בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

דרך יעילה לבודד את הלימפוציטים מדרכי מין עכבר מתוארת. שיטה זו מנצלת עיכול אנזים והפרדת השיפוע Percoll לאפשר בידוד יעיל. טכניקה זו היא גם להתאמה לשימוש במינים אחרים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד לימפוציטים ממערכת הרבייה של העכבר. זה מושג על ידי הסרת כל מערכת המין וטחינת הרקמה לחתיכות קטנות כדי לשחרר את הלימפוציטים מהרקמה. הרקמה הטחונה דק מתעכלת עם קולגנאז שמונה וערבוב נמרץ של הרקמה ב-37 מעלות צלזיוס.

בעזרת ערבוב מגנטי, הלימפוציטים מבודדים על ידי שיפוע לכל קריאה. בסופו של דבר, ניתן לאפיין את הלימפוציטים על ידי זרימה ציטומטריה השלכה של טכניקה זו מורחבת לקראת אבחון וטיפול במחלות רבייה. מכיוון ששיטה זו מאפשרת לנו להבין את התנהגותם של לימפוציטים ברקמות, שלעתים קרובות נבדלים מהלימפוציט שבודד ממערכת המחזור.

למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי מערכת רירית הרבייה, היא יכולה לחול גם על מערכות אחרות כגון מערכות רירית המעי והנשימה. לאחר המתת חסד של עכברה, השתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך נמוך בקו האמצע ולאחר מכן פתח את העור. הזיזו בעדינות את המעיים הצידה, זהו את ה-ucs ולאחר מכן בודדו והוציאו את כל דרכי המין מה-ucs אל הנרתיק הפתוח.

מניחים את דרכי המין בצלחת פטרי. השתמש במספריים כדי לפתוח את כל המסלול לאורך. לאחר מכן העבירו את הרקמה לצלחת פטרי עם מדיה מלאה של RPMI 10.

כעת חותכים את דרכי איברי המין לחתיכות עדינות, ולאחר מכן מעבירים את החלקים לבקבוק המכיל RPMI 10 מלא ו- EDTA. מניחים את הבקבוק על ערבוב מגנטי ומערבבים את הרקמה פעמיים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בכל פעם כדי להיפטר מתאי האפיתל לאחר תקופת הערבוב האחרונה, זורקים את הסופרנטנט ואז יוצקים את חתיכות הרקמה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. שטפו את שאריות ה-EDTA עם מדיה מלאה.

כעת העבירו את חתיכות הרקמה המסוננות לבקבוק חדש עם RPMI 10 טרי וקולגנאז ועכלו את החתיכות ב-37 מעלות צלזיוס על הערבוב המגנטי כדי לערבב במרץ את הרקמה לאחר שעה, שפכו את הסופרנטנט דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי טרי של 50 מיליליטר ושמרו את תרחיף התאים המסוננים על קרח. הוסף RPMI 10 טרי עם קולגנאז לבקבוק המקורי וערבב את הרקמה פעמיים נוספות באמצעות RPMI 10 שלם טרי וקולגנאז בכל פעם. לאחר העיכול השלישי, לא אמורות להיות חתיכות רקמה גלויות בתמיסה.

כעת, אספו את הסופרנטנטים משלושת העיכול יחד. סובבו את התאים במשך חמש דקות ב-410 גרם וארבע מעלות צלזיוס, ואז השליכו את הסופרנטנט. התחל בהחייאה, השעיית כדור התא בתמיסה טרייה של 40% לכל שיחה.

הוסף את תרחיף התא עם 40% לכל קריאה לצינור שיפוע, ולאחר מכן הניח בזהירות נפח שווה של הכנה טרייה. 70% לשיחה. כעת צנטריפוגה את דגימות השיפוע למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר עם ההפסקה.

לאחר הצנטריפוגה קצרו בזהירות את הלימפוציטים בשכבת הממשק בין שיפועי הפרול. לאחר מכן שטפו את התאים המשוחזרים עם RPMI אחד עד שלושה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, לאחר השלכת ה-sup natant יש להשהות מחדש את הלימפוציטים בתמיסה המתאימה בהתאם להליך הניסוי הרצוי.

תרשים נקודות זה הוא דוגמה לאוכלוסיית לימפוציטים שבודדה ממערכת המין של עכבר נגוע בכלמידיה אורדרם. שבעה ימים לאחר ההדבקה, תרחיף התא הבודד היה מגודר על CD שלושה לימפוציטים חיוביים, ונותח עבור CD ארבעה ו-CD שמונה תאים מבטאים לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקר לחקור את תפקוד הלימפוציטים הרבייה ואת מאפייני התאים במודל מחלת עכברי הנגיף המחקים מחלות אנושיות.