Name: שיטה חדשה לתרבות והמקוטבת גירוי של רירית המעי Explants אדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: למד שיטה חדשה לתרבת רירית המעי האנושית עם שמירה על קוטביות רקמית וגירוי אפיקלי. טכניקה זו מאפשרת ניתוח תגובות חיסוניות למשך 24-36 שעות ומקבילה של עד 20 תנאים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאריקה Mileti לתמיכה טכנית מצוינת ואנטוניו די ד&quot;ר Sabatino למתן החמצן לתאים. מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתכנית ה -7 של האיחוד האירופי המסגרת (IBDase, ERC: Dendroworld) וFondazione Cariplo למר ותמיכה על ידי רשת מארי קירי בינלאומית הכשרת ניידות (Cross-Talk, אין הסכם מענק: 21,553-2) כדי KT.

1. קבלת והכנת רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה (בריא או IBD רירית) מתקבלת במהלך ניתוח. ברגע שהוא נכרת העברת הדגימה למעבדה בהקדם האפשרי, להשאיר אותו ב+ / Mg + חיץ HBSS Ca + + ללא תוספת פן / סטרפטוקוקוס על 4 מעלות צלזיוס או על קרח. </li></ol> * גודל הדגימה תלוי בזמינות של הרקמה: חלק מהרקמה שהושגה, הוא אך ורק את מה שאין צורך לאבחון ויכול להשתנות במידה רבה בין נבדקים בריאים ומחלת מעי דלקתי. רקמה בריאה הוא נכרת מחולים שעברו ניתוח לטיפול בסרטן מעי גס. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמות בעדינות ולנקות אותו מכל חומר mesenteric. הפרד את השכבה רירית מsubmucosa באמצעות מספריים מלקחיים סטריליים, תוך שמירה על הרקמה בחיץ HBSS בצלחת פטרי (לא בהכרח immerged). לגעת במשטח הרירי עם המלקחיים קטן ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים רירית בפסי ג לפחות 1מ &#39;רוחב וזמן רב ככל האפשר. השתמש בשני אזמלים סטריליים, הרבה כאילו היית חיתוך האוכל שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף בעדינות לנקות את הרירית בHBSS ולהרחיב אותו על צלחת פטרי עם צד apical יפנה כלפי מעלה. </li></ol> 2. הרכבה רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום חדש (tisDMEM). השתמש DMEM בתוספת גלוטמין (2 מ&quot;מ) וNaPyr (1 מ&quot;מ), ולהוסיף 15% FBS-Na (סרום שור עוברי - בצפון אמריקה), 1% ITS-X ו-EGF 200 ng / ml בעת השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא צלחת פטרי 10 ס&quot;מ עם שאר FBS-Na (להשתמש בכ -30 מ&quot;ל, כך שרשתות מתכת תהיה שקועות לחלוטין) ולהטביע את רשתות המתכת. שמור את הצלחת לפתוח ולתמוך בגלילי הפלסטיק על הברז שלה. </li></ol> * רשתות המתכת עשויות ברזל. הרשת היא בצורת ריבוע עם צד של 0.5 מ&quot;מ. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 3 μl של דבק כירורגי עם 10 או 20 פיפטה μl. יש ליישם אותה בזהירות לאחד מגבולותיה של גליל פלסטיק בעת החזקתו fIRM עם המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות את הגליל בצד הפסגה של הרירית, קרוב לאחד מגבולות הרצועה ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתת זמן הדבק לצרף את הגליל על הרקמה בתקיפות, להכין צלחת תרבות איבר המרכז היטב: לוותר על 850 מיליליטר μl-1 של מדיום במרכז היטב ותומך ברשת המתכת בשולי של הצלחת המרכזית היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הרקמות עודפת מהגבולות של הגליל באמצעות שני אזמלים סטריליים כמו קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בעדינות את הגליל עם הרקמה המצורפת ומניח בצד basolateral על רשת המתכת במרכז הצלחת. </li></ol> 3. גרייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בגירויים על פי בחירתך בריכוז המועדף עליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הנפח מתאים במרכז גליל הפלסטיק מבלי להפריע את הצילינדר או את פני השטח הרירי עם קצה פיפטה. ודא שעוצמת הקול שבחרת אחיד מכסה את פני השטח בתוך הצילינדר. בתוךכרכי dicated: גליל פלסטיק גדול: 200 μl μl 100: גליל פלסטיק בינוני גליל פלסטיק קטן: 50 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לתקופה של עד 3 שעות בחממה קונבנציונלית. </li></ol> * אם ברצונך דגירה של נקודות זמן ארוכות יותר, הקפד להשתמש בנפח קטן בהרבה של גירויים (10-20 μl) וישירות למקם את הרקמה באווירה של 100% O 2 בלחץ של כספומט 1 (ראה 3.5) . <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בינונית עם הגירויים מחוץ למשטח הפסגה של הרקמה ולא להחליף עם מדיום חדש, משום שהרקמות אינה מקבלים מספיק O 2 אם שכבה עבה של מדיום על פני הפסגה מונעת חילוף גזים. מכסה את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרקמה באווירה של 100% O 2 בלחץ של כספומט 1. </li></ol> 4. קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של זמן התרבות כולל (± 2.5 שעות) להסיר את הגליל מה בזהירותרקמת הדואר בעזרת דבק בעדינות מגרד אזמל ולאחסן אותו בהתאם לניתוח הרצוי (לתקן אימונוהיסטוכימיה ו / או מבחני immunofluorescence, או הקפאת הצמד בN2 הנוזלי לטיהור RNA ופרופיל ביטוי גן או טיהור חלבונים ומבחני מערב למחוק ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למסוק בינוני basolateral לפרופיל הפרשת ציטוקינים. צנטריפוגה ב 8000 סל&quot;ד במשך 7 דקות לפסולת גלולה, להעביר את supernatant בצינור Eppendorf (לחלופין aliquot) ולאחסן באופן מיידי ב -20 ° C. </li></ol> * אם אתה רוצה לשמור על supernatants למשך זמן ארוך יותר, לאחסן אותם ב -80 ° C.

<ol><li>Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ex+vivo+response+of+human+intestinal+mucosa+to+enteropathogenic+Escherichia+coli+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection.</a> Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).</li>
<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. , (2012).</li>
<li>Tsilingiri, K., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Should+probiotics+be+tested+on+ex+vivo+organ+culture+models%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models?</a> Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).</li>
<li>Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+immunomodulatory+properties+of+three+probiotic+strains+of+Lactobacilli+using+complex+culture+systems%3A+prediction+for+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy.</a> PLoS One. 4, e7056(2009).</li>
<li>Cencic, A., Langerholc, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cell+models+of+the+gut+and+their+applications+in+food+microbiology--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review.</a> Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).</li>
<li>te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+appraisal+of+the+current+practice+in+murine+TNBS-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).</li>
<li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J. Anat. 134, 459-469 (1982).</li>
<li>Browning, T. H., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+of+mucosal+biopsies+of+human+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine.</a> J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).</li>
<li>Besselink, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+prophylaxis+in+predicted+severe+acute+pancreatitis%3A+a+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 371, 651-659 (2008).</li>
<li>Lakhdari, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+NF-kappaB+modulation+capabilities+within+human+intestinal+commensal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356(2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הצורך בדגמים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שבו ניתן לבדוק את הטיפול ברירית מעי אנושי כדין כבר הדגיש ארוך. חוקרים רבים זיהו חפצים ופגמים פוטנציאליים בשניהם תא 5 ומודלי עכבר 6 השתמש עד כה למטרה זו. ואכן, למרות שנתונים פרה מבטיחים לעתים קרובות מתקבלים, אלה רק לעתים נדירות לתרגם לתועלת קלינית משמעותית. השיטה המתוארת בעבודה זו, מציגה עיבוד פשוט יחסית, אך יעיל וחדשני לפרוטוקולים קיימים 7, 8</su...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;חזק&gt;ריאגנטים&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HBSS בריכוז 10X</td><td>Eurocalne</td><td>ECM4006XL</td><td></td></tr><tr><td>פניצלין/סטריפטומייצין</td><td>Lonza</td><td>DE17602E</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12614</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Na</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>100X ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Tebu-bio</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Lonza</td><td>BE17605E</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו שאינן חיוניות 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NaPyr</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;חזק&gt;חומרים&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>שליחוני שיבוט 6x8 מ"מ</td><td>BellCo</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>גלילי שיבוט 8x8 מ"מ</td><td>BellCo</td><td>2090-0080</td><td></td></tr><tr><td>שקיקי שיクלוניקה 10x10 מ"מ</td><td>BellCo</td><td>2090-01010</td><td></td></tr><tr><td>רשתות מתכת</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת לתרבית איברים עם באר מרכזית</td><td>BD Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>דבק כירורגי (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>צנצנות חמצן</td><td>הכנה ביתית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכלי חמצן</td><td>חיטוי אוויר ונוזלים&amp;#224;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה חדשה לתרבות והמקוטבת גירוי של רירית המעי explants אדם

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

דגמים אחדים קיימים כיום לדמות מיקרו הסביבה של המעי האנושי המורכב, שבו מגוון רחב של יחסי גומלין יתקיים מציאותי. הומאוסטזיס תקין ישירות תלוי באינטראקציות הללו, כפי שהם מעצבים את סובלנות גרימת תגובה חיסונית נגד אנטיגנים מזון כולו ובו בזמן ההרכבה תגובה חיסונית יעילה כנגד חיידקים פתוגניים לבלוע בטעות עם אוכל. הומאוסטזיס מעיים נשמר גם דרך אינטראקציות מורכבות שונות בין החיידקים (כולל זני חיידקים מועילים הקשורים לאוכל) והמארח, שמסדירים את הקובץ המצורף / השפלה של ריר, את הייצור של פפטידים מיקרוביאלית על ידי מחסום אפיתל, ו&quot; החינוך &quot;של תאי אפיתל &#39;ששולט פנוטיפ tolerogenic או immunogenic של ייחודיים, מעיים תושבי תאי הלימפה &quot;אוכלוסיות. אינטראקציות אלה היו עד כה קשים מאוד לשחזר עם מבחני חוץ גופיתאו באמצעות שורות תאים בתרבית או תאי דם היקפיים mononuclear. בנוסף, מודלים עכבר שונים באופן מהותי ברכיבים של רירית המעי (ארגון שכבת ריר, קהילת חיידקי commensal) ביחס למעי האדם. לכן, מחקרים של מגוון רחב של טיפולים שהביאו במרפאות לתנאים חשובים הקשורים ללחץ או פתולוגי כגון תסמונת מעי רגיז, מחלות מעי דלקתיות או סרטן מעי גס היו קשים לביצוע. כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו מערכת חדשנית המאפשרת לנו לעורר explants של רירית מעי אדם ששומר עליהם באתרו על ידי מיזוג חיידקי המארח והתגובה חיסונית, באופן קוטבי. גירוי הפסגה מקוטב הוא בעלת חשיבות רבה לתוצאות שהושרו תגובה חיסונית. הוכח שוב ושוב את אותם גירויים שיכולים לייצר תגובות שונות לחלוטין כאשר הם עוקפים את פני הפסגה של EPI המעייםthelium, מגרה את תאי האפיתל basolaterally או לבוא במגע ישיר עם רכיבי propria lamina, מיתוג פנוטיפ מtolerogenic לimmunogenic וגורם לדלקת מיותרת ומוגזמת באזור. השגנו גירוי מקוטב על ידי הדבקת גליל מערה שתחם את האזור של גירוי על פני הפסגה של הרירית כפי שיפורט בפרוטוקול. אנחנו השתמשנו במודל זה כדי לבחון, בין יתר, השפעות שונות של שלושה זני לקטובצילוס שונים. אנו מראים כי מערכת המודל הזה היא חזקה מאוד כדי להעריך את מאפייני המערכת החיסונית של פרוביוטיקה בתנאים בריאים ומחלה.

אנחנו הצלחנו לשמור על רירית מעי אדם בריאה וIBD בתרבות במשך לפחות 24 שעות שמירה על שלומה של הרקמה. בהתאם לתצפיות קודם 1, זה היה אפשרי רק אם רוב זמן התרבות (לפחות 85% בסך הכל) התקיים בO 2, כמו הרקמה לא לשרוד במשך 24 שעות בחממות קונבנציונליות (איור 2). יש לנו גם הראו כי תגובות שונות של explants ניתן להבחין במודל זה תלוי בקוטביות של הגירוי (הפסגה לעומת basolateral) וimmunogenicity של הגירויים 2,3. <p class="jove_content" style=";te...

אנחנו מציגים את שיטה חדשה לשמירה על רירית מעי אנושית בתרבות ובניטור של התגובה לסוגים שונים של גירויים על פני לפחות 24 שעות. בשיטה שלנו, את הקוטביות של הרקמה נשמר, מה שמאפשר לגירוי פיסיולוגי דרך מסלול הפסגה.

שיטה חדשה לתרבות והמקוטבת גירוי של רירית המעי Explants אדם

כיום קיימים מודלים מעטים המסוגלים לדמה באופן ריאליסטי את המיקרו-סביבה המורכבת של מעי האדם, שבה מתרחשים מגוון של אינטראקציות. ...נאות

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לחקות את המצב in vivo עבור גירוי של רירית המעי האנושית. דבר זה מושג על ידי הדבקת גליל חלול (cave cylinder) בצד האפיקלי של הרקמה כדי למנוע מהגירוי ליצור מגע בסיגולי (basolateral). כשלב שני, מיושם הגירוי, מה שיאפשר ניתוח של התגובה החיסונית שהתעוררה.בשלב הבא, מסירים את הגירוי מהצד האפיקלי של הרקמה על מנת לשמור על חיוניותה למשך 24 עד 36 שעות. התוצאות המתקבלות עשויות להראות השפעות דיפרנציאליות של זני פרוביוטיקה שונים, בהתבסס על נתוני אימונוהיסטוכימיה, הפרשת ציטוקינים, ניתוח פרופיל וכדומה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תא ASIC, הוא שהיא מאפשרת ניתוח של עד 20 תנאים בו-זמנית.שיטה זו מאפשרת להאריך את זמן התרבית עד ל-36 שעות, ובנוסף היא מספקת חומר מספיק לניתוחי קריאה שונים, כגון ניתוח DNA/RNA, אימונוהיסטוכימיה, הפרשת ציטוקינים וכדומה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות בתחום הפרוביוטיקה, ניתן להשתמש בה גם עבור טכנולוגיות אחרות וכדי לחקור את ההשפעה של אימונומודולטורים אחרים, כגון תרופות ביולוגיות, תרופות נוגדות דלקת וכיוצאים מזה. יש להוציא רקמת רירית של המעי מאנשים בריאים או מאנשים הסובלים ממחלת מעי דלקתית במהלך ניתוח.לאחר כריתת הדגימה, העבירו אותה במהירות למעבדה תוך שמירה על קירור ב-HBSS עם פניצילין-סטפטומייצין. לאחר מכן, התחילו בשטיפת הרקמה ובבופר והסִירו כל חומר מזוכי (mesenteric material). לאחר מכן, הפרידו את שכבת הרירית (mucosa) מהתת-רירית (submucosa) באמצעות מספריים ופינצטה סטריליים, תוך השארת הרקמה בבופר HBSS.בצלוחית פטרי, אין צורך להשאיר את הרקמה טבולה לחלוטין, אך יש לגעת במשטח הרירית כמה שפחות באמצעות הפינצטה. לאחר מכן, חתכו את הרירית לרצועות ברוחב של סנטימטר אחד לפחות ובאורך המקסימלי האפשרי, תוך שימוש בשני סקלפלים סטריליים באופן הדומה לחיתוך מזון. לאחר החיתוך, שטפו בעדינות ונקו את הרירית ב-HBSS נקי מסידן וממגנזיום.לבסוף, פרסו את רצועות הרירית על צלחת פטרי כאשר הצדדים האפיקליים פונים כלפי מעלה. התחילו בהכנת TIS DMEM טרי. לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי של 10 centimeter בכ-30 milliliters של F-B-S-N-A ושקיעו לחלוטין רשת ברזל בתוך התמיסה.השאירו את הפלטה פתוחה והניחו עליה גלילים מפלסטיק. כסו. כעת, שאבו 3 µL של דבק כירורגי באמצעות פיפטה ומריחו בזהירות את הדבק על אחד מגבולות הגליל מפלסטיק תוך כדי החזקתו בחוזקה בעזרת פינצטה. לאחר מכן, הניחו בעדינות את הגליל על הצד האפיקלי של הרירית, קרוב ככל האפשר לאחד מגבולות הפס, בזמן שהדבק מתייבש.העבירו 850 עד 1000 µL של מצע למרכז הבאר בלוח הרקמות, והניחו את רשת הברזל על דפאות הבאר המרכזית. בעזרת שני סקלפלים, הסִירו את עודפי הרקמה משולי הגליל. כעת הרימו בעדינות את הגליל עם הרקמה הצמודה אליו, והניחו את הצד הבסולטרלי של הרקמה על רשת הברזל במרכז הלוח.בשלב הבא, בצעו את גירוי הרקמה. החיל אתם את הגירויים הרלוונטיים במרכז הגליל הפלסטי בריכוז הרצוי. הימנעו מהפרעה לגליל או למשטח הרירית עם טיפ הפפיטה, וכסו באופן אחיד את המשטח בתוך הגליל.כעת הדגרי את הרקמה למשך עד שלוש שעות. הדגרה למשך יותר משלוש שעות היא אפשרית אף היא, תוך שימוש בנפח קטן יותר של תמיסת הגירויים. לאחר ההדגרה, הסירי את הגירויים מהמשטח האפיקלי של הרקמה, אך אל תחליפי אותם במצע טרי.הוספת מצע תגרום לחנק של הרקמה. כעת מלאו את צנצנת החמצן בלחץ של אטמוספירה אחת של 100% oxygen למשך 24 שעות של זמן תרבית. היזהרו תמיד בעת הטיפול במכל החמצן וודאו כי סגרתם אותו כראוי לאחר השימוש.לאחר תרבית הגירוי של 24 שעות, השתמש בסכין מנתח כדי להוציא בזהירות את הגליל מהרקמה על ידי גירוד עדין של הדבק. לאחר מכן, עבור בדיקות IHC או אימונופלורסנציה, קבע את הרקמה. עבור ניתוח ביטוי גנים או חלבונים, בצע הקפאה מהירה של הרקמה בחנקן נוזלי.בשלב הבא, אספו את המצע הצמיחה הבסיסי (basal lateral medium) לצורך ניתוח פרופיל הפרשת ציטוקינים. לאחר מכן, העבירו את המצע למבחנת צנטריפוגה והשקיעו את השאריות בהתאם לפרוטוקול המתואר. ריריות מעי אנושיות בריאות וכאלו עם IBD תורבדו למשך 24 שעות לפחות, תוך שמירה על חיוניות הרקמות.דבר זה היה אפשרי רק אם לפחות 85% מזמן התרבית התרחש בסביבה עשירה בחמצן. רירית שגודלה בשיטה קונבנציונלית אינה מגיבה באותה מידה. לאחר מכן, הרקמה הבריאה עוררה באמצעות סלמונלה פולשנית פרו-דלקתית.שעתיים לאחר ההחדרה, כבר ניתן היה להבחין בהרס של השכבה העליונה של האפיתל בהשוואה לקבוצות הביקורת. לאחר 24 שעות, הניוון הפך לנרחב למדי. דיון מעמיק יותר על יישומים ניסיוניים עם תוצאות שפורסמו מופיע בכתב היד כתוב לאחר פיתוחו.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הגסטרואנטרולוגיה ללמוד על האינטראקציה בין המאחס למיקרובים במערכת העיכול. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן השמרת רירית מעי אנושית בתרבית וגירויה באופן מקומי. זכרו כי עבודה עם דגימות אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי הזהירות הנדרשים בעת ביצוע פרוצדורה זו.

a-novel-method-for-culture-polarized-stimulation-human-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: In, J. G. ואחרים. מונולאידים של קולונואידים אנושיים לחקר אינטראקציות בין פתוגנים, קומנסלים ואפיתליום מעי של המארח. J. Vis. Exp. (2019).הסרטון הזה מדגים את התהליך לגידול תאי אפיתל שמקורם במעי הגס על מערכת טרנסוול מצופה קולגן, ליצירת שכבה מונולקולית שמייצרת ריר שמדמות את מחסום המעי ומאפשרת מחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן.

יצירת שכבת קולונואיד אנושית עם פונקציית מחסום לחקר אינטראקציות בין מארח לפתוגן

בסרטון זה, אנו מתארים את המתודולוגיה להקמת מערכת תרבית איברי מעיים ex vivo כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מקטעי רקמת מעיים של עכבר לבין חיידקי מעיים ספציפיים. המכשיר מורכב משני זוגות של יציאות קלט-פלט, הראשון מחבר את לומן רקמת המעי ומספק את המתלה החיידקי הספציפי לתוכו, והשני מספק ברציפות מדיה לבארות המכשיר כדי לשמור על כדאיות רקמת ex vivo.

מערכת תרבית איברי מעיים Ex Vivo לחקר אינטראקציות מיקרוביוטה מארחת

אנו מתארים שיטה להקמת אנטרואידים אנושיים מקריפטות מעי דק וקולונואידים מקריפטות המעי הגס שנאספו הן מרקמות כירורגיות והן מביופסיות. במאמר מתודולוגי זה, אנו מציגים את אופני התרבות החיוניים לצמיחה ותחזוקה מוצלחת של אנטרואידים וקולונואידים אנושיים.

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

כאן, פרוטוקול למסוק, לתחזק ולטפל organoids הקטנה עכבר מעיים עם דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) ו חיידקי ליסטריה מתואר, כמו גם דגש על ביטוי גנים וטכניקות נורמליזציה ראויות חלבון.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

אנו מתארים פרוטוקול במבחנה Microbiome במעיים שיתוף תרבות villi מעיים במשך תקופה ארוכה באמצעות אדם בטן-על-שבב מערכת microphysiological.

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים. תרבויות מעיים העיקריות אלה מאפשרות החקירה של מסלולי איתות שבבסיס הפרשת פפטיד בטן באמצעות מספר הטכניקות.

תרבויות עיקריות מעורבות של Murine מעי דק המיועד לחקר הפרשת הורמון גוט וההדמיה של תא חי תאי Enteroendocrine

כאן, אנו מציגים פרוטוקול התרבות האנושית enteroid או monolayers colonoid שיש להם פונקציה נפגע המחסום ללמוד אינטראקציות אפיתל-microbiota מארח ברמה התאית וביוכימי.

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום את הבידול של תאים M בתאי גזע האדם הנגזר ileal monolayers ושיטות כדי להעריך את התפתחותם.

המושרה בידול של תאים כמו תא בתאי גזע האדם-הנגזר הנגזרת מונאואיד Monolayers

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים המאפשרים מידול של אינטראקציות ספציפיות למעיים. מונו-שכבתי מעיים שמקורם באורגנוידים ותרבויות ממשק נוזלי אוויר (ALI) מאפשרות ליצור אפיתליה מובחנת היטב הנגישה הן מצדי הזוהר והן מצד בזולטר, בעוד שאורגנואידים מעיים הפוכים בקוטביות חושפים את הצד האפי שלהם והם נוחים לתפוקה גבוהה.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

המחקר מציג שיטה לחקר זיהום חיידקי במבחנה באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע ברקמה. הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל ולהבחין בין אורגנידים בשני ממדים, להדביק אותם ב-Escherichia coli פולשנית דבקה, ולהעריך קריאות מפתח, כולל פריצת מחסום אפיתליאלי, הדמיית זיהומים ותגובת RNA אפיתליאלית.

תרבית אורגנית דו-ממדית על תמצית פולשת או ממברנת בסיס לחקר אינטראקציות בין מארח לחיידקים

למד שיטה חדשה לתרבת רירית המעי האנושית עם שמירה על קוטביות רקמית וגירוי אפיקלי. טכניקה זו מאפשרת ניתוח תגובות חיסוניות למשך 24-36 שעות ומקבילה של עד 20 תנאים שונים.

שיטה חדשה לתרבות והמקוטבת גירוי של רירית המעי Explants אדם

גלה סרטונים נוספים