Name: זלוף intravascular של דיו שחור פחם מאפשר הדמיה אמינה של כלי מוחות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: למד שיטה לדימוי כלי דם מוחיים בעכברים באמצעות דיו פחם שחור לצביעה תוך-ורידית. טכניקה זו מאפשרת הדמיה ברמת ניגוד גבוהה ושיפור השחזור במחקר מוחי-כלי דמי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לריטה Kaltwasser על סיועה המצוין הטכני ומאהש קומאר עומד לספר לארגן הכנת צילומי וידאו.

1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים בוצעו על פי הנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הרשויות המקומיות. לכל הניסויים, C57Bl6 / י עכברים ברי סוג, ApolipoproteinE - / - (ApoE KO) וSV129 עכברים (12-16 שבועות ישנים, משקל גוף, גרם 26-30 5-6 חיות לקבוצת ניסוי) היו בשימוש. </li></ol> 2. צביעת כלי מוחות עם אטקס הצבעוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת של דיו 25 μl פחם שחור (הרליץ, גרמניה) עם 0.5 מ&quot;ל של תרכובת לטקס (Pebeo, צרפת) בשעת 1:20 ביחס צינור EP ולחמם את התערובת על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. לאסוף את התערובת במזרק מ&quot;ל 2 עם מחט של 28-30G לפני מרדים בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס 50 מ&quot;ג של אבקת הידרוכלוריד papavarine לתוך 1 מ&quot;ל של תמיסת מלח הרגיל סטרילי. אסוף את הפתרון במזרק אינסולין. לנתק את המחט ממזרק אינסולין אחר סטרילי. הנח מחט זה בסוף 20 גמ &#39;PE10 צינור ארוך. עכשיו לצרף צינור PE10 זה במחט של מזרק האינסולין המכיל פתרון הידרוכלוריד papavarine להיות מוזרקים דרך וריד הירך כדי להבטיח vasodilatation ומילוי תקין של כלי דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני מזרקי אינסולין עוד כל מ&quot;ל מכיל 1 מתוך תמיסת מלח. מזרקי אינסולין לאפשר אספקה ​​חלקה של הנוזל שהוזרק במיקום מדויק. עם זאת, בשל צמיגות גבוהה של לטקס, חלופה 1 מיליליטר מזרקים עם מחטים נשלפות רחבות יותר יש להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את כל המזרקים והמכשירים מבתרים מעוקרים הקרובים לשלב ההפעלה. פרש יריעת דרייפר כירורגית סביב במת המבצע. שלב הפעולה צריך להיות מואר מספיק ומיקרוסקופ ניתן להשתמש במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו למדוד את משקל גופו של עכבר C57Bl6 / י ולאחר מכן לגרום להרדמה של 5% מתאדים isoflurane ב70% N 2 O ו 30% O 2. המשך להרדמה של 1% מisoflurane מתאדה. לאחר positionin התקיןגרם של העכבר על הגב וקיבועה של הגפיים, להעריך את עומק ההרדמה. ואז לחתוך את העור מעל וריד ירך שמאל ולאתר את הווריד. הכנס את הקצה החד של המחט שהונחה על PE10 צינורית ולהזריק פתרון הידרוכלוריד papavarine לאט בקצב של 100 לדקה μl (משקל 50 מ&quot;ג / קילו משקל גוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, לחתוך את חלל הבטן ולנקב את הסרעפת. חותך את הצלעות לחשוף את הלב מבלי לפגוע או חבורותיו. קליפ אב עורקים החזי יורד עם כ מלקחיים עורקים. הפוך קיצוץ חד בעלייה הימנית כדי לאפשר לדם הוורידים לנקז החוצה. להזריק 2 מ&quot;ל של תמיסת מלח לתוך החדר השמאלי, ואחריו על ידי ההזרקה באופן ידני עם הלטקס הצבעוני לחץ קל על 18-20 שניות. השתמש במזרקים הממולאים מראש בזה אחר זה. הימנע מהזרקה כל בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה של לטקס, לעזוב את החיים למשך 5 דקות. לערוף את החיה ולהסיר את המוח כולו בזהירות. תשמרו על עצמך טוב שלא לפגוע בכלי הדם ובארכיטקטורת קורטהx תוך הסרת עצם הגולגולת וקרומי המוח. מניח את המוח בצלחת תרבית תאים 60 מ&quot;מ המכילה 6-8 מ&quot;ל של 4% PFA לקחת תמונה. הנח שליט מדידה תחת הצלחת השקופה. קח את התמונות בהגדלה של 25x גב ופני שטח הגחון של המוח עם מצלמה המחוברת למיקרוסקופ. תמונות יש לקחת בזווית של 90 מעלות בין צלחת הפטר והאובייקטיבי במיקרוסקופ כדי לכמת את המרחק המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך בחי 4-5 נוספות. </li></ol> 3. צביעת כלי מוחות עם תערובת של סוגי דיו פחם שחורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשוות את התוצאה של הכתמת לטקס מבוססת מוחות כלי דם בפרוטוקול שלנו, להכין תערובת של 100 μl של הרליץ Stempelfarbe דיו (CB1) עם 900 μl של שקנאי Scribtol שוורץ דיו (CB2) בצינור 1.5 מ&quot;ל EP. הכן שני צינורות EP לעשות נפח כולל של תערובת 2 מ&quot;ל של CB1 ו CB2 ביחס 01:09. לאסוף את התערובת בשני מזרקי אינסולין נפרדים (1מ&quot;ל כל אחד). מכסה את המזרקים ולמקם אותם באמבט מים כדי לחמם עד 37 מעלות צלזיוס איסוף 2 מ&quot;ל של תמיסת מלח במזרקי אינסולין 2 נוספים, ולמקם אותם באמבט מים גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם את החיה וחוזר על אותו התהליך כפי שתואר לעיל, פרט להזרקת hydrochloride papavarine. בעקבות זריקה של 2 המ&quot;ל salaine לחדר השמאלי, מזריק תערובת 2 מ&quot;ל של צבע שחור פחם במקום לטקס הצבעוני. לבצע את הזריקות ביד עם לחץ קל על 18-20 שניות למ&quot;ל. קליפ אב העורקים החזי יורד לפני את הזריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את החיה, הסר את המוח ולצלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימור לטווח הארוך של המוח, לשים את המוח ב4% PFA הלילה אחרי דגירה עם סוכרוז בריכוז גובר בהדרגה, עד שהמוח הצף טובלות לחלוטין (אחרי 5% ב 15% ולאחר מכן 30%). מוחם של בעלי חי perfused עם הלטקס הצבעוני גם יכול להישמר באותו אופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעהליך בחיות 4-5 נוספות. כדי להשוות את ההבדלים באנטומיה של כלי דם במוח בשל רקע גנטי שונה או זנים, חזור על הפרוטוקול במספר שווה של ApoE KO וSV129 עכברים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ללמוד את האנטומיה של כלי הדם בתנאי איסכמי, לגרום לאיסכמיה המוחית חולפת מוקד ל45 דקות או 90 דקות בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי של חסימת intraluminal של MCA תחת הרדמה עמוקה (תיאור מפורט של הניתוח הוא מעבר להיקף של מאמר זה; הקורא נקרא Doeppner et al., 2010). בסוף תקופת reperfusion המתוכננת (יום 1 או 5 ימים), לבצע את צביעת כלי הדם עם CB1 CB2 + דיו בלבד וכתם את המוח כולו עם 2% פתרון TTC על 37 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות כדי לזהות את נפח האוטם . TTC מצטמצם formazan צבע האדום על ידי אנזימי המיטוכונדריה (דהידרוגנז במיוחד succinate). לאחר מכתים TTC, את כתמי הרקמות הפעילות מטבולית עמוק האדומים ואילו רקמות infarcted נשארה unstaiהנד ונראה לבן בשל אנזים המיטוכונדריאלי מתפקד ומפוגל. לאסוף תמונות באותו אופן כפי שתואר לעיל. </li></ol> 4. מחקר של כלי דם במוח שטחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את האנטומיה הברוטו של כולים מוחיים, תמונות של פני השטח הגבי של המוח או המוכתם עם לטקס צבעוני או CB1 CB2 + דיו ניתן לנתח עם ImageJ תוכנה (תוכנה מבוססת ג&#39;אווה ציבור תחום המשמשת לעיבוד תמונה וניתוח). מוחות perfused עם לטקס צבעוני עשויים להראות מעלות משתנות של כתמי כלי ממוקמים על פני שטח הגבו, בעוד CB1 CB2 + זלוף יהיה כתם לכל הכולים משני משטחי הגחון וגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קובץ תמונה עם תוכנת ImageJ. לזהות את כל נקודתי anastomotic בין ACA ו-MCA. נקודת anastomotic מוגדרת כאתר שבו קוטר הכלי הוא מרחק החצי בין הנקודות הקרובות ביותר ההסתעפות של ACA וענפי MCA, בהתאמה 2 או צר. <sעד&gt; צייר קו דמיוני (קו anastomotic) על ידי סימון נקודתי anastomotic בעזרת ציור כלי קו מקוטע ותוסף &quot;קו מקווקו&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ההיקף במ&quot;מ. מדוד את המרחק בין קו anastomotic וקו האמצע ב4 מ&quot;מ זנב לקוטב הקדמי של המוח באמצעות כלי קו ישר וציור כלי &quot;מידה&quot;. לעשות את אותו הדבר בגיל 6 המ&quot;מ caudally מהקוטב החזיתי. מנתח את תמונות 3-4 לבעלי חיים ולחשב את הערך הממוצע. השווה את הערכים בין קבוצות שונות של בעלי חיים כדי לזהות את הווריאציה של האנטומיה מוחית. בבעלי החיים C57Bl6 / י, קו anastomotic בין ACA ו-MCA ​​ניתן לייחס קרוב יותר לקו האמצע ב4 מ&quot;מ מגיל 6 המ&quot;מ caudally מהקוטב החזיתי. עכברי KO APOE יציגו הבדל משמעותי מבחינה זו. להיפך, בSV129 עכברי קו anastomotic ישקר ועוד במקביל לקו האמצע הן ב4 מ&quot;מ ו 6 מ&quot;מ caudally מהקוטב החזיתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את האנטומיה של כלי הדם אניn תנאי איסכמי, לבצע את החישובים שהוזכרו לעיל. זהה את גבול האוטם כשולי רקמות בצבעים אדומים ולבנים מייצגים את הרקמה פעילה מבחינת חילוף חומרים ורקמות נמקית כתם, בהתאמה. מדוד את המרחק של גבול מהאוטם בקו אמצע 4 מ&quot;מ ובזנב 6 מ&quot;מ מהמוט הקדמי של המוח. אסוף את הערך הממוצע מתמונות 3-4 לבעלי חיים. השווה את התוצאות בין איסכמיה השונה ותקופות reperfusion. </li></ol>

<ol><li>Meng, H., Peng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+contrast+angiography%3A+A+simple+method+for+morphological+characterization+of+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Nuclear contrast angiography: A simple method for morphological characterization of cerebral arteries.</a> Brain Research. 1261, 75-81 (2009).</li>
<li>Maeda, K., Hata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+cerebrovascular+anatomy+of+C57black%2F6+and+SV129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Differences in the cerebrovascular anatomy of C57black/6 and SV129 mice.</a> Neuroreport. 9 (7), 1317-1319 (1998).</li>
<li>Coyle, P., Jokelainen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+cerebral+arterial+collaterals+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Dorsal cerebral arterial collaterals of the rat.</a> The Anatomical Record. 203, 397-404 (1982).</li>
<li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+cerebral+collaterals+of+stroke-prone+spontaneously+hypertensive+rats+%28SHRSP%29+and+Wistar+Kyoto+rats+%28WKY%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Dorsal cerebral collaterals of stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP) and Wistar Kyoto rats (WKY).</a> The Anatomical Record. 218, 40-44 (1987).</li>
<li>Hasan, M. R., Herz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+macroscopic+cerebral+vessel+anatomy%E2%80%94A+new+and+reliable+technique+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of macroscopic cerebral vessel anatomy—A new and reliable technique in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204, 249-253 (2012).</li>
<li>Doeppner, T. R., Nagel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT-Hsp70-mediated+neuroprotection+and+increased+survival+of+neuronal+precursor+cells+after+focal+cerebral+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">TAT-Hsp70-mediated neuroprotection and increased survival of neuronal precursor cells after focal cerebral ischemia in mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 1187-1196 (2009).</li>
<li>Todo, K., Kitagawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+enhances+leptomeningeal+collateral+growth+induced+by+common+carotid+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhances leptomeningeal collateral growth induced by common carotid artery occlusion.</a> Stroke. 39 (6), 1875-1882 (2008).</li>
<li>Sugiyama, Y., Yagita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+colony-stimulating+factor+enhances+arteriogenesis+and+ameliorates+cerebral+damage+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Granulocyte colony-stimulating factor enhances arteriogenesis and ameliorates cerebral damage in a mouse model of ischemic stroke.</a> Stroke. 42 (3), 770-775 (2011).</li>
<li>Busch, H. J., Buschmann, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriogenesis+in+hypoperfused+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Arteriogenesis in hypoperfused rat brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23 (5), 621-628 (2003).</li>
<li>Maeda, K., Hata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+metabolic+disturbances+and+cerebrovascular+anatomy+after+permanent+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22in+C57black%2F6+and+SV129+mice.+Neurobiology+of+Diseases%22%5BJournal%5D)">Regional metabolic disturbances and cerebrovascular anatomy after permanent middle cerebral artery occlusion.</a> in C57black/6 and SV129 mice. Neurobiology of Diseases. 6, 101-108 (1999).</li>
<li>Wang, Y., Kilic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+overexpression+induces+post-ischaemic+neuroprotection%2C+but+facilitates+haemodynamic+steal+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">VEGF overexpression induces post-ischaemic neuroprotection, but facilitates haemodynamic steal phenomena.</a> Brain. 128 (1), 52-63 (2005).</li>
<li>ElAli, A., Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+blood-brain+barrier+permeability+and+brain+edema+after+focal+cerebral+ischemia+induced+by+hyperlipidemia%3A+Role+of+lipid+peroxidation+and+calpain+1%2F2%2C+matrix+metalloproteinase-2%2F9%2C+and+RhoA+overoxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Increased blood-brain barrier permeability and brain edema after focal cerebral ischemia induced by hyperlipidemia: Role of lipid peroxidation and calpain 1/2, matrix metalloproteinase-2/9, and RhoA overoxidation.</a> Stroke. 42, (2011).</li>
<li>Coyle, P., Jokelainen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+outcome+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+spontaneously+hypertensive+stroke-prone+rats+%28SHRSP%29+and+Wistar+Kyoto+%28WKY%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Differential outcome to middle cerebral artery occlusion in spontaneously hypertensive stroke-prone rats (SHRSP) and Wistar Kyoto (WKY) rats.</a> Stroke. 14, 605-611 (1983).</li>
<li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diameter+and+length+changes+in+cerebral+collaterals+after+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+young+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Diameter and length changes in cerebral collaterals after middle cerebral artery occlusion in the young rat.</a> The Anatomical Record. 210 (2), 357-364 (1984).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הטפטוף של CB1 CB2 + על ידי הזרקת הוראות יכול להתבצע בהצלחה על ידי ללא הכשרה נמרצת, מאחר שאינו כרוך בכל מכשיר ספציפי לרמוז לחץ מסוים 2,3. ההטרוגניות של תוצאות זלוף בפרוטוקול שלנו היא גם זניחה. רק חית 1 מתוך 16 בעלים חיים שאינם איסכמיים ו3 מתוך 20 בעלי חי איסכמי הראו זלוף לא שלם. במקרים אלה, שילוב של בועות במהלך זלוף המלוח שמוביל לחסימה של כולים היה ככל הנראה הסיבה לתוצאה המוצלחת. למרות הטפטוף של לטקס שה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> שם חברה </td><td> מספר </td></tr><tr><td> Scribtol שוורץ (CB2) </td><td> שקנאי, גרמניה </td><td> 221 135 </td></tr><tr><td> Stempelfarbe (CB1) </td><td> הרליץ PBS AG, גרמניה </td><td> 10417202 </td></tr><tr><td> Gedeo אטקס </td><td> Pebeo, צרפת </td><td> 13042B </td></tr></tbody></table>

זלוף intravascular של דיו שחור פחם מאפשר הדמיה אמינה של כלי מוחות

Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

המבנה האנטומי של כולים מוחיים הוא גורם מפתח עבור פרמטרים המודינמיים במוח, כמו גם את חומרת פציעה בעקבות עלבונות איסכמי. מערכת כלי הדם במוח באופן דינמי מגיבה למצבים שונים pathophysiological והוא מציג הבדלים משמעותיים בין זנים ובתנאים של מניפולציות גנטיות. בעיקרו של דבר, טכניקה אמינה לצביעת כלי שיט תוך גולגולת היא חיונית כדי ללמוד בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עד לאחרונה, אוסף של טכניקות שונות כבר מועסק לדמיין vasculature המוחין כולל הזרקה של שרף צמיגות נמוך, araldite F, ג&#39;לטין מעורב עם צבעים 1 (כלומר ארגמן אדום, הודו דיו) או לטקס שונים עם 2 או 3 ללא הפחם שחור. טפטוף של מתחם לטקס לבן דרך אב העורקים עולה כבר דווח לראשונה על ידי קויל וJokelainen 3. מאדה et al. 2 שינה את הפרוטוקול על ידי הוספת carboדיו שחור n למתחם הלטקס להדמית ניגוד משופרת של הכולים לאחר זלוף המלוח של המוח. עם זאת, זלוף לא יעיל ומילוי לקוי של הכולים לעתים קרובות חוו עקב צמיגות גבוהה של מתחם הלטקס 4. לכן, יש לנו תארנו טכניקה פשוטה וחסכונית באמצעות תערובת של שני צבעים שחורים פחם זמינים מסחרי (CB1 ו CB2) כדי להמחיש את מערכת כלי הדם במוח באופן לשעתק 5. הראנו שזלוף עם CB1 CB2 + בתוצאות עכברים בצביעת כולים מוחיים קטנים משמעותי בצפיפות גבוהה יותר בהשוואה לזלוף הלטקס 5. כאן, אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לזהות את נקודתי anastomotic בין הקדמי (ACA) ועורקי מוח אמצעיים (MCA) ללמוד וריאציות כולים בעכברים עם רקע גנטי שונה. לבסוף, אנו להוכיח את ההיתכנות של הטכניקה שלנו במודל חולף מוקד מוחות איסכמיה בעכברים על ידי שילוב CB1 +צביעת כולים CB2 בתיווך עם כתמי TTC בדרגות שונות של פציעות איסכמי.

הפרוטוקול המתואר כאן מתגבר על המגבלות הטכניות של הדמיה מבוססת לטקס הקונבנציונלית של מערכת כלי דם במוח מכרסם. האיור 1A מראה כי זלוף הבא של הלטקס הצבעוני, רק הכלי גדול על פני שטח הגחון הוא מוכתם, עוזב את פני השטח הגבי כל כתם. התוצאה היא גם משתנית מאוד. רק חיה אחת מתוך שישה מופעים חלקית צביעה של ACA ו-MCA ​​הגלוי על פני השטח הגבי של המוח (מידע לא מוצג). לעומת זאת, CB1 CB2 + תוצאות זלוף במילוי מספיק של כולים קטנים וגדולים באופן שווה (1B איור). הצביעה ...

ניתוח של כלי דם במוח האנטומיה מכרסם משחק תפקיד חשוב במחקר ניסויי שבץ. בהקשר זה, זלוף intravascular עם לטקס צבעוני כבר נחשב כלי סטנדרטי במשך כמה שנים. עם זאת, טכניקה זו מרמזת מגבלות טכניות שונות, המערערים את השחזור שלה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לדמיין כולים מוחיים באופן שחזור. הזרקה של תערובת של שני צבעים שחורים פחם מסחרי זמינים דרך תוצאות חדר לב השמאליות של שריר הלב במילוי נאות של כולים מוחיים עם הדמית ניגודיות גבוהה. יש לנו ליישם בהצלחה בטכניקה זו כדי לזהות נקודתי anastomotic בין שטחי כלי דם מוחיים של עכברים עם רקע גנטי שונה. סוף הסוף אנחנו נותנים ראיות לכך שהשיטה חדשה ופשוטה לצביעת כלי יכולה להיות משולבת עם כלוריד triphenyltetrazolium (TTC) צביעה - כלי בשימוש נרחב כדי להתבונן ולנתח כמויות אוטם בעכברים.

המבנה האנטומי של כלי הדם המוחיים הוא גורם קובע מרכזי עבור ההמודינמיקה של המוח, כמו גם עבור חומרת הפגיעה בעקבות אירועים איסכמיים. ה...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לחקור את האנטומיה של כלי הדם המוחיים בעכברים באופן הניתן לשחזור. ראשית, כלי הדם המוחיים נצבעים בלטקס צבעוני לצורך השוואה מאוחרת לצביעה בדיו פחמן שחור. לאחר מכן, דיו הפחמן השחור מעורבב והחיות עוברות פרפוזיה של P-B-S-P-F-A ותערובת דיו הפחמן השחור דרך החדר השמאלי.בשלב הסופי, המוח נאסף ותמונות נלקחות להשוואה ולניתוח של כלי הדם המוחיים הצבועים. לבסוף, נעשה שימוש בתוכנת Image J כדי לנתח את נקודות האנסטומוזה בין העורקים המוחיים האמצעיים והקדמיים. השלכותיה של טכניקה זו חולות על הטיפול במחלות קרביו-וסקולריות, ובמיוחד בשבץ מוחי, שכן ניתן להשתמש בה לניתוח צפיפות כלי דם ואנגיוגנזה.כעת, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מערכת כלי הדם של המוח, וניתן ליישמה גם על מערכות אחרות, כגון להדמיה של מיקרו-כלי דם בלב, בכבד או בכליות. לאחר שילוב הלטקס עם דיו פחמן שחור (carbon black ink) בשפופרת EP, יש לחמם את התערובת ב-37 °C באמבט מים. השתמשו במחט בכילוי 23 עד 25 כדי לאסוף את הלטקס המחומם למזרק של 2 mL.לאחר מכן, המיסו 12.5 milligrams של אבקת papine hydrochloride בתוך מיליליטר אחד של תמיסת סליין סטרילית, ולאחר ערבוב ב-vortex, אספו את התמירון שהתקבלה למזרק אינסולין. לאחר מכן, השקיפו את המחט ממזרק אינסולין סטרילי נוסף והניחו את המחט המופרדת בקצה של צינור PE 10 באורך 20 centimeter. לאחר מכן, חברו את צינור ה-PE 10 למחט של מזרק האינסולין המכיל את תמיסת ה-Papine hydrochloride.כעת מלאו שתי מזרקי אינסולין נוספות ב-1 mL של תמיסת סליין, והעבירו את כל המזרקים יחד עם מכשירי הניתוח המעוקרים לשולחן הניתוח לפני ההרדמה. שקלו את העכבר, ולאחר מכן הנחו את העכבר המורדם על גבו. קבעו את הגפיים וחתכו את העור מעל הווריד הפמורלי השמאלי.כעת איתרו את הוריד הפמורלי (הוריד הירכי) והחדירו את קצה המחט המחוברת לצינור PE 10. לאחר מכן, הזריקו באיטיות את תמיסת ה-Papine hydrochloride בקצב של כ-100 µL לדקה ובמינון של 50 mg לקילוגרם ממשקל הגוף. לאחר ההזרקה, פתחו את חלל הבטן ולאחר מכן נקבו את הסרעפת.לאחר מכן, חתכו את הצלעות כדי לחשוף את הלב וסגרו את האבי העורקים החזי של המגוף (descending thoracic aorta) בעזרת תפסים לעורקים. לאחר מכן, בצעו חיתוך חד מעל העלייה הימנית כדי לנקז את הדם הוורידי. לאחר מכן, הזריקו 2 mL של תמיסת סלין לתוך החדר השמאלי.נוכחות של אוויר בתמיסאות ה-Profil או בתערובת הדיו המשולבת עלולה לגרום לאזורים וסקולריים במוח שאינם צבועים. כדי להבטיח הצלחה, אנא בדקו בקפידה רבה שכל המזרקים שלכם נקיים לחלוטין מבועות אוויר. כעת, מזריקו בעדינות את תכולת המזרקים הממולאים מראש, אחד אחרי השני, להזרקה ידנית של הלטקס הצבעוני על פני תקופה של 18 עד 20 שניות, והשאירו את בעל החיים למשך חמש דקות.לאחר עריפת בעל החיים, הסר את עצם הגולגולת ואת הקרומים תוך הקפדה לא לפגוע בקורטקס או במבנה כלי הדם, ולאחר מכן הוצא בזהירות את המוח השלם. הנח את המוח בצלחת תרבית תאים של 60 מילימטר המכילה שש עד שמונה מיליליטר של 4% PFA, ולאחר מכן הנח סרגל מדידה מתחת לצלחת באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ הניתוחי. צלם תמונות בהגדלה של 25x של המשטחים הדורסליים והונטרליים של המוח בזווית של 90 מעלות בין העדשה של המיקרוסקופ לבין צלחת הפטרי.על מנת לכמת את המרחק המקורי, התחילו את הליך הצביעה בדיו פחמן שחור על ידי ערבוב של שתי מנות של 100 µL של דיו herts stemple farba או CB one עם שתי מנות של 900 µL של דיו pelican scribal schwartz או CB two בשתי מבחנות EP של 1.5 mL נפרדות. אספו את תערובות הדיו לשתי מזרקי אינסולין נפרדים של 1 mL. לאחר מכן, סגרו את המזרקים והניחו אותם באמבט מים של 37 °C, יחד עם שני מזרקי אינסולין נוספים המכילים כל אחד 1 mL של סליין.לאחר טיפול בעכבר כפי שהודגם זה עתה, השתמש בלחץ קל כדי להזריק את שני תמיסות דיו הפחמן השחור (carbon black) לתוך החדר השמאלי בקצב של 18 עד 20 שניות למיליליטר. לאחר הוצאת המוח וצילום התמונות כפי שהודגם זה עתה, הנח את המוח ב-4% PFA למשך הלילה, ולאחר מכן בביצוע אינקובציה בריכוזים עולים של סוכרוז עד שהמוח הצף שוקע לחלוטין. התחל שלב זה על ידי השראה של איסכמיה מוחית מוקדית חולפת.על פי פרוטוקול סטנדרטי של חסימה תוך-לומנלית של העורק המוחי האמצעי, בסוף תקופת reperfusion, צבעו את כלי הדם באמצעות דיו CB one ו-CB two כפי שהודגם כעת, ולאחר מכן צבעו את המוח כולו בתמיסת 2% TTC בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש עד 10 דקות. לזיהוי נפח האינפקט, אזור האינפקט יישאר לבן, בעוד שהאזור שאינו איסכמי יהפוך לאדום. אספו תמונות כפי שהודגם כעת כדי לנתח את האנטומיה הגולית של כלי הדם המוחיים, והתחילו בפתיחת תמונה של פני השטח הצבועים של המוח.בעזרת תוכנת Image J, מוחות שעברו פרפוזיה בלטקס צבעוני עשויים להראות דרגות משתנות של צביעת כלי דם הממוקמים על פני השטח הוונטרלי (בטני). לעומת זאת, פרפוזיה של CB one פלוס CB two תצבע את כל כלי הדם הן על פני השטח הוונטרלי והן על פני השטח הדורסלי (גבי). הגדירו את קנה המידה במילימטרים, סמנו את נקודות האנסטומוזיס בין העורק המוחי הקדמי (aCA) לבין העורק המוחי האמצעי (MCA), כדי ליצור קו דמיוני המחבר את כל נקודות האנסטומוזיס הללו.כעת, מדדו את המרחק בין קו האנסטומוזיס לקו האמצע בנקודות של ארבעה, ואז שישה מילימטרים מהקטב הפרונטלי של המוח. לאחר ניתוח של שלוש עד ארבע תמונות לכל חיה, חשבו את ערך הממוצע. השוו את הערכים בין קבוצות החיות השונות כדי לזהות את השונות באנטומיה של כלי הדם המוחיים.בבעלי חיים מסוג C 57 black six J, ניתן לעקוב אחר קו האנסטומוזה בין ה-a CA ל-MCA בקרבה רבה יותר לקו האמצע במרחק של ארבעה מילימטרים מאשר במרחק של ששה מילימטרים מהקוטב הפרונטלי, בעוד שבעכברי APO lipoprotein e knockout לא נצפתה הבדל משמעותי בהקשר זה. לעומת זאת, קו האנסטומוזה בעכברי SV 1 29 נמצא רחוק יותר ובמקביל יותר לקו האמצע, הן במרחק של ארבעה מילימטרים והן במרחק של ששה מילימטרים מהקוטב הפרונטלי לצורך ניתוח האנטומיה של כלי הדם. בתנאי איסכמיה, זהו את גבול האינפרקציה כשולי הרקמה הצבועים באדום ולבן, המייצגים את הרקמה הפעילה מטבולית ואת הרקמה הנמקרית בהתאמה, ומדוד את המרחק של גבול האינפרקציה מקו האמצע במרחק של ארבעה מילימטרים ובמרחק של ששה מילימטרים מהקוטב הפרונטלי של המוח.הפרוטוקול המתואר כאן המשיג התגברות על המגבלות הטכניות של הדמיה קונבנציונלית של כלי הדם במוח מכרסמים המבוססת על לטקס. כפי שמדגימה תמונה ראשונה זו לאחר פרפוזיה של לטקס צבוע, רק כלי הדם הגדולים על פני השטח הוונטרלי נצבעים, בעוד שכל פני השטח הדורסלי נותרים ללא צבע. לעומת זאת, פרפוזיה של CB one פלוס CB two גורמת למילוי מספיק של כלי דם קטנים וגדולים כאחד באופן שווה.הצביעה יציבה למשך שבעה ימים ללא כל שינוי באיכות. באמצעות תוכנת Image J, ניתן לנתח את המרחק של נקודות האנסטומוזיס בין ה-A CA ל-MCA מקו האמצע בכל קבוצות העכברים השונות, שביצעה בהן פרפוזיה של דיו כדי להעריך את ההבדלים באנטומיה וסקולרית אזורית. למרות שביטול (knocking out) של POE אינו משפיע על המבנה האנטומי של כלי הדם המוחיים בעכברי C 57 black six J, ניתן להבחין בהבדל מובהק בין זני C 57 black six J ל-SV 1 29.במודלים ניסיוניים של שבץ במכרסמים, צביעת TTC משמשת באופן נרחב להדמיה של נפח האינפארקציה. צביעת CB one פלוס CCB two ישימה אף היא בתנאים איסכמיים לצורך תצפית על שינויים מבניים בכלי הדם, והיא מפגינה יציבות גבוהה כאשר היא משולבת עם צביעת TTC. שימו לב להדמיה הסימולטנית של כלי הדם המוחיים ונפח האינפארקט במוחות עם איסכמיה, אשר הושרה על ידי משכי זמן שונים של איסכמיה מוחית ונקודות זמן שונות של רפרפוזיה.ניתוח של נקודות האנסטומוזה בין ה-a c ל-MCA לאחר 45 או 90 דקות של איסכמיה, בשילוב עם תקופות רפרופוזיה של יום אחד או חמישה ימים, מראה כצפוי כי ההבדל הממוצע בין קו האמצע לנקודות האנסטומוזה לא הראה הבדל מובהק בין הקבוצות. יתרה מכך, המרחק הממוצע היה באותו טווח כפי שנצפה בבעלי חיים שאינם איסכמיים. עם זאת, המרחק מקו האמצע עד לגבול השבץ (infarction border) שונה באופן מובהק בין הקבוצות, דבר המשקף את נפח השבץ הגדל עם דרגות גבוהות יותר של פגיעה כתוצאה מאיסכמיה ורפרופוזיה.טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום השבץ הניסיוני כדי לחקור את הטריטוריות הווסקולריות במוח העכבר. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד ללמוד את המערכת הצרברוווסקולרית, אנאטומיה בעכברים, באמצעות פרפוזיה של המוח עם דיו שלקס או פחמן שחור (carbon black), וכיצד לנתח את רקמת המוח הצבועה שהתקבלה בעזרת תוכנת Image J.

intravascular-perfusion-carbon-black-ink-allows-reliable

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

במאמר זה, אנו מציגים טכניקה פשוטה, מעשית ליציקת כלי דם במוח כי הוא קל לביצוע, יכול להיות מנוצל על התמונה עץ כלי דם של המוח עכבר מבוגר.

יציקה של כלי דם במוח העכבר למבוגרים הדמיה 3D ו ניתוח מורפולוגי

בצע חתך בצוואר כדי לחשוף ולשחרר באופן רופף את עורקי התרדמה המשותפים הדו-צדדיים.

הדמיה של זרימת דם מוחית במהלך איסכמיה בעכבר באמצעות עוקב פלואורסצנטי

מקור: Kim, D. E., et al. הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום וטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת להמחשה ישירה של טרומבואמבולי מוחי. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום (NIRF) כדי להמחיש פקקת ברקמת מוח שנכרתה המסומנת בבדיקה ספציפית לפיברין. אור קרוב לאינפרא אדום מעורר את הגשושית, גורם לפקקת להאיר, ומאפשר הדמיית פקקת בעלת ניגודיות גבוהה בעורק המוח הראשי ובכלי הדם הקטנים בקליפת המוח.

הדמיה של פקקת מוחית של עכבר באמצעות הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום

פרוטוקול זה מתאר את היישום של ניאון בשילוב האינפרה-אדום הקרוב (NIRF) הדמיה וטומוגרפיה-מחושב מיקרו (microCT) המאפשר הדמיה thromboemboli מוחין. טכניקה זו מאפשרת כימות של נטל פקיק ואבולוציה. טכניקת דימות NIRF מדמיינת שכותרתו fluorescently פקיק במוח הניכר, ואילו טכניקת microCT מדמיינת פקיק בתוך חיות בעלות באמצעות-חלקיקי זהב.

משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

כתב יד זה מתאר הליך לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במהלך הצטברות פלאק עמילואיד in vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ אורך. הכנה הגולגולת דליל מאפשר הדמיה של צבעי ניאון כדי להעריך את התקדמות הנזק כלי דם במוח במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר.

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

אנחנו מציגים של ויוו הדמיה השיטה באמצעות שני צבעי פלורסנט שונים כדי לעקוב אחר שינויים דינמיים בעמוד השדרה כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה contusive בחולדות ספראג-Dawley למבוגרים.

Vivo דואו-צבע שיטת הדמיה Dynamics כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה Contusive

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר לתיוג כלי דם בדגים teleost על ידי זלוף הלב של dii מדולל בתיקונים, באמצעות מסדר (oryziasלטיפס) כמודל והתמקדות במוח ובבלוטת יותרת השומן.

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

פרוטוקול זה מציג צעדים לרכישה וניתוח של תמונות סידן פלואורסצנטיות מפריקיטים משחישת מוח ונתוני זרימת דם מכלי דם סמוכים בעכברים מרדים. טכניקות אלה שימושיות למחקרים של פיזיולוגיה של תאי קיר וניתן להתאים אותן לחקור סידן ארעי בכל סוג תא.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

החקירה הראשונית מאשרת כי דימום תת-עכבישי (SAH) גורם למוות של פריציטים במוח. הערכת התכווצות פריציטים לאחר SAH דורשת הבחנה בין פריציטים חיים ולא קיימא במוח. לפיכך, פותח הליך לסימון פריציטים במוח בני קיימא ושאינם בני קיימא בו זמנית בקטעי מוח, מה שמקל על תצפית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה.

הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר דימום תת-עכבישי

כדי לחקור את ויסות זרימת הדם במוח in vivo, שיטות פרמקולוגיות מסורתיות הן פולשניות, ולעתים קרובות פוגעות בגולגולת, בדורה ובלפטומנינג. בעבודה זו, פיתחנו טכניקה זעיר פולשנית המשלבת הזרקת מגנה תוך-ציסטרנלית מונחית ננו-מזרק (ICM) עם הדמיית ניגודיות כתמי לייזר, תוך שמירה על שלמות הגולגולת והלפטומנינגים.

בדיקת ננו-הזרקת Cisterna Magna מזווגת ובדיקת הדמיית ניגודיות כתמי לייזר לחקר ויסות זרימת הדם במוח in vivo

למד שיטה לדימוי כלי דם מוחיים בעכברים באמצעות דיו פחם שחור לצביעה תוך-ורידית. טכניקה זו מאפשרת הדמיה ברמת ניגוד גבוהה ושיפור השחזור במחקר מוחי-כלי דמי.

זלוף intravascular של דיו שחור פחם מאפשר הדמיה אמינה של כלי מוחות

גלה סרטונים נוספים