מחיקות Gene הגנום ב

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע מחיקות של גנים בודדים ברחבי הגנום ב-streptococcus sanguine באמצעות PCR בתפוקה גבוהה. דבר זה מושג תחילה על ידי השגת שלושה אמפליקונים באמצעות הגברה ב-PCR בתפוקה גבוהה, הכוללים את הגן לעמידות לאנטיביוטיקה, וכן את רצפי ה-DNA שמעלה ושמטה לגן המטרה. השלב השני הוא השגת אמפליקון PCR רקומביננטי ליניארי תוך שימוש בשלושת אמפליקוני ה-PCR כתבניות.

בשלב הבא, מכינים את תאי ה-s sanguine המסוגלים. השלב האחרון הוא טרנספורמציה של האמפליקון הליניארי הרקומביננטי מ-PCR אל תוך תאי s sanguine מסוגלים. לבסוף, משתמשים בהגברה באמצעות PCR ובריצוף DNA כדי לאמת את המוטנטים הנכונים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות ומגבילות, כגון השבתה באמצעות פלסמיד התאבדות (suicide plasmid knockout), הוא ששיטה זו מאפשרת ליצור מוטנטים עם מחיקה ברחב הגנום באופן ישיר תוך שימוש בסריקה רב-ערוצית (high throughput). ניתן לתכנן ולסנתז פריימרים ל-PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, באמצעות סקריפטים פנימיים המבוססים על רצף הגנום של streptococcus sanguineous SK 36. תוכננו שלושה סטים של פריימרים להגברה של רצף של 1 kb במעלה הזרם (upstream) של הגן המטרה, הקידוד של חלבון עמיד לקנמיצין (kanamycin resistance protein) של הגן A PHA three, ורצף של 1 kb במורד הזרם (downstream) של הגן המטרה.

פריימרים ספציפיים לגן. R1 ו-F3 תוכננו על בסיס הרצפים של הקצה ה-5' והקצה ה-3' של הגן המטרה, כדי להגביר ביעילות גבוהה את האזור של 1 kilobase שמעלה או מטה לגנים של s sanguine. ראשית, הכינו תערובת PCR על קרח בתוך פרועת קונית של 15 milliliter.

עיינו בטקסט עבור מרכיבי תערובת ה-PCR המכילה DNA גנומי של s sanguineous; העבירו 23 µL מהתערובת לכל באער של פלטת PCR בעלת 96 באערים באמצעות פיפט רב-ערוצי. עבור הרצף שמעלה (upstream) של הגן המטרה, העבירו 1 µL מכל אחד מהפריימרים F1 ו-R1 מלוחות פריימרים של תמיסות עבודה בריכוז 10 µM אל פלטת ה-PCR באמצעות הפיפט רב-הערוצי. בצעו את הפעולה באופן דומה עם פריימרים F3 ו-R3 כדי להגביר את הרצף שמתחת (downstream) של הגן המטרה. אטמו את פלטת ה-PCR ובצעו הגברה ב-94 °C למשך דקה אחת, ולאחר מכן 30 מחזורים של 94 °C למשך 30 שניות.

54 °C למשך 30 שניות ו-68 °C למשך 1.5 דקות. לאחר ההגברה, הכין ג'ל אגרוז בריכוז של 1% המכיל ברומיד מתאים עם 48 בארות המתאימות לטעינה באמצעות פיפט רב-ערוצי. ערבב ארבעה µL של תוצר ה-PCR עם מיקרוליטר אחד של בופר טעינה DNA בריכוז 5X.

בפלטה בעלת 96 בארות, העמסו את הדגימות על ג'ל agarose באמצעות פפיט רב-ערוצי של 10 µL. הריצו אלקטרופורזה ב-135 V למשך 30 דקות. בחנו את הפסים על הג'ל תחת מערכת תיעוד ואנליזה UVP.

טהרו את תוצרי ה-PCR באמצעות ערכת PureLink 96 PCR Purification באמצעות סנטריפוגציה בהתאם להוראות היצרן להשחריר (elution) של ה-DNA. הוסיפו 40 µL של מים מזוקקים פעמיים סטריליים לכל באר בלוח הקישור (binding plate). בחרו באופן אקראי מספר אמפליקונים מטוהרים בלוח כדי לבחון את ריכוזי ה-DNA.

באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop, התאימו את ריכוז האמפליקונים בלוח לכ-10 nanograms per microliter. לאחר מכן, השתמשו ב-Eco RI כדי לעכל פלסמיד המכיל את קסטת העמידות לקנמיצין, כך שיוכל לשמש כתבנית ל-PCR. טהרו את הפלסמיד שעבר עיכול באמצעות ערכת Kayan Quick PCR Purification Kit והתאימו את ה-DNA של הפלסמיד הליניארי לריכוז DNA סופי של 10 nanograms per microliter.

הכינו תערובת PCR בנפח 25 µL עבור האמפליקון של הקסטה לעמידות לקנמיצין, הכוללת את הפריימרים F two ו-R two כפי שמופיע בנוהל הכתוב. בהמשך לסרטון זה, בצעו הגברת PCR לפי ההוראות המופיעות כאן. כדי לבחון את תוצר ה-PCR, בצעו אלקטרופורזה על ג'ל agarose בריכוז 1%.

לאחר מכן, איספו תערובת (pool) של תוצרי הגברה (amplicons) של קסטת העמידות ל-cany מ-10 פרטים שעברו טיהור PCR. התאימו את ריכוז תוצרי ההגברה ל-10 nanograms per microliter. ההיבט המאתגר ביותר בהליך זה הוא השגת תוצר ה-PCR הסופי בעל הכשירות הליניארית מתוך שלושת תוצרי ה-PCR שלו.

כדי להבטיח הצלחה, יש להתאים את שלוש דגימות ה-PCR לכמות כמעט שווה. ערבבו מיקרוליטר אחד מכל אחת משלוש דגימות ה-PCR בריכוז 10 nanogram per microliter בתוך פלטת PCR אחת, יחד עם תבנית ה-PCR. לאחר מכן, הכינו את תערובת ה-PCR, כולל הפריימרים F1 ו-R three כפי שמופיע בנוהל הכתוב.

בשלב הבא, בצעו הגברה של הדגימות באמצעות PCR. בחנו את תוצרי ה-PCR (PCR AMPLICONS) על ג'ל אגרוז לאחר טיהור וכמות של תוצרי ה-PCR. כפי שנעשה בעבר, הקפיאו את תוצרי ה-PCR המאוחדים בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.

ראשית, הכינו מצע Todd Hewitt וסרום סוס כפי שהורו בנוהל הכתוב המצורף לסרטון זה. העבירו מנה של 2 mL מצע ומנה של 10 mL מצע לשתי מבחנות קוניות של 15 mL. הכניסו 5 µL של מלאי מופשר של s sanguine SK 36 שהוקפא בטמפרטורה של 80- °C לתוך 2 mL של המצע. דגרו את התרבית, כשהפקק סגור היטב, למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C.

בצעו גם דגירה מקדימה של מבחנת המצע בנפח 10 milliliter תחת אותם תנאים לאחר דגירה של לילה. העבירו 50 microliters מהתרבית אל מבחנת המצע בנפח 10 milliliter. דגרו את המבחנה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שלוש שעות.

מיד לאחר האינקובציה, הוסף שתי microliters של 70 nanogram s sanguineous, פפטיד מעורר כשירות (competence stimulating peptide) SK 36 ושתי microliters של PCR amplicon רקומביננטי לינארי לשפופרות EINOR על גבי בלוק של 96 בארות, וחמם אותן מראש ל-37 °C. העבר 330 microliters של תרבית SK 36 שעברה אינקובציה של שלוש שעות לכל שפופרת. החלף את ה-DNA במים מזוקקים פעמיים סטריליים כביקורת.

דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת לאחר הדגירה. הניחו את הבלוק על קרח ופזרו 100 µL מכל טרנספורמציה על צלחות אגר BHI (Brain Heart Infusion) המכילות 500 µg/mL של Kanamycin. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C למשך יומיים בתנאים מיקרו-אווירוביים. עבור כל מוטנט החלפה, בחרו באופן אקראי שתי מושבות בודדות והעבירו כל מושבה לתוך 5 mL של BHI המכיל 500 µg/mL של Kanamycin. דגרו כל תרבית למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C בתנאים מיקרו-אנאירוביים.

בצעו הקפאה (Cryopreservation) לכל תרבית ב-30% glycerol בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. כדי לבחון האם המוטנט מכיל את החלפת הגן הצפויה, בצעו colony PCR לכל מוטנט באמצעות הפריימרים F1 ו-R3 בלוח PCR של 96 בארות.

השתמש בכ-1 µL של תרבית לילה מכל מושבה בודדת כתבנית DNA בתגובת הגברה של PCR בנפח של 25 µL. המשך בביצוע הגברת PCR כדי לאשר את החלפת הגן המוטנטי, במטרה לזהות במדויק מוטנטים עם פס כפול או תוצרי PCR של זיהום. בחן את תוצר ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה בג'ל למשך ארבע שעות על ג'ל באורך של יותר מ-12 cm.

ג'ל agarose בריכוז 2% עם צביעת bromide תחת תנאי אלקטרופורזה של ג'ל agarose אלו. ניתן לזהות בבירור כל אמפליקון עם הפרש של 100 זוגות בסיסים או יותר. לחלופין, כאשר צפוי שהפסים הנובעים מהגברה של קסטת העמידות לקנמיצין והגן מסוג הפרא יבדילו פחות מ-100 זוגות בסיסים, השתמשו בפריימר T one פנימי של הגן המטרה כדי לקבוע אם ניתן לזהות את הגן מסוג הפרא באמצעות PCR.

כדי לאשר את המחיקה באופן סופי, טהרו את האמפליקונים באמצעות ערכת pure link 96 PCR purification kit ובצעו רצף באמצעות הפריימר P one, הנקשר לקסטת העמידות לקנמיצין; שמרו רק את המוטנטים הנכונים שאושרו על ידי רצף לאחר הגברה ב-PCR באמצעות הפריימרים F1 ו-R one עבור הרצף במעלה הזרם (upstream) ו-F three ו-R three עבור הרצף במורד הזרם (downstream). כ-one kilobase במעלה ובמורד הזרם של כל גן של s sanguineous הושגו בפורמט של 96-well תחת תנאי ה-PCR ובשימוש בפריימרים שתוכננו.

מוצר ספציפי הוגבר מ-DNA גנומי של s sanguineous בכל תגובת PCR, דבר שהעיד על כך שהפריימרים היו ספציפיים מאוד למטרות של s sanguine באמצעות הגברה חוזרת ב-PCR, תוך שימוש בפריימרים F1 ו-R3 ובשלושה אמפליקונים כתבניות DNA. קונסטרוקטים רקומביננטיים ליניאריים של PCR נוצרו בסבב של תפוקה גבוהה. בלוח של 96 בארות, הקונסטרוקטים הרקומביננטיים של PCR, המורכבים מאזור שמעלה לכל גן מטרה, קסטת cany, ואזור שמתחת לכל גן מטרה (בסדר זה), הועברו לאחר מכן בטרנספורמציה ל-s sanguine SK 36 ונבחרו באמצעות cany על מצעי אגר BHI.

במרבית הטרנספורמציות, התקבלו למעלה מ-1000 מושבות בכל צלחת לאחר דגירה של יומיים בתנאי מיקרו-אווירוביים. כאשר מושבות אלו הועברו להגברה באמצעות PCR עם F1 ו-R three, נצפתה באלקטרופורזה בג'ל פס DNA בודדת התואמת לגודל המוטנט הצפוי בעת ניסיונות למחיקה של גנים חיוניים פוטנציאליים. במרבית הטרנספורמציות למחיקה של חלק מהגנים החיוניים, לא אמורות להתקבל מושבות.

עם זאת, עדיין התקבלו מושבות לאחר טרנספורמציה; לאחר הגברה ב-PCR של מושבות אלו באמצעות F1 ו-R, הופיעו שלושה פסי 2D NA המתאימים לגודל המוטנט הצפוי ולגודל הטיפוס הפראי, כפי שנחשף באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. עבור חלק מהמוטנטים, הגודל הצפוי של המוטנט והגודל של הטיפוס הפראי של תוצר ה-PCR היו קרובים מדי מכדי להיות מופרדים על ידי ג'ל agarose ארוך. במקרה זה, תוכנן פריימר T one פנימי של הגן מטרה על בסיס רצף הגן של הטיפוס הפראי.

ביצוע ה-PCR בוצע באמצעות הפריימר הפנימי T one והפריימר F1. זן הטיפוס הפראי SK 36 שימש כשבט בקרה חיובי עבור PCR זה. אם הוגבר מהמוטנט באמצעות הפריימר הפנימי פס בגודל הצפוי, הגן זוהה כגן חיוני.

מאחר שנוכחות קסטת ה-can mycin במטציה אוששה בעבר על ידי רצף DNA באמצעות הפריימר P one. בהתבסס על פרוטוקול זה, נאספו 2048 מוטנטים של גנים שאינם חיוניים ב-S sanguineous. הוצאו מהם ארבעה מסגרי קריאה פתוחים (open reading frames) שהיו מוכלים לחלוטין בתוך מסגרי קריאה פתוחים אחרים.

זוהו 218 גנים, החיוניים להישרדות של s sanguine, תחת התנאים הניסויים. לאחר צפייה בסרטונים אלו, אני סבור כי תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע סקירה גנומית של השתקה גנטית באמצעות PCR בתפוקה גבוהה.