בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאים דמויי מלנוציטים לבביים חיוניים מלב עכבר. הדבר מבוצע תחילה על ידי הוצאת לבבות מעכברים שהורדמו. השלב השני כולל קיצוץ של הלבבות ופירוק התאים באמצעות עיכול אנזימטי וערבול מכני.

בשלב הבא, תלישת התאים עוברת סרטיפוגה והמשקע המכיל את התאי הלב (cardiomyocytes) והתאים דמויי המלנוציטים מומס מחדש. השלב הסופי הוא זריעה ותרבית. ניתן להשתמש בתאים דמויי המלנוציטים של הלב שבודדו בסופו של דבר למחקרי טלאי (patch studies) או לניתוח מיקרו-מערך (microarray analysis) בתגובה לגורם עקה פתופיזיולוגי, כדי להעריך את העירור התאי או את מצב התסריפטום (transcriptome).

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות שנועדו לבודד ולגדל תאי שריר לב (cardiomyocytes), הוא שהיא מאפשרת בידוד של תאים רבים דמויי מלנוציטים של הלב שניתן לעבוד איתם. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר גילינו אוכלוסיית תאים חדשה בלב העכבר, ורצינו לחקור את הפיזיולוגיה שלה. לתחילת הדברים, הכינו שתי סטים של מכשירים כירורגיים סטריליים, אחד להוצאת הלבבות והשני לקיצוץ הרקמה.

בשלב הבא, הכינו את התוספים למצע, אך המתינו להוסיפם למצע התרבית עד רגע לפני זריעת התאים. לאחר הכנת מצע התרבית, סננו את התמיסה כדי לעקר אותה בעודכם עובדים תחת מ𒅈ג'ה לתרביות רקמה, ואסמרו את המצע בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הכינו תמיסה אחת של DNA's, one על ידי הוספת 0.05 גרם של DNA's, one ל-100 milliliters של DPBS עם 10%FBS בתוספת אנטיביוטיקה.

בשלב הבא, הכינו תמיסת טריפסין בריכוז 0.5% על ידי הוספת 0.5 גרם טריפסין ל-100 מיליליטר DPBS בתוספת אנטיביוטיקה. לבסוף, אספו את שאר הציוד הדרוש להשלמת הפרוצדורה, כולל צלחיות פטרי, מבחנות קוניות בנפח 50 מיליליטר, מסנני תאים של 40 מיקרון, DPBS בתוספת אנטיביוטיקה, וצלחיות תרבית בקטרים של 60 מילימטר ו-35 מילימטר. לאחר הדוממה של גורי עכבר ניאונטליים בגילאי P zero עד P two, נגבו את חזם באלכוהול והניחו אותם בצלחית P two בקוטר 10 סנטימטר. בעבודה תחת מיקרוסקופ סטריאו עם DPBS, פתחו בזהירות את חלל בית החזה והוציאו את הלב כולו כשהעליות מחוברות אליו.

יש לשטוף את הלבבות ב-DPBS ולהעביר אותם לצנחית פטרי חדשה של 10 סנטימטרים. העבירו את צנחית הפטרי עם הלבבות המוצאים למCure hood (מCure hood של תרביות רקמה) ופעלו לפי טכניקת עבודה סטרילית בשלבים הבאים. ראשית, שטפו את הלבבות שלוש פעמים ב-DPBS סטרילי בתוספת אנטיביוטיקה.

הניחו את הלבבות בצלחת תרבית של 60 מילימטר והוסיפו 6 עד 8 מיליליטר של תמיסת trypsin 0.5%. לאחר מכן, חתכו את הלבבות לחתיכות קטנות והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עם סיום ההדגרה, העבירו את התמיסה שהתקבלה מהצלחת לשפופרת קונית סטרילית של 10 מיליליטר.

בעזרת פיפטה סטרילית של 10 מיליליטר, ערבבו את התמיסה במהירות אך בעדינות באמצעות פיפוט (rerate) 30 עד 50 פעמים, וסננו את הסספנסיה המתקבלת דרך מסננת תאים של 40 מיקרון אל תוך מבחנה קונית נקייה חדשה של 50 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, שאבו בעדינות את העלייה (supernatant) ושחקו מחדש את המשקע שנותר בשישה עד שמונה מיליליטר של DPBS סטרילי. חזרו על שלב זה פעמיים נוספות.

בעקבות השטיפה השלישית לאחר סנטריפוגציה, יש לנקז או לשאוב בזהירות את תמיסת השטיפה ולהשעות מחדש את המשקע בשש milliliters של מצע גידול מועשר. לאחר מכן, יש להעביר את התמיסה המושעתה למטפטף העברה סטרילי ולהניח את התאים בצלחת בקוטר 35 millimeter. לאחר דגירה של לילה, יש להוציא את תאי הלב המבודדים משלושה עכברים פוסט-נטאליים (neonatal mice), לשאוב את מצע הגידול יחד עם תאים שאינם מודבקים, לשטוף את הצלחות פעם אחת עם DPBS, ולהוסיף מצע טרי לצלחות ולהחליף את המצע.

כל יומיים, ניתן לשמר בתרבית תאים שבודדו מלבבות עובריות או לבבות של רכיבים ניאונטליים למשך עד שלושה שבועות, בעוד שתאים שבודדו מלבבות של בוגרים ניתן לשמר בתרבית למשך עד 10 ימים. כדי לבודד תאים דמויי מלנוציטים מלב של עכבר בוגר, ראשית, שטפו את הלבבות שהוצאו ב-DPBS סטרילי המכיל אנטיביוטיקה בתוך מCב תרביות רקמה. לחצו קלות על הלב באמצעות פינצטת דיסקציה קמורה כדי להסיר דם שנותר, ולאחר מכן שטפו את הלב ב-DPBS פעם נוספת.

בשלב הבא, הסירו את העליות ואת הטבעת העליית-חדרית מהלבבים והניחו את דגימות הרקמה הגזוזות בצלחת בקוטר 35 מילימטר. חתכו את הלבבים לחתיכות קטנות בעזרת מספריים קמורים ופינצטה. הוסיפו לצלחת 6 עד 8 מיליליטר של תמיסת trypsin בריכוז 0.5% והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 עד 60 דקות.

לאחר הדגירה, חזור על השלבים שהודגמו קודם לכן כדי לקבל תרחיף של תאי לב בוגרים ולבצע זריעה כפי שנעשה לפני כן. בדוגמה זו, החץ הלבן מזהה את המלנוציט הקרדיאלי בשני הלוחות. שים לב כי ללא סיוע של הסמן הפלואורסצנטי, קשה לזהות את המלנוציט הקרדיאלי ולהבדילו מהמיוציטים העלייתיים המהדבקים לצלחית; ראש החץ התכלת מצביע על תאים עלייתיים שאינם הדבקים היטב לצלחית המוצגת כאן, שהם מלנוציטים קרדיאליים בריאים שבודדו מלב של עכבר רך.

הם פיתחו שלוחות דנדריטיות נרחבות ודומים מאוד למלנוציטים של העור. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בתוך מספר שעות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו ניתן לבודד תאי מלנוציטים חיים מהלב.

זה יהיה מתאים לניתוח פיזיולוגי ומולקולרי.