זיהוי נדיפים חוש ריח באמצעות קלטות כרומטוגרפיה-Multi-יחידת גז (GCMR) באונת מחושי החרקים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות ריחות יעילים ביולוגית במובן המורכב באמצעות הקלטות במוח הדבורה. זה מושג על ידי איסוף תחושת אפקט התנהגותית, ושנית, הכנת כרומטוגרף הגז ומערכות ההקלטה הרב-ערוציות לניסוי. השלב השלישי הוא להכין ולנתח את מוח הדבורה עבור ההקלטות העצביות באנטנה של אונת המפעל.

לאחר מכן הניסוי נערך על ידי החדרת האלקטרודות לאונה של האנטנה ומדידת תגובות לחומרים נדיפים נפוחים על ידי ניתוח הפעילות העצבית בתגובה לחושים מורכבים ומרכיביהם האישיים. ניתן לזהות ריחות פעילים ביולוגית המתקבלים על ידי כרומטוגרפיה של גז. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו ביחס לטכניקות אחרות כמו G-C-E-A-G, הוא הרגישות של נוירוני עומס האנטנה והיכולת לאפיין כיצד נוירונים במוח מגיבים לנדיפים פרחוניים ספציפיים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שלבים אנליטיים אלקטרופיזיולוגיים וכימיים משולבים בגלל טכניקת ההקלטה האלקטרופיזיולוגית והצעדים הדרושים לאיסוף נדיפים. למרות שטכניקה זו יכולה לספק תובנות לגבי עיבוד הריח של דבורי בומבוס, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון גורמי מחלה כמו יתושים או חרקים מתנשקים, או מזיקי יבול כמו כנימות או עש. לצורך הליך זה, הכינו אלקטרודת ייחוס העשויה מחוט טונגסטן על מניפולטור מיקרו בשנייה.

למיקרו מניפולטור יש אלקטרודה רב-ערוצית, כגון חוט מפותל, טדה או אלקטרודה רב-ערוצית מסיליקון המחוברת למגבר מקדים יש כרומטוגרף גז עם יציאה על שולחן BNC מסוכך. הפלט של גלאי ה-GCs מתממשק עם המגבר ומערכת רכישת הנתונים כך שגם האותות העצביים וגם האותות GC מסונכרנים. בדוגמה זו, הגז הנושא GC הוא הליום ונמצא בעמודת DB חמש GC.

ה-GC משתמש בכניסת רשימה מפוצלת כאשר הטמפרטורה מוגדרת ל-200 מעלות צלזיוס וטמפרטורת גלאי יינון הלהבה מוגדרת ל-230 מעלות צלזיוס. לאחר חימום הדגימות ב-gc, השפכים מהעמוד מפוצלים אחד לאחד בין גלאי יינון הלהבה לאנטנת B באמצעות מחבר y מזכוכית. בדוגמה זו, ה-GC משמש להעברת חומרים נדיפים שנאספו על ידי ספיגה דינמית מפרחי העין של מימוס לואיס, פרח בר אלפיני שמקורו בקליפורניה.

לחלופין, במקום להשתמש ב-gc, ניתן להעביר תרכובות נדיפות בודדות או תערובות של תרכובות על ידי פולסי אוויר. נורה דרך מזרק זכוכית נפרד המכיל פיסת נייר סינון שעליה הופקדו התרכובות. פולסי האוויר מוסטים מזרם אוויר קבוע באמצעות שסתום מופעל סולנואיד הנשלט על ידי מחשב.

התחל את ההכנות על ידי חיתוך של כסנטימטר אחד מקצה הפיפטה של מיליליטר אחד. מניחים דבורה בבסיס קצה הפיפטה ודוחפים אותה בעדינות לכיוון הקצה הנגדי של הקצה עד שרק הראש נחשף. בעזרת שעווה דנטלית מומסת יוצרים תבנית סביב הראש החשוף.

השעווה חייבת להיצמד לעיניים המורכבות כדי לשתק לחלוטין את הראש, אך אסור לה ליצור קשר עם האנטנה במידת הצורך. השתמש בפינים קטנים כדי לשתק את האנטנות. לאחר מכן, בצע חלון מרובע כמו חתך לתוך קפסולת הראש באמצעות להב חד כגון אזמל מיקרו

התחל לחתוך ישירות מאחורי האנטנה ובצמוד לאחת העיניים המורכבות. חותכים קו ישר בין העיניים. לאחר מכן, חותכים בגב עד שקפסולת הראש מתעקלת לבית החזה.

המשך את החיתוך לקצה הנגדי של קפסולת הראש. לבסוף חותכים חזרה להתחלה כדי להשלים את הריבוע. השתמש במלקחיים כדי להסיר את הציפורן.

יש להסיר את הקוטיקולה הסמוכה לאנטנה, אחרת היא תעכב את האלקטרודה ברגע שהמוח נחשף. מיד התמזגו את הרקמה עם מי מלח לחרקים. ודא שאונות האנטנה חשופות היטב.

לאחר מכן השתמש בזהירות בזוג מלקחיים עדינים מאוד כדי להסיר את המעטפת הפרי-עצבית מיד מעל אונות האנטנה. היזהר מאוד לא לנקב את מוח הדבורה במלקחיים. הכנת הדבורים מוכנה כעת לרישום אלקטרופיזיולוגי.

התחל בהצמדת הדבורה המוכנה למהדק המקובע לבסיס מגנטי. שמור אותו מאוחה במיוחד עם מלח חרקים המועבר ממאגר עם בקר זרימה. כעת הכנס את אלקטרודת הייחוס לרקמת המוח הנגדית.

לאחר מכן, הכנס את האלקטרודה הרב-ערוצית לאונות האנטנה של הדבורה. כאשר האלקטרודות במקומן. המתן 30 עד 60 דקות עד שההקלטות יתייצבו.

במהלך תקופה זו, התכוננו לקוצים החוץ-תאיים של נוירונים על ידי סף. ערוצי ההקלטה הבודדים ייתכן שיידרש סף ידני עבור ערוצים מסוימים עקב רעש בערוצי ההקלטה. לאחר מכן, ודא כי רמפת הטמפרטורה של ריצת ה- GC נכונה.

בדוגמה זו, הטמפרטורה מתחילה ב-50 מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות ואז עולה ב-10 מעלות לדקה לטמפרטורה סופית של 220 מעלות צלזיוס, או שהיא מוחזקת במשך שש דקות. כאשר צורות צורת הגל של היחידות בערוצי ההקלטה הפכו עקביות, ההקלטות העצביות נחשבות ליציבות. לאחר התייצבות, טען את המזרק עם ריח חלל הראש הפרחוני והזריק את הריח לפתח הזרקת הראש של ה-gc.

לאחר מכן התחל מיד להקליט מהאלקטרודות לאחר סיום ריצת ה- GC. תנו לתכשיר לנוח במשך חמש עד 15 דקות. לאחר מכן הזריק דגימה נוספת לתוך ה- GC או עורר את התכשיר באמצעות תרכובות נדיפות בודדות או תערובות של תרכובות.

אם בשלב כלשהו הפעילות הספונטנית נעצרת או משתנה בפתאומיות, יש לבדוק את טפטוף המלח ולתת לתכשיר לנוח במשך 15 דקות. לאחר מכן, אם הפעילות לא חוזרת לרמתה הקודמת, השליכו את התכשיר. לאחר הניסוי, תקן את המוח כשהבדיקות עדיין ברקמה, ואז כרת את המוח, נקה את הקיבוע וייבש את המוח.

לאחר מכן ניתן לזהות את מיקומי ערוצי ההקלטה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מניחוח הפרחים מימוס לוצ'י. המספר הכולל של החומרים הנדיפים בוזז. ה-GC הוא בדרך כלל בין 60 ל-70 תרכובות.

הניחוח של מימוס לוצ'י מורכב בעיקר ממונו טרפנואידים, כולל בטא מיוזין ואלפא פינין. שאר הריח מורכב משישה נדיפי פחמן. מספר תכשירים עוררו עם שלושה מיקרוליטרים של תמצית העיניים של מימוס לואיס.

הקלטה זו מאחת משמונה היחידות העצביות שתועדו על ידי האלקטרודה הרב-ערוצית מראה עד כמה תא עצב סלקטיבי מתחרה בנדיפים ספציפיים. בדוגמה זו, סעודה היא התרכובת המוצגת. להלן התגובות של שמונה יחידות עצביות.

כמחצית מהאנסמבל לא הגיב. זה מפתיע בהתחשב במגוון התרכובות הנדיפות הנרמזות מחלל ראש הפרחים, אך זה עקבי בין התכשירים ומדווח על ידי מחקרים אחרים. קצב הירי המנורמל של היחידות המגיבות מראה שיש סלקטיביות חזקה לקבוצת ריחות.

הריחות שהודגשו על ידי החיצים עוררו את התגובות החזקות ביותר. אלה הם דמין וטרנס בטא אוסאין. אז לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את החרק שלך לניסוי ואז לבצע את הניסוי באמצעות כרומטוגרפיית גז עם הקלטה רב-ערוצית.

המטרה אם כן היא לזהות ריחות יעילים מבחינה התנהגותית בזר מורכב. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים-שלוש אם היא נעשית כראוי בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות התנהגותיות עם הריחות שזוהו על מנת לקבוע באופן מלא את יעילות החומרים הנדיפים בתיווך התגובה ההתנהגותית של החרק.