerobically לילה בשעת 37 ° C. Cryopreserve כל תרבות בגליצרול 30% ב-80 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון האם מכיל את החלפת גן המוטנטי הצפוי, לבצע מושבה PCR לכל F1 באמצעות מוטציה וR3אלפונים ב96-PCR גם צלחת. על תרבות הלילה 1-μl ממושבה בודדה משמשת כתבנית ה-DNA בתגובת 25-μl PCR הגברה. PCR מתבצע ב 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 35 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך 3.5 דקות, ובסופו 68 המעלות צלזיוס במשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות במדויק מוטנטים-band הכפול או amplicon PCR המזהם, לבחון amplicon PCR ידי אלקטרופורזה במשך 4 שעות ב&gt; 12 סנטימטר ארוך 2% agarose ג&#39;ל עם כתמי רומיד ethidium. תחת תנאי אלקטרופורזה ג&#39;ל agarose זה, כל amplicons עם ≥ הבדל 100 נ&quot;ב באופן מובהק. כאשר להקות תוצאה מההגברה של קלטת r הק&quot;מ והגן פראי מהסוג צפויות לשינוי על פי &lt;100 נ&quot;ב, פריימר T1 הפנימי משמש כדי לקבוע האם גן פראי מסוג יכול להיות מזוהה על ידי PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להמשיך ולאשר את המחיקה, את amplicons מטוהר על ידי ערכת טיהור PureLink 96 PCR ורצף באמצעות פריימר P1 בינקשר לקלטת r הק&quot;מ. שמור רק מוטנטים נכונים אושרו על ידי רצף. </li></ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li>
<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

כדי למזער את ההשפעות האפשריות של קוטב החלפת הגן ממוקד אחד עם אנטיביוטיקת גן אקסוגני בגנים סמוכים, שני צעדים נלקחים תוך פריימר הראשוני בעיצוב. עבור רוב הגנים שנמחקו, פריימרים R1 ו F3 נועדו למחוק את אזור קידוד מ6 נ&quot;ב לאחר קודון התחילה ועד 30 נ&quot;ב לפני קודון העצירה. את 30 זוגות הבסיסים האחרונים נשמרים כדי להגן על אתר מחייב ריבוזומלי פוטנציאל בשימוש על ידי גן המורד הסמוך. האזור נשמר בין שני גנים השכנים הוארך עד 100 נ&quot;ב, כאשר הם היו ממוקמים באורינטציות מנוגדות ואת N-Termi...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; שמות</strong</td&gt;<td<strong&gt; חברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; קטלוג #</strong</td&gt;<td<strong&gt; תגובות (אופציונלי)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פריימר F2</td&gt;<td&gt; משולבות טכנולוגיות ה-DNA</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; R2 פריימר</td&gt;<td&gt; שם</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פריימר F2P</td&gt;<td&gt; שם</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P1 פריימר</td&gt;<td&gt; שם</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P2 פריימר</td&gt;<td&gt; שם</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פריימר 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; שם</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פריימר 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; שם</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פריימר 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; שם</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; רצף: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; פולימראז ה-DNA</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; פלטינום תקי פולימראז ה-DNA נאמנות גבוהה</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; ניו אינגלנד Biolabs Inc</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; אנזים הגבלה</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; אגר</td&gt;<td&gt; אמריקאי Bioanalytical</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarose</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; עירוי לב המוח</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סוס סרום</td&gt;<td&gt; הפישר סיינטיפיק</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; סוס סרום</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ק&quot;מ</td&gt;<td&gt; הפישר סיינטיפיק</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamycin</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH מרק</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; טוד יואיט מרק</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 ערכת טיהור PCR</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; ערכת טיהור PCR QIAquick</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סינון</td&gt;<td&gt; קורנינג</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; מסנן קלקר מיקרומטר 0.22</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anoxomat מערכת</td&gt;<td&gt; מארט מיקרוביולוגיה bv</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; צנטריפוגה Benchtop</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall מקרא RT פלוס microplate הרוטור</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; תיעוד ג&#39;ל</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-זה 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; חממה</td&gt;<td&gt; הפישר סיינטיפיק</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; של Labnet ג&#39;ל XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; של Labnet ג&#39;ל XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifuge</td&gt;<td&gt; אפנדורף</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; 5415 R microcentrifuge</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pipettes רב</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cycler תרמית</td&gt;<td&gt; יישומי BioSystems בע&quot;מ</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR מערכת 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

מחיקות gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה pcr

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis ומחיקה של גן היחיד הם שתי שיטות שיושמו בנוקאאוט גן גנום רחב ב1,2 חיידקים. למרות mutagenesis transposon הוא פחות זמן רב, יקר פחות, ואינו דורש מידע הגנום הושלם, יש שתי חולשות בשיטה זו: (1) האפשרות של מוטציות שונות בספריית המוטציה המעורבת שנגד בוחרת מוטנטים עם תחרות ירד; ו (2) האפשרות של איון גן החלקי לפיו גנים לא לגמרי מאבדת את תפקודם לאחר החדרת transposon. ניתוח מחיקה של הגן יחיד עשוי לפצות על חסרונות הקשורים mutagenesis transposon. כדי לשפר את היעילות של מחיקה הגנום בודדה גן, אנו מנסים להקים טכניקת תפוקה גבוהה למחיקת גן יחידה הגנום באמצעות sanguinis Streptococcus כאורגניזם מודל. כל מחיקת גן לבנות בס sanguinis הגנום נועד מהווה 1-KB זרם של הגן הממוקד, גן APHA-3, חלבון התנגדות kanamycin קידוד, או במורד 1-KB של הגן הממוקד. שלושה זוגות של פריימרים F1/R1, F2/R2, וF3/R3, בהתאמה, מתוכננים ומסונתזים בפורמט צלחת 96-גם ל- amplifications PCR של שלושה המרכיבים האלה של כל מחיקה להקים. Primers R1 ו F3 מכילים רצפי 25-BP שמשלימים לאזורים של-3 APHA הגן בקצה 5 &#39;שלהם. הגברת PCR קנה מידה גדולה של-3 APHA הגן מתבצעת פעם אחת ליצירה כל מבני המחיקה בגן בודד. האמרגן של גן APHA-3 בתחילה הוצא כדי למזער את ההשפעה הפוטנציאלית של קוטב קלטת kanamycin. כדי ליצור מבני מחיקת הגן, הגברת תפוקה גבוהה PCR וטיהור מבוצעות בפורמט צלחת 96-כן. Amplicon PCR רקומביננטי יניארית לכל מחיקת גן יהיה מורכב באמצעות ארבע תגובות PCR באמצעות DNA פולימראז באיכות גבוהה. Expon הראשונישלב הצמיחה ential של ס &#39; sanguinis תרבית בטוד יואיט מרק בתוספת 2.5% סרום סוס מומת משמש כדי להגדיל את היכולת של שינוי מבני PCR-רקומביננטי. תחת תנאי זה, עד 20% של ס &#39; תאי sanguinis ניתן להפוך באמצעות ~ 50 ng של DNA. בהתבסס על גישה זו, 2048 מוטנטים עם מחיקת גן יחיד סופו של דבר התקבלו מ2270 הגנים בס sanguinis למעט 4 ORFs גנים כלולים כולו בתוך ORFs האחר בס sanguinis SK36 ו218 גנים חיוניים פוטנציאליים. הטכניקה ביצירת מבני מחיקת גן היא תפוקה גבוהה ויכולה להיות קל לשימוש במחיקות גן יחידות הגנום לכל חיידקי transformable.

לאחר הגברת PCR באמצעות הפריימרים F1 ו-R1, ו-F3 ו-R3, התקבלו מקטעים של כ-1-kb במעלה ובמטה של כל גן ב-S. sanguinis, בפורמט של 96 בארות, בהתאמה (איור 2A). תחת תנאי ה-PCR שלנו ובשימוש בפריימרים שתוכננו, הוגבר תוצר ספציפי מ-DNA גנומי של S. sanguinis בכל תגובת PCR. תוצאה זו העידה על כך שהפריימרים היו ספציפיים מאוד למטרות ב-S. sanguinis. באמצעות הגברה חוזרת ב-PCR תוך שימוש בפריימרים F1 ו-R3 ובשלושה אמפליקונים כתבניות DNA, נוצרו בקיבולת גבוהה על פלטת 96 בארות מבני PCR רקומביננטיים ליני...

שיטה יעילה הגנום בודדה גן מוטציה כבר נקבעה באמצעות<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; כאורגניזם מודל. שיטה זו השיגה דרך PCRs גבוה התפוקה רקומביננטי ותמורות.

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

מוטגנזה באמצעות טרנספוזונים ומחיקה של גן בודד הן שתי שיטות המיושמות לשם השבתה גנומית רחבה של גנים בחיידקים 1,2. למרות שמוטגנזה באמצעות טרנספוזונים היא...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע מחיקות של גנים בודדים ברחבי הגנום ב-streptococcus sanguine באמצעות PCR בתפוקה גבוהה. דבר זה מושג תחילה על ידי השגת שלושה אמפליקונים באמצעות הגברה ב-PCR בתפוקה גבוהה, הכוללים את הגן לעמידות לאנטיביוטיקה, וכן את רצפי ה-DNA שמעלה ושמטה לגן המטרה. השלב השני הוא השגת אמפליקון PCR רקומביננטי ליניארי תוך שימוש בשלושת אמפליקוני ה-PCR כתבניות.בשלב הבא, מכינים את תאי ה-s sanguine המסוגלים. השלב האחרון הוא טרנספורמציה של האמפליקון הליניארי הרקומביננטי מ-PCR אל תוך תאי s sanguine מסוגלים. לבסוף, משתמשים בהגברה באמצעות PCR ובריצוף DNA כדי לאמת את המוטנטים הנכונים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות ומגבילות, כגון השבתה באמצעות פלסמיד התאבדות (suicide plasmid knockout), הוא ששיטה זו מאפשרת ליצור מוטנטים עם מחיקה ברחב הגנום באופן ישיר תוך שימוש בסריקה רב-ערוצית (high throughput). ניתן לתכנן ולסנתז פריימרים ל-PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, באמצעות סקריפטים פנימיים המבוססים על רצף הגנום של streptococcus sanguineous SK 36. תוכננו שלושה סטים של פריימרים להגברה של רצף של 1 kb במעלה הזרם (upstream) של הגן המטרה, הקידוד של חלבון עמיד לקנמיצין (kanamycin resistance protein) של הגן A PHA three, ורצף של 1 kb במורד הזרם (downstream) של הגן המטרה.פריימרים ספציפיים

genome-wide-gene-deletions-streptococcus-sanguinis-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

שיטת המפלצת הירוקה מאפשרת הרכבה המהירה של מחיקות מרובות מסומנות בחלבון כתב גן קידוד ירוק זרחני. שיטה זו מבוססת על נהיגת זני שמרים במחזורים חוזרים ונשנים של מגוון מיני של מחיקות והעשרה פלואורסצנטי המבוסס של תאים שנשאו יותר מחיקות.

תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות

מקור: Tomás, J. M., et al. יצירת מוטציות אפס כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקים. J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים את ההגברה התלויה ביוזם של פלסמיד מתאבד ב - E. coli. הפלסמיד, הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה, משתכפל רק בנוכחות חלבון יוזם המקודד על ידי המארח. לאחר אלקטרופורציה ודגירה במדיום התאוששות, התערובת מצופה על אגר המכיל אנטיביוטיקה. חיידקים עם פלסמיד שורדים, מכיוון שהחלבון היוזם שלו מאפשר ביטוי של הגן העמיד לאנטיביוטיקה של הפלסמיד.

הגברה של פלסמיד מתאבד במארח חיידקים

CRISPR/Cas9 היא מערכת חזקה ליצירת שיבוש של גנים ואלמנטים גנטיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירה יעילה של מחיקות גנומיות בשורות תאים של יונקים באמצעות CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

אימות ניסיוני של פעילות משפר ניגש בצורה הטובה ביותר על ידי ניתוח אובדן תפקוד. מוצג כאן פרוטוקול יעיל המשתמש במחיקה בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לחקור ויסות ספציפי לאלל של שעתוק גנים בתאי F1 ES המכילים גנום היברידי (Mus musculus129 x Mus castaneus).

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

כתב יד זה מתאר assay PCR דיגיטלית דופלקס, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת spp אנטרוקוקוס זמנית. ואת סמנים גנטיים HF183 כאינדיקטורים לזיהום צואתי כללית אדם הקשורים במים פנאי.

Assay PCR דיגיטלי דופלקס כימות סימולטני של<em&gt; Spp אנטרוקוקוס.</em&gt; ואת מרקר HF183 הקשורים צואת האדם ווטרס

אנו מתארים שיטה נתיישב, מהירה וזולה יחסית לדור של ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זנים; טכניקה זו עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור השימוש קיימות מגירות עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה בונה כבסיס ליצירת מוטציות מחיקה זנים אחרים e. coli . מוטציות מחיקה כאלה יכולים להיות גייסה ונוסף מיקומה המקביל של זן נמען באמצעות התמרה חושית bacteriophage P1.

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

מתוארים כאן היא שיטה פשוטה לטיהור של מוצר הגן ב סטרפטוקוקוס מויזוף. טכניקה זו עשויה להיות יתרון על טיהור של חלבונים, בעיקר חלבונים הממברנה וחלבונים המוניים גבוה המולקולרי, והוא יכול לשמש עם מינים שונים חיידקים אחרים.

טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

כאן, אנו מתארים את הבנייה של מוטציות ריקות של אירומונס בגליקוזילטרנספראזות ספציפיות או באזורים המכילים גליקוזילטרנספראזות, מבחני תנועתיות וטיהור פלגלה שבוצעו כדי לבסס את המעורבות והתפקוד של האנזימים המקודדים שלהם בביוסינתזה של גליקאן, כמו גם את תפקידו של גליקאן זה בפתוגנזה חיידקית.

יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

למדו שיטה יעילה למחיקות גנים בגנום Streptococcus sanguinis באמצעות PCR בתפוקה גבוהה. הטכניקה מאפשרת מחקר מהיר של פונקציות גנים בחיידקים.

מחיקות Gene הגנום ב

גלה סרטונים נוספים