Name: בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: למד לבודד תאים כמו מלנוציטים לבביים מלב העכבר באמצעות עיכול אנזימטי וגירוד מכני. שיטה זו מאפשרת מחקר פיזיולוגי ומולקולרי של תאים אלו בתרבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בפרס R01 HL105734 לVVPMDL נתמך, בין שאר, על ידי המכון הלאומי לבריאות בקריירה מחקר פרס K08 HL094748. VVP הוא חוקר חדשני של איגוד הלב האמריקאי נתמך על ידי מענק 11IRG900384.

.1 הכנת הפתרונות וציוד הדרושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לעקר את מכשירי ניתוח (מלקחיים ישרים צורה, מלקחיים צורה מעוגלות, מספריים צורה ישרות, ומספריים צורה מעוגלות) על ידי המעוקר במשך 15 דקות. ב 121 C °. להכין 2 סטים של מכשירים, שבו קבוצה אחת משמשת ללנתח את לבם ואת הסט השני ישמש למיותר את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 1 שקית של תקשורת בתרבות MCDB153 ב900 מ&quot;ל מים מעוקרים, מסוננים ומערבבים לאט עד שהאבקה נמסה. הוספת 1.2 יקרבונט גרם נתרן, או 15.7 פתרון ביקרבונט מ&quot;ל של נתרן [7.5% w / v], לכל ליטר של נפח הסופי של מדיום שמכין ומערבבים עד שהיא נמסה. התאם את רמת החומציות ל7.2 על ידי הוספה או N HCl 1 או 1 N NaOH, ואז לשפוך את התקשורת דרך מסנן עליון 0.2 מיקרומטר בקבוק בתנאים סטריליים בשכונת תרביות רקמה (קבינט בטיחות ביולוגי). לאחר מכן לאסוף את התקשורת ולאחסן אותו ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התוספים ללהוסיף לתקשורת והתרבות (חומרי רשימה). יש להוסיף התוספים לתקשורת רק לפני יש צורך בתקשורת לציפוי התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DPBS עם 10% FBS בתוספת אנטיביוטיקה (פניצילין וסטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, להכין פתרון טריפסין 0.25% על ידי הוספת 0.25 גרם של טריפסין (לבלב שור, פעילות&gt; 2,500 USP יחידות / מ&quot;ג, ultrapure; USB) לשל DPBS בתוספת אנטיביוטיקה (פניצילין וסטרפטומיצין) 100 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד הנדרש אחר הנחוץ להשלמת הליך זה כולל סטראו, פטרי מנות (10 ס&quot;מ), צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל, מסננות תא 40-מיקרומטר, DPBS בתוספת אנטיביוטיקה, מנות תרבות 60 מ&quot;מ ומנות תרבות 35 מ&quot;מ. </li></ol> .2 בידוד לבבות מגורי עכבר ילודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להשיג P0 לגורי עכבר יילודי P2 (n = 6 עד 8). מומלץ להשתמש בגורים שנוצרו על ידי רביית DCT-Cre נקבות הומוזיגוטים עם זכרים כי הם הטרוזיגוטיים לאו R26R: אלל EYFP או Z אלל / EG לתייגתאים כמו melanocyte-. שני R26R: עכברי EYFP וZ / EG זמינים מג&#39;קסון מעבדות (מספרי מניית 006,148 ו003,920, בהתאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, להרדים את גורי עכבר יילודים, לנגב חזה עם ספוגית אלכוהול ולאחר מכן למקם את הגורים ב10 ס&quot;מ צלחת פטרי עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור באזור החזה ועצם חזה עם מלקחיים ומספריים מעוקרים ולאחר מכן פתח את החזה בזהירות תחת סטראו. לבם של גורי עכבר יילודים קטנים מאוד כדי להיות זהיר כדי לוודא כדי להסיר את כל הלב עם אטריה המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הלב בDPBS ולהעביר אותם לצלחת פטרי 10 ס&quot;מ חדש. </li></ol> .3 אנזימתי עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את צלחת פטרי עם הלבבות עקורים למכסת מנוע בתרבית רקמה (קבינט בטיחות ביולוגי) ולאחר מכן בצע את השלבים הבאים תוך שימוש בטכניקות סטרילי במכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לשטוף את הלבבות שלוש פעמים בDPBS בתוספת האנטיביוטיקה סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הלבבות (n = 6-8) בצלחת 60 מ&quot;מ התרבות ולהוסיף 6-8 מ&quot;ל של .0.5% פתרון טריפסין לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לחתוך את הלב לחתיכות קטנות (פחות מ -1 מ&quot;מ בגודל) ודגירה אותם 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באווירת 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , לאחר תקופת הדגירה היא מלאה לשפוך את הפתרון של רקמה וטריפסין מצלחת לב וכתוצאה מכך לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, באמצעות פיפטה סטרילית 10-מ&quot;ל, במהירות אך בעדינות, triturate הפתרון בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל 30-50 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון דרך מסננת תא 40-מיקרומטר על גבי צינור חדש, נקי 50 מ&quot;ל חרוטי וכתוצאה מכך לאיסוף התסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, צנטריפוגות צינור 50 מ&quot;ל ב240 x גרם בצנטריפוגה בטבלה העליונה למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. ואז, בעדינות לשאוב את supernatant וresuspend גלולה שנותר ב6-8 מ&quot;ל של DPBS סטרילי. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר. צעד זה פלטות myocytes פרוזדורים ומלנוציטים לב אבל לא להפיל את fibroblasts מאז fibroblasts הם קטנים יותר ויישארו בsupernatant. </li></ol> תאים דמויי Melanocyte .4 ציפוי הלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות השטיפה השלישית לאחר צנטריפוגה, לנקז בזהירות או לשאוב את הפתרון לשטוף (DPBS) וresuspend גלולה ב6 מ&quot;ל של תקשורת בתרבות MCDB שלתוספים נוספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, לצייר הפתרון המושעה לפיפטה העברת סטרילי ולמקם את התאים בצלחת 35 מ&quot;מ, או בטוב של צלחת 6 היטב, וברכת תאי לב הבודדים מ3 עכברים בילוד בצלחת 35 מ&quot;מ אחד או כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות הלילה בשעה 37 ° C באווירת 5% CO 2, לשאוב את התקשורת והתרבות יחד עם כל תאים פנויים ולאחר מכן לשטוף את הצלחות פעם אחת עם DPBS. לאחר מכן להוסיף תקשורת טרי לצלחות ולהחליף את התקשורת כל 2 ימים. תאים מבודדים מלב בילוד או עוברי יכולים להישמר בתרבות לתקופה של עד 3 שבועות, ואילו תאים מבודדים מלשמוע מבוגריכול להישמר ts בתרבות עד 10 ימים. </li></ol> תאים דמויי Melanocyte .5 בידוד לב מלב מאוס למבוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להסיר את הלב מעכברים בוגרים (3-4 שבועות בן, n = 3) דרך sternotomy קו האמצע לאחר מתן הפרין 100 intraperitoneal U לעכברים ולאחר מכן הרדמת חסדם. מומלץ להשתמש pentobarbital להרדים עכברים להליך זה, אך תרופה זו אינה זמינה בכל המקומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לשטוף את הלבבות העקורים בDPBS סטרילי המכיל אנטיביוטיקה במכסת מנוע בתרבית רקמה (קבינט בטיחות ביולוגי). לסחוט את לבם מעט עם מלקחיים לנתח מעוקלים כדי להסיר כל דם שנותר מהם ולאחר מכן לשטוף את לבם בDPBS עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפרוזדורים וannulus בין העליות וחדרים מהלב (מבנים אלה מכילים תאים כמו melanocyte-) ולמקם את דגימות רקמה שהוסרו בצלחת 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הלבבות לחתיכות קטנות בעזרת מספריים וכוח מעוקליםps אז ולהוסיף 6-8 מ&quot;ל של .0.5% פתרון טריפסין לצלחת. ואז דגירה המנות ב37 מעלות צלזיוס למשך 45-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, בצע את השלבים מהתהליך שתואר לעיל החל מהצעד 3.6 ואילך. </li></ol>

<ol><li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li>
<li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li>
<li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li>
<li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Cardiovasc.+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li>
<li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li>
<li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li>
<li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoblasts+in+culture%3A+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2%2C+stem+cell+factor%2C+and+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li>
<li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li>
<li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

מלנוציטים לב נמצאים במקומות אנטומיים בתוך הלב, כי בדרך כלל לגרום לטריגרים הפרעות קצב פרוזדורים. אזורים אלה כוללים את ורידי ריאה, annulus בין העליות והחדרים, המבואה האחורית עזב וovale הנקב (איור 4). כדי להבין את תפקיד תאים אלה לשחק בarrhythmogenesis, אנו מפתחים טכניקות לבודד אותם וללמוד הפיסיולוגיה שלהם. עם זאת, אנחנו מוכרים את זה השיפור בטכניקה זו כדי להניב כמויות בריאים וגדולות יותר של מלנוציטים לב תאפשר מחקרים נוספים כדי לחקור את התגובה של מלנוציטים לב לגירויים ...

לאחרונה זיהו אוכלוסיית תא רומן בלב של עכברים ובני האדם שמבטאים את אנזימי מלנין-סינתזה ומורפולוגית דומה מלנוציטים עורית. אנו נקראים &#39;מלנוציטים הלב&#39; התאים אלה ומצאנו שהם נמצאים במקומות אנטומיים שממנו הפרעת קצב פרוזדורים מתעורר בי לעתים קרובות מקורן בבני אדם. מצאנו גם מלנוציטים לב לתרום להפרעות קצב פרוזדורים בעכברים עם מחיקה בתאי מין של DCT. מלנוציטים לב מופצים בדלילות לאורך אטריום העכבר שבו הם מהווים פחות מ -0.1% מכל תאי פרוזדורים. כדי לחקור את התכונות חשמליות וביולוגיות של מלנוציטים לב פיתחנו הליך לבודד אותם מלב העכבר באמצעות סמנים ספציפיים melanocyte Cre-מושרה. ההליך הראשוני שלנו פותח מאלו המשמשים לבודד את שריר לב עכברי בילוד ומספרים קטנים מאוד הניבו של תאים מתאימים להקלטות מהדק תיקון או ניתוח PCR. עם זאת, על מנת לשפר את לרפאה ואת הכדאיות של מלנוציטים לב, ליותר בניתוח המעמיק אלקטרו או מחקרים ביוכימיים, שפיתחנו הליך מעודן מאלה שנועדו לבודד את מלנוציטים עורית. יש ההליך המתואר והפגין בסקירה זו את היתרון של ייצור מלנוציטים לב בריאים שיכול להיות מצופה כאוכלוסייה טהורה או עם שריר לב.

<table><tbody><tr><td>MCDB 153</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>להמיס במים</td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן וללא מגנזיום</td><td>Invitrogen</td><td>14190136</td><td>ריכוז מלאי: 1x&lt;br/&gt; ריכוז עבודה: 1x</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומייצין </td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>ריכוז מלאי: 100x&lt;br/&gt; ריכוז עבודה: 1x</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (Fetal Bovine Serum)</td><td>Life Technology</td><td>Certified</td><td>ריכוז עבודה: 4%</td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td>להמיס ב-DMSO&lt;br/&gt;ריכוז מלאי: 3.2 &amp;mu;M&lt;br/&gt;ריכוז עבודה: 32 nM</td></tr><tr><td>טרנספרין (Transferrin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td>להמיס ב-DPBS&lt;br/&gt;ריכוז מלאי: 0.1 mg/ml&lt;br/&gt;ריכוז עבודה: 1 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Dibutyryl cyclic AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>להמיס ב-DPBS&lt;br/&gt;ריכוז מלאי: 0.5 mM&lt;br/&gt;ריכוז עבודה: 5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>להמיס בחומצה אצטית 10 mM&lt;br/&gt;ריכוז מלאי: 1 mg/ml&lt;br/&gt;ריכוז עבודה: 5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Basic FGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td>להמיס במים&lt;br/&gt;ריכוז מלאי: 4 ng/&amp;mu;l&lt;br/&gt;ריכוז עבודה: 4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

בידוד תאים כמו melanocyte-ראשיים מלב העכבר

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

זיהינו אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורמים לגורמי הפרעת קצב פרוזדורים בעכברים. כדי לחקור את התכונות חשמליות וביולוגיות של מלנוציטים לב פיתחנו הליך לבודד אותם מלב העכבר שנגזרים מאלה שנועדו לבודד את שריר לב עכברי בילוד. על מנת לקבל מלנוציטים לב בריאים מתאימים למהדק תיקון נרחב יותר או מחקרים ביוכימיים, שפיתחנו הליך מעודן לבידוד וציפוי מלנוציטים לב המבוססים על אלה שתוכננו במקור לבודד מלנוציטים עורית. ההליך המעודן בא לידי הביטוי בסקירה זו ומייצר מספרים גדולים יותר של תאים כמו melanocyte הבריאים שיכול להיות מצופה כאוכלוסייה טהורה או עם שריר לב.

הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא טכניקה משופרת בהשוואה לזו שפורסמנו בעבר לבידוד מלנוציטים לב מהלב העכברי. הליך זה מעסיק את השימוש של סמני ניאון מונעים על ידי Cre-recombinase אנזים ספציפי סינתזת מלנין לתייג תאים כמו melanocyte-לב. חשוב להשתמש בסמן כדי לתייג מלנוציטים לב כאשר עובדים עם תאים עובריים או בילוד טרי מבודדים, מאז ההבדלים מורפולוגיים המבדילים מלנוציטים לב מmyocytes פרוזדורים עדיין לא פיתחו (איור 1 א). כפי שניתן לראות באיור 1 א כאשר צעד הבידוד...

בפרוטוקול זה, w הדואר זיהה אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורם להפרעות קצב פרוזדורים גורמת בעכברים.

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

זיהינו אוכלוסייה חדשה של תאים דמויי מלנוציטים (הידועים גם כמלנוציטים לבביים) בלבבות של עכברים ובני אדם, התורמים ל... עליות הלב

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאים דמויי מלנוציטים לבביים חיוניים מלב עכבר. הדבר מבוצע תחילה על ידי הוצאת לבבות מעכברים שהורדמו. השלב השני כולל קיצוץ של הלבבות ופירוק התאים באמצעות עיכול אנזימטי וערבול מכני.בשלב הבא, תלישת התאים עוברת סרטיפוגה והמשקע המכיל את התאי הלב (cardiomyocytes) והתאים דמויי המלנוציטים מומס מחדש. השלב הסופי הוא זריעה ותרבית. ניתן להשתמש בתאים דמויי המלנוציטים של הלב שבודדו בסופו של דבר למחקרי טלאי (patch studies) או לניתוח מיקרו-מערך (microarray analysis) בתגובה לגורם עקה פתופיזיולוגי, כדי להעריך את העירור התאי או את מצב התסריפטום (transcriptome).היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות שנועדו לבודד ולגדל תאי שריר לב (cardiomyocytes), הוא שהיא מאפשרת בידוד של תאים רבים דמויי מלנוציטים של הלב שניתן לעבוד איתם. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר גילינו אוכלוסיית תאים חדשה בלב העכבר, ורצינו לחקור את הפיזיולוגיה שלה. לתחילת הדברים, הכינו שתי סטים של מכשירים כירורגיים סטריליים, אחד להוצאת הלבבות והשני לקיצוץ הרקמה.בשלב הבא, הכינו את התוספים למצע, אך המתינו להוסיפם למצע התרבית עד רגע לפני זריעת התאים. לאחר הכנת מצע התרבית, סננו את התמיסה כדי לעקר אותה בעודכם עובדים תחת מ𒅈ג'ה לתרביות רקמה, ואסמרו את המצע בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הכינו תמיסה אחת של DNA's, one על ידי הוספת 0.05 גרם של DNA's, one ל-100 milliliters של DPBS עם 10%FBS בתוספת אנטיביוטיקה.בשלב הבא, הכינו תמיסת טריפסין בריכוז 0.5% על ידי הוספת 0.5 גרם טריפסין ל-100 מיליליטר DPBS בתוספת אנטיביוטיקה. לבסוף, אספו את שאר הציוד הדרוש להשלמת הפרוצדורה, כולל צלחיות פטרי, מבחנות קוניות בנפח 50 מיליליטר, מסנני תאים של 40 מיקרון, DPBS בתוספת אנטיביוטיקה, וצלחיות תרבית בקטרים של 60 מילימטר ו-35 מילימטר. לאחר הדוממה של גורי עכבר ניאונטליים בגילאי P zero עד P two, נגבו את חזם באלכוהול והניחו אותם בצלחית P two בקוטר 10 סנטימטר. בעבודה תחת מיקרוסקופ סטריאו עם DPBS, פתחו בזהירות את חלל בית החזה והוציאו את הלב כולו כשהעליות מחוברות אליו.יש לשטוף את הלבבות ב-DPBS ולהעביר אותם לצנחית פטרי חדשה של 10 סנטימטרים. העבירו את צנחית הפטרי עם הלבבות המוצאים למCure hood (מCure hood של תרביות רקמה) ופעלו לפי טכניקת עבודה סטרילית בשלבים הבאים. ראשית, שטפו את הלבבות שלוש פעמים ב-DPBS סטרילי בתוספת אנטיביוטיקה.הניחו את הלבבות בצלחת תרבית של 60 מילימטר והוסיפו 6 עד 8 מיליליטר של תמיסת trypsin 0.5%. לאחר מכן, חתכו את הלבבות לחתיכות קטנות והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עם סיום ההדגרה, העבירו את התמיסה שהתקבלה מהצלחת לשפופרת קונית סטרילית של 10 מיליליטר.בעזרת פיפטה סטרילית של 10 מיליליטר, ערבבו את התמיסה במהירות אך בעדינות באמצעות פיפוט (rerate) 30 עד 50 פעמים, וסננו את הסספנסיה המתקבלת דרך מסננת תאים של 40 מיקרון אל תוך מבחנה קונית נקייה חדשה של 50 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, שאבו בעדינות את העלייה (supernatant) ושחקו מחדש את המשקע שנותר בשישה עד שמונה מיליליטר של DPBS סטרילי. חזרו על שלב זה פעמיים נוספות.בעקבות השטיפה השלישית לאחר סנטריפוגציה, יש לנקז או לשאוב בזהירות את תמיסת השטיפה ולהשעות מחדש את המשקע בשש milliliters של מצע גידול מועשר. לאחר מכן, יש להעביר את התמיסה המושעתה למטפטף העברה סטרילי ולהניח את התאים בצלחת בקוטר 35 millimeter. לאחר דגירה של לילה, יש להוציא את תאי הלב המבודדים משלושה עכברים פוסט-נטאליים (neonatal mice), לשאוב את מצע הגידול יחד עם תאים שאינם מודבקים, לשטוף את הצלחות פעם אחת עם DPBS, ולהוסיף מצע טרי לצלחות ולהחליף את המצע.כל יומיים, ניתן לשמר בתרבית תאים שבודדו מלבבות עובריות או לבבות של רכיבים ניאונטליים למשך עד שלושה שבועות, בעוד שתאים שבודדו מלבבות של בוגרים ניתן לשמר בתרבית למשך עד 10 ימים. כדי לבודד תאים דמויי מלנוציטים מלב של עכבר בוגר, ראשית, שטפו את הלבבות שהוצאו ב-DPBS סטרילי המכיל אנטיביוטיקה בתוך מCב תרביות רקמה. לחצו קלות על הלב באמצעות פינצטת דיסקציה קמורה כדי להסיר דם שנותר, ולאחר מכן שטפו את הלב ב-DPBS פעם נוספת.בשלב הבא, הסירו את העליות ואת הטבעת העליית-חדרית מהלבבים והניחו את דגימות הרקמה הגזוזות בצלחת בקוטר 35 מילימטר. חתכו את הלבבים לחתיכות קטנות בעזרת מספריים קמורים ופינצטה. הוסיפו לצלחת 6 עד 8 מיליליטר של תמיסת trypsin בריכוז 0.5% והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 עד 60 דקות.לאחר הדגירה, חזור על השלבים שהודגמו קודם לכן כדי לקבל תרחיף של תאי לב בוגרים ולבצע זריעה כפי שנעשה לפני כן. בדוגמה זו, החץ הלבן מזהה את המלנוציט הקרדיאלי בשני הלוחות. שים לב כי ללא סיוע של הסמן הפלואורסצנטי, קשה לזהות את המלנוציט הקרדיאלי ולהבדילו מהמיוציטים העלייתיים המהדבקים לצלחית; ראש החץ התכלת מצביע על תאים עלייתיים שאינם הדבקים היטב לצלחית המוצגת כאן, שהם מלנוציטים קרדיאליים בריאים שבודדו מלב של עכבר רך.הם פיתחו שלוחות דנדריטיות נרחבות ודומים מאוד למלנוציטים של העור. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בתוך מספר שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לבודד תאי מלנוציטים חיים מהלב.זה יהיה מתאים לניתוח פיזיולוגי ומולקולרי.

isolating-primary-melanocyte-like-cells-from-the-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר את השיטה המהירה לבודד ולגדל את המלנוציטים והפיברובלסטים בו זמנית מעורו של גור העכבר לאחר הלידה. תאים אלה יכולים להישמר ולתפעל במבחנה כדי לחקור ביולוגיה של תאי העור, ריפוי פצעים ומלנומה.

גידול מהיר של מלנוציטים ופיברובלסטים ראשוניים של מורין: בידוד מלנוציטים ופיברובלסטים מדגימת עור מורין שלם

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

מודל אידיאלי לחקר ביולוגיה של תאי גזע בוגרים הוא זקיק שיער העכבר. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אוכלוסיות שונות של זקיקי שיער, תאי גזע וקרטינוציטים אפידרמיסיים, תוך שימוש בעיכול אנזימטי של עור הגב של העכבר ואחריו ניתוח FACS.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

המטרה הכוללת של מאמר זה היא כדי לתקנן את הפרוטוקול עבור בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב (CSCs) מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות לבודד CSCs מאתר ושיטות הארוטיות תרבות CSC, התפשטות של בידול לתוך cardiomyocytes.

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לייצר בו תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מן העור של 0-4 העכברים הישנים של היום. התרבויות העיקריות הללו ניתן לשמור ומניפולציות בתוך מבחנה כדי ללמוד מגוון של תהליכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כולל ביולוגיה של תאי העור, פיגמנטציה, ריפוי פצעים ומלנומה.

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גליית הרשתית מעיני עכבר. הפרוטוקול מתחיל באינקולציה ודיסקציה של עיני עכבר, ואחריו בידוד, זריעה וטיפוח של תאי מולר.

בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

למד לבודד תאים כמו מלנוציטים לבביים מלב העכבר באמצעות עיכול אנזימטי וגירוד מכני. שיטה זו מאפשרת מחקר פיזיולוגי ומולקולרי של תאים אלו בתרבית.

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

גלה סרטונים נוספים