שיטה חדשה לתרבות והמקוטבת גירוי של רירית המעי Explants אדם
1 במאי 2013
אנחנו מציגים את שיטה חדשה לשמירה על רירית מעי אנושית בתרבות ובניטור של התגובה לסוגים שונים של גירויים על פני לפחות 24 שעות. בשיטה שלנו, את הקוטביות של הרקמה נשמר, מה שמאפשר לגירוי פיסיולוגי דרך מסלול הפסגה.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקות את המצב in vivo עבור גירוי של רירית המעי האנושית. דבר זה מושג על ידי הדבקת גליל חלול (cave cylinder) בצד האפיקלי של הרקמה כדי למנוע מהגירוי ליצור מגע בסיגולי (basolateral). כשלב שני, מיושם הגירוי, מה שיאפשר ניתוח של התגובה החיסונית שהתעוררה.
בשלב הבא, מסירים את הגירוי מהצד האפיקלי של הרקמה על מנת לשמור על חיוניותה למשך 24 עד 36 שעות. התוצאות המתקבלות עשויות להראות השפעות דיפרנציאליות של זני פרוביוטיקה שונים, בהתבסס על נתוני אימונוהיסטוכימיה, הפרשת ציטוקינים, ניתוח פרופיל וכדומה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תא ASIC, הוא שהיא מאפשרת ניתוח של עד 20 תנאים בו-זמנית.
שיטה זו מאפשרת להאריך את זמן התרבית עד ל-36 שעות, ובנוסף היא מספקת חומר מספיק לניתוחי קריאה שונים, כגון ניתוח DNA/RNA, אימונוהיסטוכימיה, הפרשת ציטוקינים וכדומה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות בתחום הפרוביוטיקה, ניתן להשתמש בה גם עבור טכנולוגיות אחרות וכדי לחקור את ההשפעה של אימונומודולטורים אחרים, כגון תרופות ביולוגיות, תרופות נוגדות דלקת וכיוצאים מזה. יש להוציא רקמת רירית של המעי מאנשים בריאים או מאנשים הסובלים ממחלת מעי דלקתית במהלך ניתוח.
לאחר כריתת הדגימה, העבירו אותה במהירות למעבדה תוך שמירה על קירור ב-HBSS עם פניצילין-סטפטומייצין. לאחר מכן, התחילו בשטיפת הרקמה ובבופר והסִירו כל חומר מזוכי (mesenteric material). לאחר מכן, הפרידו את שכבת הרירית (mucosa) מהתת-רירית (submucosa) באמצעות מספריים ופינצטה סטריליים, תוך השארת הרקמה בבופר HBSS.
בצלוחית פטרי, אין צורך להשאיר את הרקמה טבולה לחלוטין, אך יש לגעת במשטח הרירית כמה שפחות באמצעות הפינצטה. לאחר מכן, חתכו את הרירית לרצועות ברוחב של סנטימטר אחד לפחות ובאורך המקסימלי האפשרי, תוך שימוש בשני סקלפלים סטריליים באופן הדומה לחיתוך מזון. לאחר החיתוך, שטפו בעדינות ונקו את הרירית ב-HBSS נקי מסידן וממגנזיום.
לבסוף, פרסו את רצועות הרירית על צלחת פטרי כאשר הצדדים האפיקליים פונים כלפי מעלה. התחילו בהכנת TIS DMEM טרי. לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי של 10 centimeter בכ-30 milliliters של F-B-S-N-A ושקיעו לחלוטין רשת ברזל בתוך התמיסה.
השאירו את הפלטה פתוחה והניחו עליה גלילים מפלסטיק. כסו. כעת, שאבו 3 µL של דבק כירורגי באמצעות פיפטה ומריחו בזהירות את הדבק על אחד מגבולות הגליל מפלסטיק תוך כדי החזקתו בחוזקה בעזרת פינצטה. לאחר מכן, הניחו בעדינות את הגליל על הצד האפיקלי של הרירית, קרוב ככל האפשר לאחד מגבולות הפס, בזמן שהדבק מתייבש.
העבירו 850 עד 1000 µL של מצע למרכז הבאר בלוח הרקמות, והניחו את רשת הברזל על דפאות הבאר המרכזית. בעזרת שני סקלפלים, הסִירו את עודפי הרקמה משולי הגליל. כעת הרימו בעדינות את הגליל עם הרקמה הצמודה אליו, והניחו את הצד הבסולטרלי של הרקמה על רשת הברזל במרכז הלוח.
בשלב הבא, בצעו את גירוי הרקמה. החיל אתם את הגירויים הרלוונטיים במרכז הגליל הפלסטי בריכוז הרצוי. הימנעו מהפרעה לגליל או למשטח הרירית עם טיפ הפפיטה, וכסו באופן אחיד את המשטח בתוך הגליל.
כעת הדגרי את הרקמה למשך עד שלוש שעות. הדגרה למשך יותר משלוש שעות היא אפשרית אף היא, תוך שימוש בנפח קטן יותר של תמיסת הגירויים. לאחר ההדגרה, הסירי את הגירויים מהמשטח האפיקלי של הרקמה, אך אל תחליפי אותם במצע טרי.
הוספת מצע תגרום לחנק של הרקמה. כעת מלאו את צנצנת החמצן בלחץ של אטמוספירה אחת של 100% oxygen למשך 24 שעות של זמן תרבית. היזהרו תמיד בעת הטיפול במכל החמצן וודאו כי סגרתם אותו כראוי לאחר השימוש.
לאחר תרבית הגירוי של 24 שעות, השתמש בסכין מנתח כדי להוציא בזהירות את הגליל מהרקמה על ידי גירוד עדין של הדבק. לאחר מכן, עבור בדיקות IHC או אימונופלורסנציה, קבע את הרקמה. עבור ניתוח ביטוי גנים או חלבונים, בצע הקפאה מהירה של הרקמה בחנקן נוזלי.
בשלב הבא, אספו את המצע הצמיחה הבסיסי (basal lateral medium) לצורך ניתוח פרופיל הפרשת ציטוקינים. לאחר מכן, העבירו את המצע למבחנת צנטריפוגה והשקיעו את השאריות בהתאם לפרוטוקול המתואר. ריריות מעי אנושיות בריאות וכאלו עם IBD תורבדו למשך 24 שעות לפחות, תוך שמירה על חיוניות הרקמות.
דבר זה היה אפשרי רק אם לפחות 85% מזמן התרבית התרחש בסביבה עשירה בחמצן. רירית שגודלה בשיטה קונבנציונלית אינה מגיבה באותה מידה. לאחר מכן, הרקמה הבריאה עוררה באמצעות סלמונלה פולשנית פרו-דלקתית.
שעתיים לאחר ההחדרה, כבר ניתן היה להבחין בהרס של השכבה העליונה של האפיתל בהשוואה לקבוצות הביקורת. לאחר 24 שעות, הניוון הפך לנרחב למדי. דיון מעמיק יותר על יישומים ניסיוניים עם תוצאות שפורסמו מופיע בכתב היד כתוב לאחר פיתוחו.
טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הגסטרואנטרולוגיה ללמוד על האינטראקציה בין המאחס למיקרובים במערכת העיכול. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן השמרת רירית מעי אנושית בתרבית וגירויה באופן מקומי. זכרו כי עבודה עם דגימות אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי הזהירות הנדרשים בעת ביצוע פרוצדורה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשנית לשימור רירית מעי אנושית בתרבית, תוך ניטור תגובתה לגירויים למשך 24 שעות לפחות. הטכניקה משמרת את פולריות הרקמה, ובכך מאפשרת גירוי פיזיולוגי דרך הנתיב האפיקלי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
רקע
- רירית המעי האנושית ממלאת תפקיד מכריע בתגובה החיסונית.
- לשיטות הקיימות לחקר תגובות ריריות יש מגבלות.
- שמירה על חיות הרקמה חיונית לצורך ניתוח מדויק.
- לזנים של פרוביוטיקה יכולות להיות השפעות שונות על תגובות חיסוניות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה המדמה תנאי in vivo של רירית המעי.
- ניתוח תגובות חיסוניות המעוררות על ידי גירויים שונים.
- מתן אפשרות לניתוח סימולטני של מספר תנאים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הדבקת צילינדר חלול (cave cylinder) בצד האפיקלי של הרקמה.
- החלת גירויים לצד האפיקלי בלבד.
- הסרת הגירויים לשמירה על חיות הרקמה למשך 24-36 שעות.
- ניתוח התגובה החיסונית באמצעות אימונוהיסטוכימיה ואפיון ציטוקינים.
תוצאות עיקריות
- הדגימה תגובות חיסוניות דיפרנציאליות לזנים שונים של פרוביוטיקה.
- הראתה את היתרונות של השיטה החדשה על פני טכניקות קיימות.
- סיפקה תובנות לגבי פרופילים של הפרשת ציטוקינים.
- אפשרה ניתוח של עד 20 תנאים בו-זמנית.
מסקנות
- השיטה החדשה מדמה ביעילות תנאי in vivo עבור רירית המעי.
- היא מאפשרת ניתוח מקיף של תגובות חיסוניות.
- טכניקה זו עשויה לשפר את ההבנה של אימונולוגיה של הריריות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תרבית של נתחים (explants) מרירית מעי אנושית עם גרייה מקוטבת נותנת מענה לפער קריטי במידול האינטראקציות המורכבות בין המאכסן למיקרוביום ובין המאכסן למערכת החיסון במעי. מערכת זו מאפשרת בחינה רלוונטית פיזיולוגית של חומרים אימונו-מודולטוריים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בשלבי גילוי מוקדמים ובמחקר תרגומי. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות בנוגע לתיקי פיתוח על ידי אספקת נתונים חסונים ורלוונטיים לבני אדם לצורך הערכת מועמדים במסלולי פיתוח בתחומי מערכת העיכול והאימונולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה ישירה של השפעות אימונומודולטוריות בהקשר של רקמה אנושית טבעית.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי שימור התנאים של המיקרוביוטה במארח in situ.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות המשפיעות על חסינות וסבילות רירית.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירת מועמדים באינדיקציות הקשורות למעי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה למדידה כמותית וניתנת לשחזור של הפרשת ציטוקינים ותגובות חיסוניות.
- מאפשרת הערכה סימולטנית של עד 20 תנאים, ובכך מעלה את התפוקה לסריקת תרכובות או פרוביוטיקה.
- מספקת גירוי סטנדרטי השומר על פולריות לצורך עקביות הבדיקה.
- מאפשרת קריאות חזקות של אימונוהיסטוכימיה וביטוי גנים עבור תהליכי עבודה המשכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את הבדיקות הפרה-קליניות לרקמה ולמיקרו-סביבה חיסונית הרלוונטיות למחלה בבני אדם.
- תומך בגילוי ובתיקוף של סמנים ביולוגיים ברירית במצב בריא ובמצב מחלה.
- מגשר בין שלב הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי שמירה על רציפות תרגומית באפיון התגובה החיסונית.
- מפחית את ההסתמכות על מודלים בעלי חיים בעלי יכולת ניבוי נמוכה יותר למחקרי אימונולוגיה של המעי.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
שיטה זו לתרבית רגמנים (explant culture) משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני, ומאפשרת בדיקת השערות, הפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות והתאמת ביומרקרים תרגומיים בתוכניות מחקר בתחומי מערכת העיכול והאימונולוגיה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בחקירה מונחית-היפותזה של אינטראקציות בין מאחס למיקרובים ושל אינטראקציות חיסוניות ברקמה אנושית.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור להערכת תרכובות או פרוביוטיקה.
- אנליזה: מאפשר קריאות מרובות (multiplexed), כולל פרופיל ציטוקינים, אימונוהיסטוכימיה וביטוי גנים.
- מחקר תרגומי: שומר על הרלוונטיות למחלה ועל רציפות מהשלב הגילוי ועד להערכה פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה לשימוש חוזר לבדיקה של מועמדים תרפויטיים ואימונו-מודולטוריים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של אימונולוגיה של המעי.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הטיפול ברקמה והסטימולציה, ובכך תומך בחזוריות ובסקילביליות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך התקדמות (go/no-go) וקידום תיק פיתוח יעיל מבחינת הון.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכון של מועמדים בעלי נתונים רלוונטיים לבני אדם.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול ברקמות אנושיות ובטכניקות תרבית ex vivo.
- נדרשת גישה לדגימות כירורגיות ולתשתית בטיחות ביולוגית מתאימה.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולי הכנת הרקמות והסטימולציה.
- ייתכן שיידרש התאמה למצבים מחלתיים שונים או למקורות רקמה שונים.
- דרישות החיוניות והחממון מגבילות את משך התרבית ל-24–36 שעות.
