Name: בסינתזת מבחנה של ריווח ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח המגזרי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: חקור שיטות לסינתזה מבוקרת של שלושה סוגי קולגן ממונומר קולגן מסחרי: קולגן ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח מגזרי. השיטות פשוטות, ניתנות לשחזור ומתאימות למחקר ביוכימי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לכל תלמידים רבים בעבר לתואר ראשון, לתואר שני ופוסט דוקטורט שתרמו הזמן והמאמץ שלהם ללימוד fibrogenesis קולגן במעבדה שלנו. מדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה ספקו ברציפות מימון למחקרי קולגן.

הערה: המים המשמשים בכל הפרוטוקולים שיש התנגדות&gt; 18 MΩ.cm. 1. סיבי הקולגן Native <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 6 μl מים, 20 μl של 200 מ&quot;מ Na 2 HPO 4 מותאמים לחומציות 7 עם HCl ו 10 μl של 400 מ&quot;מ KCl בצינור microfuge ומערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μl של קולגן מונומר (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) לצינור microfuge והמערבב. הפתרון צריך להיות ברור וחסר צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צינור microfuge המכיל תערובת התגובה בגוש חום שכבר מראש חמם עד 37 ° C ולהשאיר במשך 3 עד 4 שעות. בשלב זה, הפתרון צריך להיות מעט עכור ומכיל סיבי הקולגן בעיקר ילידים. </li></ol> 2. לונג קולגן ריווח סיבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיאליזת 1 מ&quot;ל של קולגן מונומר (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) באמצעות קרום 12-14 kDa MWCO נגד 400 מ&quot;ל של מים ומחליף את המים ארבע פעמים על פני תקופה של 24 שעות בטמפרטורת חדר. Collag הדיאליזהמונומר en שאינו משמש מייד ניתן לאחסן ב 4 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 20 μl מים, 20 μl של 3 מ&quot;ג / מיליליטר גליקופרוטאין α1 חומצה במים ו20 μl של מונומר קולגן דיאליזה בצינור microfuge. הפתרון צריך להיות ברור וחסר צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צינור microfuge המכיל תערובת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. בשלב זה, הפתרון צריך להיות מעונן ומכיל סיבי הקולגן בעיקר Fls. </li></ol> 3. לונג קולגן ריווח מגזרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 67 μl מים, 60 μl של חיץ 100 מ&quot;מימ גליצין-HCl ב-pH 3.3 ו 40 μl של 10 מ&quot;ג / המ&quot;ל ATP במים בצינור microfuge ומערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 33 μl של קולגן מונומר (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) לצינור microfuge והמערבב. הפתרון צריך להיות ברור וחסר צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צינור microfuge המכיל תערובת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות. בשלב זה, הפתרון עדיין יופיע ברור, אבל צריךמכיל קולגן בעיקר SLS. </li></ol> 4. AFM אפיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליב פני השטח של פיסה יציץ מצורפת מצע AFM על ידי כיסוי המשטח יציץ עם חתיכת הסרט דביק ולאחר מכן הפריד אותו. בדקו את הקלטת לאחר מכן כדי לוודא שכל שכבה של יציץ נבקעה על מנת לצמצם חריגות על פני השטח ולהבטיח שהמדגם הישן יוסר אם תציץ הוא להיות בשימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 20 μl של פתרון קולגן ליפון למצע יציץ טרי בקע. השאר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשטוף את הפתרון של קולגן יפון עם מים. מומלץ שלא להחיל את המים ישירות על מרכז המצע יציץ אבל בקצה ולאפשר לו לזרום על פני המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את המשטח שמתחת זרם עדין של גז חנקן. כדאי להפנות את הזרם בקצה ולא במרכז המצע יציץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלת × 200,דגימות קולגן הילידים וFLS צריכות להראות גושים של סיבים. קולגן SLS לא יהיה גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המאפיינים הייחודיים של השלושה המבנים השונים קולגן ניתנים לצפייה על ידי AFM. באופן כללי, אנו סיבי קולגן עם תמונה מקוריים AFM במצב מגע לסירוגין באמצעות בדיקות סיליקון AFM, ואילו FLS וקולגן SLS סיבים אנחנו בדרך כלל תמונה עם AFM במצב קשר באמצעות בדיקות AFM סיליקון ניטריד. אנו עושים זאת בגלל הזמן ושיקולי עלות. בדיקות AFM סיליקון הן בדרך כלל חד יותר בדיקות סיליקון ניטריד AFM, שהופכים אותם שימושיים במיוחד עבור הדמית מבנה הפסים הצר יותר של סיבי הקולגן ילידים. עם זאת, בדיקות AFM סיליקון הן הרבה יותר פגיעות לזיהום על ידי דגימות קולגן מבדיקות AFM סיליקון ניטריד וצריכים להחליף בתדירות גבוהה. לכן, אנו שומרים את השימוש בסיליקון בדיקות AFM בעיקר לסיבי הקולגן ילידי הדמיה שבו רזולוציה היא הכרח גדול יותר ואנו פועלים במצב מגע לסירוגין לprolאונג חייהם של שימושיות. </li></ol> אנו ממליצים ראשונית 100 × 2 סריקה 100 מיקרומטר שאמור להראות לפחות כמה מבני הקולגן. משם, בזום כדי לסרוק גדלים של 10 × 10 מיקרומטר 2 ואז 2 × 2 מיקרומטר 2 להתבונן מחזוריות banding של קולגן הטבעי וFLS, או את התכונות העדינות של קולגן SLS. זה גם רעיון טוב לבדוק לפחות בשני אזורים אחרים במדגם קולגן כדי לוודא שהסריקות הראשוניות הן מייצגות.

<ol><li>Kadler, K. E., Baldock, C., Bella, J., Boot-Handford, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Collagen at a glance.</a> J. Cell Sci. 120, 1955-1958 (2007).</li>
<li>Abraham, L. C., Zuena, E., Perez-Ramirez, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+Collagen+Characterization+for+Bio+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mat.+Res%22%5BJournal%5D)">Guide to Collagen Characterization for Bio Studies.</a> J. Biomed. Mat. Res. 87B, 264-285 (2008).</li>
<li>Baselt, D. R., Revel, J. -P., Baldeschwieler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfibrillar+Structure+of+Type+I+Collagen+Observed+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Subfibrillar Structure of Type I Collagen Observed by Atomic Force Microscopy.</a> Biophys. J. 65, 2644-2655 (1993).</li>
<li>Petruska, J. A., Hodge, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Subunit+Model+for+Tropocollagen+Macromolecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Subunit Model for Tropocollagen Macromolecule.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 51, 871-876 (1964).</li>
<li>Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pattern+in+Native+Collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular Pattern in Native Collagen.</a> Nature. 219, 157-158 (1968).</li>
<li>Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extract+of+collagen+from+connective+tissue+by+neutral+salt+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Extract of collagen from connective tissue by neutral salt solutions.</a> PNAS. 41, 1-7 (1955).</li>
<li>Gale, M., Pollanen, M. S., Markiewicz, P., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+assembly+of+collagen+revealed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Sequential assembly of collagen revealed by atomic force microscopy.</a> Biophys. J. 68, 2124-2128 (1995).</li>
<li>Wood, G. C., Keech, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+fibrils+from+collagen+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The formation of fibrils from collagen solutions.</a> Biochem. J. 75, 588-597 (1960).</li>
<li>Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+Fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Collagen Fibril formation.</a> J. Biol. Chem. 253, 6578-6585 (1978).</li>
<li>Holmes, D. F., Capaldi, M. J., Chapman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+collagen+fibrils+in+vitro%3B+the+assembly+process+depends+on+the+initiating+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Macromol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of collagen fibrils in vitro; the assembly process depends on the initiating procedure.</a> Int. J. Biol. Macromol. 8, 161-166 (1986).</li>
<li>Paige, M. F., Rainey, J. K., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrous+long+spacing+collagen+ultrastructure+elucidated+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrous long spacing collagen ultrastructure elucidated by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 3211-3216 (1998).</li>
<li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+mucoprotein+with+soluble+collagen%3B+an+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The interaction of mucoprotein with soluble collagen; an electron microscope study.</a> PNAS. 37, 286-291 (1951).</li>
<li>Ghadially, F. N. Ultrastructural pathology of the cell and matrix. , 3rd Edition, Butterworths. London. (1988).</li>
<li>Paige, M. F., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+assembly+of+segmental+long+spacing+collagen+studied+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and assembly of segmental long spacing collagen studied by atomic force microscopy.</a> Micron. 74, 355-361 (2001).</li>
<li>Schmitt, F. O., Gross, J., Highberger, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+particle+type+in+certain+connective+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A new particle type in certain connective tissue extracts.</a> PNAS. 39, 459-470 (1953).</li>
<li>Bruns, R. R., Hulmes, D. J. S., Therrien, S. F., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procollagen+segment-long-spacing+crystallites%3A+their+role+in+collagen+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis.</a> PNAS. 76, 313-317 (1979).</li>
<li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+observations+of+certain+fibrous+structures+obtained+from+connective+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts.</a> JACS. 72, 3321-3322 (1950).</li>
<li>Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O+prokollagene+kohzi%5BTitle%5D)+AND+%22Biokhimiya%22%5BJournal%5D)">O prokollagene kohzi.</a> Biokhimiya. 13, 55-60 (1948).</li>
<li>Lin, A. C., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+ultrastructure+of+fibrous+long+spacing+collagen+by+parallel+atomic+force+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy.</a> Proteins. 49, 378-384 (2002).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

המטוהרים מונומר קולגן הוא יציב ב-pH וטמפרטורה הנמוכים וההיווצרות של סיבי הקולגן ילידים למעשה כרוכה העלאת pH והטמפרטורה של פתרון מונומר קולגן. הליכים לכינון מחדש של סיבי הקולגן מפוספסים ממונומרים קיימים כבר יותר מ 50 שנים. ההליך שהמעבדה שלנו משמשת במחקרים הראשונים שלנו עם קולגן לפני 15 שנה 7 התבססה על נהלים סכם צ&#39;פמן ועמיתים לעבודה בשנת 1986 10. התנאים להיווצרות קולגן ליפון שבעבודה הקודמת היו 0.18 מ&quot;ג / מיליליטר מונומר קולגן בNa 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (אני = 0.2, pH 7.4) חיץ ב34 ° C. החסרון של זה ונהלים אחרים שניסינו הוא שיש תמיד סיבי unbanded נוצרו לצד הסיבים המפוספסים הרצויים. התנאים החדשים שלנו הם ~ 0.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של מונומר קולגן בפוספט 100 מ&quot;מימ וKCl 100 מ&quot;מימ בשעת 7 pH השאיר על 37 מעלות צלזיוס למשך שעות 3-4. Proceדורה מתוארת כאן שונה בכל היבט מההליך קודם להכנת סיבי הקולגן ילידים. אבל רוב ניכר, הכפלנו את הכח היוני על ידי העלאת ריכוז החיץ והוסיף KCl mM 100. העלייה בתוצאות חוזק יוניות במבנה אחיד יותר של סיבי הקולגן חברו באופן בלעדי. מניסיוננו, הפעמים היחידות שהליך זה לא מיוצר קולגן סוג היליד הייתה כאשר פתרון מונומר קולגן היה עובר את התאריך המומלץ של יצרן שימוש. כאשר זה קורה, מה שנצפה נע בין סיבים פחות שכולם unbanded לסיבים רבים עדיין נצפו אך ברובה unbanded. שימו לב שמונומר קולגן שפג תוקף יכול לעתים עדיין ניתן להשתמש בהצלחה כדי להפוך את הקולגן טבעי, אבל כאשר הוא נכשל, מונומר קולגן החדש בהחלט צריך לרכוש. FLS זוהה לראשונה על ידי Highberger et al. 17 בהכנות קולגן יזוכה Orekhovich et al. 18. מחקרים נוספים הובילו Highberger ושמיט למסקנה שזה היה גליקופרוטאין α1 חומצה שמקדם את ההיווצרות של 12 FLS. היינו מאוחר מסוגל לשכפל את ההליך להכנת קולגן FLS על ידי שילוב של מונומר קולגן הזמין מסחרי וגליקופרוטאין α1 חומצה ב-pH הנמוך ולאט הרשה pH לעלות ב dialyzing התערובת נגד מים ל24 11 שעות. כעת אנו מציגים שינוי של הליך זה על ידי dialyzing מונומר קולגן נגד מים הראשונים ופשוט משלב את זה עם גליקופרוטאין α1 חומצה במים ליצירה קולגן FLS. התנאים לFLS קולגן הרכבה המתואר כאן הם הרבה פחות זמן רב. מונומר קולגן עדיין צריך להיות טרום דיאליזה נגד מים, אבל אפשר לעשות את זה בכמויות גדולות ואז מאוחסן ב 4 ° C ביציבות עד שימוש בו. תשואות זה נוהל חדשה ברובה Fls סיבי הקולגן מפוספסים. מניסיוננו, α1 החומצה Glycoחלבון עם תכולת חלבון ומים משולבות נמוכה יותר, ועל ידי תכולת סוכר גבוהה היקש, הוא קריטי ליצירת סיבי Fls בהצלחה. אנחנו בדרך כלל לבדוק עם היצרן שהרבה גליקופרוטאין α1 החומצה אנו משתמשים יש% תכולת חלבון ומים משולבות של 82 או פחות. וכמו בנוהל לסינתזת הקולגן טבעית, מונומר קולגן שהיא מבוגר מדי יכול גם לגרום לכישלון לייצר קולגן FLS. בנוסף, את הטוהר של המים המשמשים לדיאליזה הוא קריטי בהליך זה. לדוגמה, דיאליזה של מונומר קולגן נגד אף ~ 8 MΩ.cm במקום&gt; תוצאות מים 18 MΩ.cm בפתרון קולגן שלא יוצר קולגן FLS. מהשלושה סוגי יפון קולגן, הקל ביותר לעשות הוא קולגן SLS. ההכנה המוקדמת SLS תוארה על ידי שמיט ועמיתים לעבודה 15. אנחנו פרסמנו adaption של הליך זה לפני 12 שנים להכנת קולגן SLS באמצעות coll הזמין מסחריAgen 14. ההליך פשוט כרוך בשילוב 2 מ&quot;ג / המ&quot;ל ATP ו 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של מונומר קולגן ב0.05% (v / v) חומצה אצטית ב-pH 3.5, ומשאיר את התערובת בטמפרטורת חדר למשך הלילה. מניסיוננו, ההיבט הקריטי של הרכבת SLS שחייב להיות מבוקרים הוא pH של תמיסת התגובה. SLS התאסף בתנאים יותר בסיסיים (pH ~ 3.6-3.9) תוצאות בגושים מצטברים של crystallites. תנאים יותר חומציים (pH ~ 2.9-3.2) תוצאות בcrystallites הרזה, יותר מאשר אלה מופרדים התאספו בתנאים האידיאליים של pH 3.3-3.5. PHS תגובה מחוץ לטווח זה (&lt;2.8 ו&gt; 4) לא מניב כל קולגן SLS. בעבר, כוונן את ה-pH של תערובת התגובה על ידי התוספת של חומצה אצטית. כדי לפשט את ההליך עוד יותר, בכתב היד הזה שהצגנו חיץ גליצין-HCl לשלוט חומציות. השלושה המבנים השונים נוצרו קולגן מהפרוטוקולים שתוארו לעיל יש אופיתכונות שהתאימו ניתן להבחין רק באמצעות מכשירים לרזולוציה של ננומטר. קולגן יליד וFLS מתאפיין banding periodicities של ~ 67 ננומטר ו ~ 270 ננומטר. הממד הארוך ביותר של קולגן SLS הוא רק ~ 360 ננומטר. יש לנו מתואר במפורש כיצד אנו משתמשים AFM לאפיין שלושה מבני הקולגן השונים. עם זאת, כל הפעלת AFM במגע או במצב קשר רציף עם כל AFM חללית ש&lt; רדיוס 10 ננומטר צריכה גם להיות מסוגלת לתמונת מבני הקולגן אלה. בנוסף, מיקרוסקופי אלקטרונים יכול להיות ונעשה שימוש כדי לאפיין מבני הקולגן אלה 19. היתרון העיקרי של הליכים אלה הוא שהם מייצרים בעיקר קולגן הרצוי לבנות. הצורה האחרת של קולגן רק כי הוא נמצא בתגובות האלה היא מונומר מתחיל, אשר לעתים קרובות נראה ברקע של תמונות AFM. במקרה של קולגן הטבעי וFLS, ניתן להפריד בקלות מרוב unreaמונומר cted ידי צנטריפוגה ושטיפה חוזרות והנשנים של ילידים וכתוצאה או FLS קולגן גלולה עם מים. יש לנו הצגנו נהלים פשוטים ואמינים להכנה, FLS ילידים וקולגן SLS תוך שימוש בחומרים מתקדמים, זמינים מסחרי החל. מונומר הקולגן משמש בכל הליכים אלה זמין מסחריים בצורה מטוהרת. גליקופרוטאין α1 חומצה ו-ATP גם שניהם זמינים באופן מסחרי.

קולגן הוא קבוצה של חלבונים מבניים שמבנה סליל משולש שנוצר משלוש רשתות פוליפפטיד. מונומרים סליל משולשים אלה נוספות להרכיב באופן היררכי בצורת מבנים הולכים וגדל. יש לפחות 28 סוגי קולגן שונים גנטי שזוהו 1. שילוב, collagens לפצות 30% מהחלבון הכולל למצוא חיות, עם סוג I חשבונאי צורה הבולטת לעד 90% מכלל חלבוני קולגן 2. קולגן אני מקליד נמצא כמבני fibrillous בעור, רצועות, גידים ועצמות. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM) תמונות של סוג I סיבי קולגן ילידים בדרך כלל מראה banding עם תקופה אופיינית ~ 67 ננומטר (המכונה לעתים קרובות D-banding) 3-5. הקלד אני מונומר קולגן הוא heterotrimer משולש סליל מורכב מα1 2 זהים (I) שרשרות ו1 α2 (אני) שרשרת, כל אחד יותר מאלף חומצות אמינו ארוך. הוא ארוך ודק עם ממדים של 300 ננומטר באורך 1.4 ננומטרים בקוטר. הקלד אני מונומר קולגן ניתן להשיג בקלות על ידי פירוק מבנים גבוהים יותר סדר שנוצרו באופן טבעי 6. אנחנו 7 ורבים 8-10 אחרים הראינו כי אובניים בניין מונומר המסיס אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לשחזר סיבי D-מפוספסים במבחנה (איור 1). בנוסף לסיבי הקולגן ילידים, שני מבני הקולגן אחרים גבוהים יותר סדר נמצאו כדי ליצור במבחנה באמצעות אותה אבן בניין מונומר. שני המבנים הם מרווח סיבי ארוך (FLS) וריווח ארוך מגזרי (SLS) קולגן (איור 1). FLS קולגן הוא מבנה fibrillous כמו קולגן הטבעי, אך מאופיין במחזוריות banding גדולה יותר קולגן יליד 11. במבחנה, קולגן FLS נוצר, כאשר מונומר קולגן הוא בשילוב עם חומצת גליקופרוטאין α1 <suעמ &#39;&gt; 12. קולגן FLS נצפה בחי, כמו גם, אם כי לעתים רחוקות 13. קולגן SLS מתואר כcrystallites כי מונומרים מיושרים בקופה כמו בסריג הגבישי 14. קולגן SLS נוצר, כאשר מונומר הקולגן משולב עם אדנוזין טריפוספט (ATP) 15. קולגן SLS טבעי נצפה במדיום התרבות של fibroblasts אך לא בדגימות רקמה שחולצה, ככל הנראה בשל הגודל והמחסור בתכונות הנבדלות טופוגרפיות 16 קטנים. המטרה של כתב יד זה היא להציג נהלים מפורטים להכנת סיבי הקולגן יליד כFLS גם וקולגן SLS שגם החוקר המנוסה ביותר יכול להתרבות. שימוש בחומרים מתקדמים החל מסחרי זמינים, יש לנו ניסינו לעשות את הפרוטוקולים פשוט ככל האפשר, ועדיין יש להם לעבוד באופן מהימן. אנחנו גם פירוט כיצד להשתמש AFM כדי לאפיין את מבנה קולגן השונהזה שהם עשו. עבודה זו תהיה מועילה לחוקרים שרוצים ללמוד אחד או יותר ממבנים מסדר הגבוהים יותר קולגן אלה ו / או להשתמש בם כמבשרים ביישומים אחרים, אבל כרגע חוסר של המומחיות או פשוט לא רוצה לעבוד עם דגימות רקמה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר / מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> הקלד אני מונומר קולגן (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) </td><td> Inamed המתקדם Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> הרבה 1261443 (2.9 מ&quot;ג / מ&quot;ל, pH 2.1) הרבה 1629346 (3.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 2.1 pH) הרבה 6006 (3.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 2.1 pH) </td></tr><tr><td> ה-ATP </td><td> Biochemicals המחקר הבינלאומי </td><td> -141 </td><td> הרבה FBJ-1194A </td></tr><tr><td> α1 החומצה גליקופרוטאין מפלזמת שור </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G3643 </td><td> הרבה 051K7440 (89.8%) הרבה 011K7410 (82%) הרבה 065K7405 (71.2%) הרבה 063K7495 (71.9%) הרבה 117K7535 (75.9%) (+ תכולת מי חלבון) </td></tr><tr><td> glycopr A1 חומצהotein מפלזמה האנושית </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G9885 </td><td> הרבה 128H7606 (70.9%) הרבה 049K7565V (68%) (+ תכולת מי חלבון) </td></tr><tr><td> תציץ </td><td> טד פלה </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - הסיליקון SPM-חיישן </td><td> Nanoworld </td><td> NHC </td><td> הסיליקון AFM בדיקה שאנו משתמשים למצב מגע לסירוגין </td></tr><tr><td> טיפי Nanoprobe Veeco </td><td> Veeco (עכשיו בדיקות Bruker AFM) </td><td> NP-S </td><td> חללית AFM סיליקון ניטריד שאנו משתמשים למצב קשר </td></tr></tbody></table>

בסינתזת מבחנה של ריווח ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח המגזרי

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

סיבי הקולגן קיימים במטריקס מרקמות בעלי חיים כדי לספק פיגומים מבניים וחוזק מכאני. סיבי הקולגן ילידים אלה יש מחזוריות פסים אופיינית ל~ 67 ננומטר ונוצרים בגוף חי באמצעות ההרכבה ההיררכית של I מונומרים קולגן סוג, שהם 300 ננומטר באורך 1.4 ננומטרים בקוטר. במבחנה, על ידי שינוי התנאי של אובניים בניין מונומר חשוף, מבנים ייחודיים הנעים בסולמות באורך של עד 50 מיקרון ניתן לבנות, הכוללים לא רק סיבים מסוג מקומיים, אבל מרווח זמן גם סיבי קולגן וריווח הארוך המגזרי. בזאת, אנו מציגים הליכים להקמת השלושה מבני הקולגן השונים ממונומר קולגן הזמין מסחרי נפוץ. שימוש בפרוטוקולים שאנחנו ואחרים שפורסמו בעבר כדי להפוך את שלושת הסוגים האלה בדרך כלל להוביל לתערובות של מבנים. בפרט, סיבי unbanded היו נפוץ found עת ביצוע קולגן הטבעי, וסיבי ילידים נכחו לעתים קרובות בעת ביצוע קולגן מרווח הארוך סיבי. הנהלים החדשים אלה יש את היתרון של ייצור קולגן הסוג הרצוי יפון כמעט באופן בלעדי. ההיווצרות של המבנים המבוקשים מאומתת על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

קולגן Native תגובת התערובת של מונומר ~ 0.3 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן בפוספט 100 מ&quot;מימ וKCl 100 מ&quot;מימ ב-pH 7 השאיר על 37 מעלות צלזיוס למשך שעות 3-4 יניב פתרון המכיל סיבי הקולגן סוג ילידים עם ננומטר banding D-ברורים ~ 67, ללא סיבי unbanded. תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלת × 200, גושים של כמה סיבים ניתן בדרך כלל לראות במצע יציץ במיוחד כאשר נצפים על ידי ניגוד פער התערבות (DIC) מיקרוסקופי (איור 2). במדגם טיפוסי, 100 × 2 סריקה אקראית 100 מיקרומטר ידי AFM ניתן בדרך כלל לראות לפחות כמה סיבים שמיקרון ארוך 5-50 (איורי 3 א, ג). פרט, סיבי הקולגן מופרדים ניתן לזהות בקלות בשלב זה. עם 512 × 512 פיקסלים סריקת תמונה 2, התקרבות אל גודל 10 × 10 מיקרומטר סריקה 2 מראה שכל סיבי לימוד המאוחד (תרשימי 3d-f </strong&gt;). כדי למדוד במדויק מחזוריות banding, עדיף לזום של 2 × 2 2 גודל סריקת מיקרומטר (תרשימי 3G-i). Banding מחזוריות ניתן לקבוע על ידי מדידה פשוט וממוצע המרחק האורכי בין כמה פסגות או עמקים. לחלופין, אם התוכנה מאפשרת AFM, אחד פורה ממדי להפוך יחד חתך אורכים יכולים לשמש גם. איור 4 מראה תמונת גובה AFM של יפון וחתך אורכים מקביל. FLS קולגן תגובת התערובת של מ&quot;ג / מיליליטר גליקופרוטאין 1 μ1 חומצה ו~ מונומר 1 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן במים שנשארו בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות תניב פתרון של סיבי הקולגן Fls. גושים של סיבים, בדומה למה שרואה במקרה של קולגן הטבעי, ניתן לראות בקלות על פני המצע יציץ תחת מיקרוסקופ אופטי ב 200 מ &#39;×agnification. במדגם טיפוסי, אקראית 100 × 2 סריקה 100 מיקרומטר ידי AFM ניתן בדרך כלל לראות לפחות כמה סיבים. בגודל 512 × 512 סריקת פיקסל 2 תמונה, מחזוריות banding ניתן למדוד על ידי התקרבות ל10 × 10 מיקרומטר 2 סריקה (הציור 5a) או לייתר דיוק עם 2 × 2 מיקרומטר 2 סריקה (5 איור). האיור 5c תערוכות אורך חתך של FLS יפון. SLS קולגן תערובת התגובה של 2 מ&quot;ג / המ&quot;ל ATP ו ~ 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של מונומר קולגן במאגר 100 מ&quot;מימ גליצין-HCl ב-pH 3.3 השאיר בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות יניב פתרון של קולגן SLS. בדרך כלל, crystallites SLS לא יהיה גלוי תחת מיקרוסקופ אופטי. AFM נדרש לאשר את קיומו של crystallites SLS. במדגם טיפוסי, אקראית 100 × 2 סריקה 100 מיקרומטר ידי AFM ניתן בדרך כלל לראות רביםנקודות. ההתקרבות אל 10 × 2 סריקת מיקרומטר 10 יהיה בדרך כלל להראות כמה crystallites SLS (איור 6 א). ו2 × 2 מיקרומטר 2 סריקה (איור 6 ב) מציגה את המבנה העדין של גביש SLS. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> איור 1. השלוש הצורות מבניות השונות של סיבי הקולגן שיכול להיוצר במבחנה ממונומר קולגן. AFM תמונות המתארות מונומר קולגן ושלושה מבני קולגן מהסדר הגבוהים יותר כולם באותו הגודל בקנה המידה (2 × 2 מיקרומטר 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> איור 2. תמונה דיגיטלית ב ~ גדלת 200 × ידי מיקרוסקופיה אופטית דסק סיבי הקולגן ילידים ביציצו (א) לא נגע ו( ב) thresholded וחדד to להדגיש את הסיבים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> איור 3. AFM תמונות של סיבי הקולגן טבעיים ביציצו. תמונות לסירוגין מגע מצב AFM משרעת מוצגות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> איור 4. () 0.5 × 1 תמונה 2 מיקרומטר לסירוגין מגע מצב AFM גובה (בקנה מידה אנכי = 100 ננומטר) וכן (ב)-חתך אורך של קולגן ליפון ילידים. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> איור 5. AFM תמונות של סיבי הקולגן בFls יציץ. (א) 10 × 10 2 תמונת מצב מיקרומטר קשר AFM סטייה, (ב) 2 × 2 מיקרומטר 2 תמונת סטיית AFM מצב קשר ו( ג) אורכיםחתך של FLS קולגן ליפון. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> איור 6. AFM תמונות של קולגן SLS ביציץ. תמונות לסירוגין מגע מצב AFM משרעת מוצגות.

נהלים פשוטים ולשעתק מתוארים לביצוע 3 אסיפות קולגן מבני מובחנות מסוג זמין מסחרי נפוץ אני מונומר קולגן. סוג ילידים, מרווח זמן סיבי קולגן או ריווח הארוך המגזרי ניתן לבנות על ידי שינוי התנאי שאת 300 ננומטר ארוך ובלוק 1.4 ננומטר קוטר מונומר בניין חשוף.

סיבי קולגן נמצאים במטריצה החוץ-תאית של רקמה בעלי-חיים כדי לספק פיגום מבני ועמידות מכנית. סיבים טבעיים אלו...

המטרה הכללית של הלימודים הללו היא להראות כיצד ניתן להשתמש במונומר קולגן כדי ליצור באופן הדיר שלושה סוגים שונים של מבני קולגן מסדר גבוה. קולגן טבעי נוצר על ידי העלאת ה-pH של תמיסת מונומר הקולגן; קולגן סיבי בעל מרווחים ארוכים נוצר על ידי שילוב של מונומר קולגן עם alpha one acid glycoprotein; ומבני קולגן בעלי מרווחים ארוכים סגמנטליים נוצרים באופן דומה.קולגן מיוצר על ידי ערבוב מונומר קולגן עם TP. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי כדי לאפיין את שלושת הסוגים השונים של מבני הקולגן שנוצרו. היתרון המרכזי של פרוטוקולים אלו על פני נהלים שפורסמו בעבר הוא שהם פשוטים יותר ובעלי הדירות גבוהה מאוד ביצירת מבני הקולגן הרצויים. פרוטוקולים אלו פותחו במעבדתנו במהלך 10 השנים האחרונות, תוך ניצול מקור מסחרי אמין של מונומר קולגן כחומר התחלתי. את ההליך ידגים Calvin Chang, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, במטרה ליצור סיבי קולגן טבעיים בעלי פסי D-banding ברורים של 67 nanometer.התחילו בחימום מוקדם של בלוק חימום ל-37 °C. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הבאפר בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה על ידי הוספת 4 µL של תמיסת מונומר קולגן בריכוז 3 mg/mL וערבבו היטב. התמיסה המתקבלת צריכה להיות צלולה וחסרת צבע.הנח את התערובת על בלוק חימום שחומם מראש ל-37 °C למשך שלוש עד ארבע שעות כדי ליצור סיבי קולגן טבעיים. התמיסה הסופית אמורה להיות עכורה מעט ותכיל בעיקר סיבי קולגן טבעיים להכנת קולגן בעל מרווחים ארוכים סיביים. ראשית, העבר 1 mL של תמיסת מונומר קולגן בריכוז 3 mg/mL לממברנה בעלת סף גודל מולקולרי (MWCO) של 12 עד 14 kDa.בצע דיאליזה בשלב הבא כנגד 400 milliliters של מים, תוך החלפת המים ארבע פעמים במהלך תקופה של 24 שעות. לאחר מכן, ערבב במבחנת מיקרו-צנטריפוגה 20 µL של מונומר הקולגן שעבר דיאליזה, 20 µL של מים אולטרה-טהורים ו-20 µL של alpha-1-acid glycoprotein בריכוז של 3 mg/mL במים, וערבב.אפשרו לקולגן של מרחקי ריאה סיביים להתרחב בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. במהלך זמן זה, התמיסה תהפוך משקיפה לעכורה כדי ליצור קולגן של מרחקי ריאה סיביים. ראשית, הכינו את הבאפר החומצי במבחנת מיקרו-צנטריפוגה.הוסיפו 40 µL של TP בריכוז 10 mg/mL במים לתמיסת הבאפר וערבבו. לבסוף, הוסיפו 33 µL של תמיסת מונומר קולגן בריכוז 3 mg/mL ב-0.01 N חומצה כלורית וערבבו לאיחוד.אפשרו לקולגן בעל המרווחים הארוכים הסגמנטליים להתבסס בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. הפתרון הסופי בהכנה זו יהיה צלול, בניגוד לשתי צורמות הקולגן האחרות המתוארות. כדי לקבל משטח שטוח ונקי עבור מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) או FM, הדביקו פיסת סרט דביק למצע AFM העשוי MICA וקלפו לפחות שכבה אחת.בדקו את הסרט כדי לוודא ששכבה שלמה הוסרה. לאחר שהתקבל משטח מתאים, טפטפו 20 µL של תמיסת collagen FI על מצע המיקה והמתינו חמש דקות. לאחר חמש דקות, שטפו את הסיבים העודפים על ידי הוספת מים לקצה מצע המיקה והנחיית הזרימה על פני הדגימה למשך 10 עד 15 שניות.אין להוסיף מים ישירות לאזור הדגימה. לאחר מכן, יש לייבש את הפני השטח באמצעות זרם עדין של גז חנקן מקצה אחד של התשתית, תוך הקפדה לא לכוון את הזרם למרכז הדגימה.בדקו את הדגימה תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלה של 200 x כדי לבחון את המרווחים הארוכים הסיביים והטבעיים. דגימות קולגן מראות גושים של סיבים, בעוד שהמרווח הארוך הסגמנטלי של הקולגן אינו נראה. ניתן להבחין בצורה מיטבית במאפיינים הייחודיים של סוגי הקולגן השונים.באמצעות AFM, בצעו סריקה ראשונית של ריבוע בגודל 100 על 100 מיקרומטר, ולאחר מכן בצעו זום לסריקות בגודל של ריבוע של 10 על 10 מיקרומטר, ולבסוף ריבוע של שני על שני מיקרומטר. זאת כדי לצפות במחזוריות הפסים של מרווחי ריאה טבעיים וסיביים. הקולגן היה המאפיין העדין יותר של קולגן במרווחי ריאה סגמנטליים.עבור סיבי קולגן טבעיים, הפעילו את מיקרוסקופ הכוח האטומי (AFM) במצב מגע לסירוגין (intermittent contact mode) תוך שימוש ב probes של סיליקון למדידת מרווחים ארוכים סיביים ומרווחים ארוכים סגמנטליים. עבור סיבי קולגן, הפעילו את מיקרוסקופ הכוח האטומי במצב מגע (contact mode) והשתמשו ב probes של סיליקון ניטריד לקבלת התוצאות הטובות ביותר. בדקו לפחות שני אזורים נוספים בדגימת הקולגן כדי לוודא שהסריקות הראשוניות הן מייצגות.הרזולוציה המרחבית הגבוהה של ה-FM אידיאלית לאפיון ההכנות השונות של קולגן המתוארות בסרטון זה. היא מבדילה בקלות בין סיבי קולגן טבעיים, קולגן סיבי בעל מרווחים ארוכים (fibrous long spacing collagen) וקולגן סגמנטלי בעל מרווחים ארוכים (segmental long spacing collagen). טכניקות של מיקרוסקופיה אופטית, כגון מיקרוסקופיית ניגודיות הפרשיות (differential interference contrast microscopy), מראות את הסיבים אך אינן מסוגלות להציג את המאפיינים בקנה מידה ננומטרי, המבדילים בין שלושת סוגי הקולגן שהוכנו בשיטות אלו. בדגימה טיפוסית, סריקה ריבועית אקראית של 100 על 100 מיקרומטר באמצעות FM מראה לפחות מספר פיברילים נפרדים באורך של 5 עד 50 מיקרון.ניתן לזהות בקלות סיבי קולגן בשלב זה; הגדלה כדי לבחון סריקה בגודל של 10 מיקרומטר רבוע מראה כי כל הסיבים הם בעלי פסיים (banded). על מנת למדוד במדויק את מחזוריות הפסים, מומלץ להגדיל לסריקה בגודל של 2 על 2 מיקרומטר רבוע. הגדלה לסריקה בגודל של 10 על 10 מיקרומטר רבוע מראה כי כל הפברילים הם בעלי פסיים.על מנת למדוד במדויק את מחזוריות הפסים, מומלץ לבצע זום פנימה לגודל סריקה של ריבוע של 2 על 2 מיקרומטר. מחזור הפסים גדל כאשר הקולגן מוכן לפי פרוטוקול הקולגן למרווחים ארוכים (long spacing collagen procedure), המייצר חזרות של 270 ננומטר לאורך הסיב. בדגימה טיפוסית, סריקה אקראית של ריבוע של 100 על 100 מיקרומטר באמצעות FM תראה לפחות מספר סיבים (fibrils).ניתן להבחין במחזוריות הפסים על ידי הגדלה של סריקה ריבועית בגודל 10 על 10 מיקרומטר, והיא ניתנת למדידה בקלות באמצעות סריקה ריבועית בגודל 2 על 2 מיקרומטר. לבסוף, קולגן בעל מרווח ארוך סגמנטלי אינו יוצר סיבים כלל, אלא סגמנטים בודדים. בדגימה טיפית, סריקה ריבועית אקראית של 100 על 100 מיקרומטר באמצעות FM מראה נקודות בודדות רבות.סריקה מרובעת מקרוב של 10 על 10 מיקרומטר מראה מספר קריסטליטים של SLS, וסריקה מרובעת של 2 על 2 מיקרומטר מראה את המבנה העדין יותר של קריסטליט SLS. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להכין מבני קולגן בוגרים טבעיים ואחידים מסוג FLS ו-SLS מקולגן מונומר זמין מסחרית. קולגן הוא חומר תואם ביולוגית המועיל כתשתית או כפיגום לגידול תאים ורקמות.הליך זה יאפשר לכם להתחיל עם מבני קולגן רצויים עבור יישומים אלו ויישומים אחרים.

in-vitro-synthesis-native-fibrous-long-spacing-segmental-long-spacing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטה מתוארת להכנת מטריצה ​​3-ממדית המורכבת מסוג קולגן אני ופיברובלסטים אנושיים ראשוניים. ג'ל organotypic זה משמש כמצע שימושי להעריך נדידת תאים פולשניים כי זה מחק את התכונות בסיסיות של הרקמה סטרומה והוא נוח לצורות רבות של מיקרוסקופיה.

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

מערכת מודל זה מתחילה מג'ל הפיברין myofibroblast-מאוכלס שיכול לשמש כדי לחקור קולגן אנדוגני (מחדש) ארגון בזמן האמת באופן הרסני. מערכת המודל היא מאוד מתכונן, כפי שהוא יכול להיות בשימוש עם מקורות תאים שונים, תוספים בינוניים, וניתן להתאים בקלות לצרכי ספציפיים.

בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)

נהלים מסורתיים לבידוד של קולגן סוג מסיס 1 (col1) דורשים על 10 ימים מהתחלה ועד הסוף בגלל incubations חיץ הארוך ומייגע resuspensions של סיבים. כאן, אנו מתארים אמצעים כדי לטהר col1 מביופסיות עורי קטנים בפחות מ 3 שעות.

שיטה משופרת להכנת סוג I קולגן מעור

הליך זה מדגים in vivo ליד ההדמיה IR הקרינה של פעילויות שיפוץ קולגן בעכברים, כמו גם vivo מכתים לשעבר של collagens בסעיפי רקמות באמצעות פפטידים כוזב קולגן בכלוב שיכול להיות מופעל על תמונה ללהכליא עם גדילי קולגן מפוגלים.

הדמיה גידים קולגן המפוגל<em&gt; בvivo</em&gt; ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; באמצעות הכלאה-מופעל על תמונה של Caged קולגן כוזב פפטידים

קולגן הוא רכיב ליבה של ECM, ומספק רמזים חיוניים מספר תהליכים תאיים החל הגירת בידול ושגשוגם. הניתן כאן הוא פרוטוקול להטבעת תאים בתוך הידרוג קולגן 3D, טכניקה מתקדמת יותר ליצירת מטריצות קולגן אקראי או מיושר באמצעות microchannels PDMS.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין מטריצה ​​מעורבת 2D, המורכב של ג 'לטין קולגן אני, קולגן 3D אני תקע ללימוד invadosomes ליניארי. פרוטוקולים אלה מאפשרים את המחקר של היווצרות invadosome ליניארי, פעילות מטריקס השפלה, ויכולות הפלישה של תאים ראשוניים שורות תאים סרטניים.

2D ו 3D מטריצות לחקר Invadosome לינארי גיבוש ופעילות

מאמר זה מציג אסטרטגיה לבניית מודלים אלמנט סופי של חומרים מוליכים סיביים החשופים לשדה חשמלי (EF). ניתן להשתמש במודלים כדי להעריך את הקלט החשמלי שהתאים שזורעים בחומרים כאלה מקבלים ולהעריך את ההשפעה של שינוי תכונות החומר המרכיבות את הפיגומים, המבנה או הכיוון שלו.

מידול אלמנט סופי של מיקרו-סביבה חשמלית תאית

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בתעלה מיקרופלואידית עם שינוי גיאומטריה לאורך כיוון זרימת הנוזל כדי ליצור מאמץ מאריך (מתיחה) ליישור סיבים בהידרוג'ל קולגן תלת-ממדי (עובי &lt;250 מיקרומטר). היישור המתקבל משתרע על פני מספר מילימטרים ומושפע מקצב המאמץ המתארך.

מיקרו-הנדסה הידרוג'ל קולגן תלת-ממדית עם יישור סיבים לטווח ארוך

הפרוטוקול הבא מציג שיטת שחול מבוססת גזירה לייצור הידרוג'לים של קולגן עם סיבים בדוגמת ננומטר, הניתנת ליישום במגוון רחב של יישומי הנדסת רקמות.

ייצור קולגן בדוגמת ננו-פיברילר להנדסת רקמות

חקור שיטות לסינתזה מבוקרת של שלושה סוגי קולגן ממונומר קולגן מסחרי: קולגן ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח מגזרי. השיטות פשוטות, ניתנות לשחזור ומתאימות למחקר ביוכימי.

בסינתזת מבחנה של ריווח ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח המגזרי

גלה סרטונים נוספים