Name: בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: למדו לבודד פיברובלסטים נורמלים ופיברובלסטים הקשורים לסרטן מרקמות טריות באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS). שיטה זו מבטיחה טוהר גבוה ומזערית זיהום מתאים חיסוניים או אפיתליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר יצחק וOschry ד&quot;ר אורית שגיאה, אסיף על עזרו במיון FACS. מחקר זה נתמך על ידי מענקים לNE מהתכנית השביעית של האיחוד האירופית Framework (FP7/2007-2013) תחת הסכם המענק n ° [276890], מהמלחמה בסרטן האגוד (# 20110078), ומישראל לחקר הסרטן בקרן (המחקר פרס פיתוח קריירה).

1. ביתור רקמת שד או עור מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביתור הרקמה הרצויה מעכברים, להכין את הציוד וריאגנטים הבאים: ספקים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי ניתוח (שטף עם חומר ניקוי ולאחר מכן טבל באתנול 70%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משטח הקלקר לנוח על העכבר במהלך נתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיכות או מחטים להחזיק עכברים במהלך נתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנצנת זכוכית עם מכסה לעיכול, מכילה סרגל סערה מגנטי (autoclaved). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבט מים ב 37 ° C, המכיל stirrer מגנטי צולל ומספיק מים כדי להטביע את צנצנת העיכול, בזמן מנוחה על הצלחת והמערבבים. </li></ul> ריאגנטים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS חיצי: (4 ° C): פוספט של Dulbecco נאגר מלוח CMF (מגנזיום סידן חינם) + 0.5% BSA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון collagenase (שנעשה מייד לפני שימוש): 0.05 גרם collagenase השני 0.05 גרם collagenase IV 0.01 Deoxyribonuclease גרם 20מיליליטר FACS החיץ ראשון שמור על פתרון collagenase על קרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PharmLyse (מגיב Lysing אמוניום כלוריד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS חיץ השני: פוספט של Dulbecco נאגר מלוח CMF + 1% FCS. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיחה של בלוטות חלב (ראה גם 17). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים נקבות עכברים באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על משטח קלקר, הנח את העכבר על הגב שלו ולהצמיד את כל ארבעת הגפיים באמצעות 25 מחטי מד (איור 1 א &#39;) בתקיפות. רסס את העכבר בנדיבות עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים, להרים את עור הבטן בקו האמצע ולעשות חתך קטן במספריים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהחתך, לחתוך את העור עד לצווארו של בעל החיים, תוך הימנעות בפגיעה בחללי בטן או חזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור על רגליו האחוריות מחתך קו האמצע לכיוון הרגל, וכתוצאה מכך &quot;צורת Y&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך עור מגוף של עכבר ולהצמיד, חשיפהבלוטות החלב צמוד לחלק התחתון של העור (1B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Q-טיפים בעדינות כדי להפריד בלוטות חלב מעור תוך חיתוך רקמות &quot;ו חיבור עם מספריים חדים קטנים כדי להפריד את בלוטת החלב לכיוון עמוד השדרה של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטות הבטן (מס &#39;4, 5) הן טובות ביותר עבור פרוטוקול זה. ניתן גם להשתמש בבלוטת החלב -2, אבל לקחת בחשבון שבלוטות אלה נמצאות בסמיכות אנטומית לשריר pectoralis אשר עשוי להיות קשה להיפרד, וכתוצאה מכך תאים ממקור רקמה מעורבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: כאשר מנתחי רקמת גידול, מומלץ להסיר את אזורי נימקים. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקציה של רקמות עור: הדרך הקלה ביותר להשיג רקמת עור, מבלי להתמודד עם הסרת שיער היא להשתמש באוזני עכבר. אם כמות גדולה יותר של רקמה נדרשת, אתה יכול לגלח את השיער מגוף עכבר ולנתח עור. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים באמצעות 2 משאיפת CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חדים, לחתוך את שתי אוזניים ואת המקום מייד בצנצנת המכילה עיכול נפח קטן (~ 0.5 מ&quot;ל) של PBS על קרח. </li></ul></li></ol> 2. הכנת השעית תא חלב בלוטה / עור היחידה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בלוטות / עור בצנצנת המכילה עיכול נפח קטן של PBS על קרח חלב. אם רקמה היא דמים לשטוף x2 עם PBS, ולאחר מכן למחוק את PBS העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברר ביסודיות עם מספריים מעוגלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 פתרון collagenase מ&quot;ל (הערה: כמות זו של פתרון collagenase תהיה יעיל לנתק כ 5 גרם של רקמה ואוזני חלב או גידול מעכברים עד 15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מייד על צלחת מערבבים ב37 ° C אמבט מים, ודגירה במשך 15 דקות תוך ערבוב בקצב בינוני. </li></ul> הערה: זמני דגירה אופטימליות עשויים להשתנות אם לעכל רקמות אחרות. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפסיק את התגובה, להוסיף 30 מ&quot;ל הקר DMEM + 10% FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן את תערובת throug רקמה / מדיהמסננת תא 70 מיקרומטר חה מונחת על גבי צינור 50 מיליליטר חרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור החרוטים למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C. </li></ul> 3. אדומה תמוגה תאי דם הערה: בשלב זה הוא אינו נחוץ אם עכברים היו לב perfused-עם PBS לפני שהם הקריבו. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant באמצעות פיפטה זכוכית מחוברת לואקום, מבלי להפריע לתא הגלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לlyse RBC, resuspend תא גלול ב 10 מיליליטר פתרון PharmLyse ודגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את פתרון PharmLyse ידי ההוספה כ 40 מ&quot;ל של חיץ FACS I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור החרוטים עם תאים למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. </li></ul> 4. חסימה של Fc אנדוגני <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: תאי ספירה כדי לקבוע את הנפח המתאים לשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב1-3 מ&quot;ל FACS חיצי (תלוי oתא מספר n, וכמות הנוגדנים ברצונך להשתמש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף FcBlock (אנטי עכבר CD16/CD32) להגיע 1:50 דילול (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל), ולדגור על קרח למשך 10-20 &#39;. אין צורך לשטוף את FcBlock. </li></ul> 5. הכתמה <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את 100 aliquots μl לצינורות Eppendorf כדי לשמש כשליטה בלתי מוכתמת ופקדי צבע אחד (לפי מספר נוגדני ניאון משמשים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לfibroblasts תווית: להוסיף אנטי PDGFRα (ישירות מצומדת לfluorophore) לדילול 01:50 (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתייג את אוכלוסיות תאים אחרות (תאי מערכת חיסון, למשל, תאי האנדותל מקרופגים וכו &#39;): להוסיף נוגדנים מצומדות fluorescently מתאימים לסמני פני שטח, ל1:50 דילול. </li></ul> הערה: למרות שPDGFRα הוא סמן חזק לfibroblasts, מומלץ לכלול נוגדנים לתאי מערכת חיסוניים ותאי האפיתל במטרה שלא יכלול חיובי כפולאוכלוסיות ובכך לשפר את הטוהר של fibroblasts המבודד. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של כל נוגדנים לכל אחת ממבחנות אפנדורף בקרת הצבע האחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עם נוגדני 1 שעה על קרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף: למלא צינורות עם חיץ FACS אני וספין למשך 5 דקות ב450 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תאי supernatant, resuspend בFACS חיצי לריכוז של כ 2 10 x 6 תאים / מ&quot;ל, או בכל הריכוז המתאים ביותר למיון עם סדרן FACS הזמין שלך. </li></ul> אופציונלי: תאים ניתן resuspended בFACS חיץ השני לתקופת מיון. זה עשוי לשפר את כדאיויות תא. עם זאת, חשיפה לגורמים בסרום עשויה להיות השפעת ביטוי גנים, שיש לבדוק, ונלקח בחשבון. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים שכותרתו לתוך צינורות FACS עם מסנן עליונים: תאי סינון לחצוצרות למניעת גושים סלולריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להוציא את התאים מתים, להוסיף 7AAD (0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) או נכסיודיד idium (PI) קטעים (פרט לשליטה בלתי מוכתמת). </li></ul> הערה: כדי להימנע מבזבוז תאים, אתה יכול להוסיף ל7AAD/PI מדגם בלתי מוכתם, לאחר הרישום בFACS, ולהשתמש בו שוב כשליטת 7AAD בלבד. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור דגימות על קרח בעת ניתוח. </li></ul> 6. בידוד של תאים על ידי FACS (הערה: חלק זה של הפרוטוקול דורש ידע קודם בהפעלת סדרן FACS, למשל BD FACS AriaII, או הסיוע של טכנאי מיומן). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות FACS סדרן התוכנה (BD FACSDiva), להכין חלקות ניתוח מתאימות לניתוח פיזור קדימה (FSC), פיזור הצד (SSC), 7AAD, FITC, PE וכל fluorophore אחר המשמש לתאי תווית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת מדגם זה לסדרן התא, מערבולת בקצרה resuspend תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי ניתוח מדגם הכתם כדי להגדיר gating לאוכלוסיית התאים המוחלטות, לשער החוצה celפסולת הליטר, וכדי לקבוע autofluorescence או כתמי רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח דגימת כתם + 7AAD לקבוע שער והאוכלוסייה של תאי חיים מאוכלוסיית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל שליטת צבע אחד כדי לקבוע וכיול פרמטרים כגון פיצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח דגימה המוכתמת להגדיר את המיקום של שערים למיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שפרמטרים ושערים לאוכלוסיות התאים הרצויים הוגדרו, מתחיל במיון אוכלוסיות התאים שכותרתו לתוך צינורות Eppendorf או 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל המכילים מדיום תרבות או בולם תמוגה רנ&quot;א (כגון RLT חיץ או Trizol). </li></ul> הערה: אם מיון מספר גדול של תאים, זה לא מומלץ למיין ישירות לתוך מאגר תמוגה רנ&quot;א, כנפח הגדול של נוזל נדן מלווה את התאים ידללו את מאגר תמוגה ולהפחית את התשואה. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תאים מייד לאחר מיון הוא סיים, והעברה למדיום טרי או חיץ תמוגה רנ&quot;א, דהתלוי ועומד על מטרת הניסוי שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מיון כדי תאים מבודדים תרבות, לבצע סוג סטרילי. להתאוששות טובה יותר של תאים, להשתמש באדום ללא DMEM פנול + 5% FCS במקום FACS חיץ השני ולאסוף תאים לתרבות בינונית עם 20% FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם culturing מסודר fibroblasts, קולגן alwaysplate על צלחות מצופות ולא ישירות על פלסטיק כזה תוצאות בהפעלה של fibroblasts המוביל לשינויים בביטוי הגנים שלהם. </li></ul>

<ol><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+stromal+fibroblasts+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors.</a> Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).</li>
<li>Ostman, A., Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+and+tumor+growth--bystanders+turning+into+key+players%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players.</a> Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).</li>
<li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1%2FCXCL12+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li>
<li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+interactions+with+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li>
<li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li>
<li>Neumann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+and+passaging+alters+gene+expression+pattern+and+proliferation+rate+in+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts.</a> Arthritis research & therapy. 12, R83Forthcoming.</li>
<li>Sherr, C. J., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+mitotic+clock+or+culture+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: mitotic clock or culture shock.</a> Cell. 102, 407-410 (2000).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+complexity+in+breast+cancer+predicts+overall+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Pahler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+tumor-promoting+inflammation%3A+impairment+of+macrophage+recruitment+evokes+a+compensatory+neutrophil+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response.</a> Neoplasia. 10, 329-340 (2008).</li>
<li>Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+paracrine+PDGF+signaling+in+the+proangiogenic+tumor+stroma+revealed+by+pharmacological+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting.</a> PLoS Med. 5, e19(2008).</li>
<li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).</li>
<li>Xouri, G., Christian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+tumor+stroma+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Origin and function of tumor stroma fibroblasts.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בעוד הניסויים שבוצעו בתרביות רקמה יכולים להיות אינפורמטיבי ולהציע עקרונות פונקציונליים כי ניתן מאומת in vivo, ידוע ששינויים גדולים מתרחשים בביטוי גן בתאים בתרבית 11,12. על מנת להימנע מצעד תרבית רקמה כאשר אפיון ביטוי גנים בfibroblasts, פתחו פרוטוקול המאפשר בידוד של כמו גם פיברובלסטים נורמלים, סרטן הקשורים מעכבר טרי או רקמה אנושית. פרוטוקול זה מיושם בהצלחה ברקמות עור, לבלב ושד מעכבר ואדם מ9. בידוד של fibroblasts באמצעות מיון FACS דורש סמן משטח שfibrobl...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; שם המגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; חברה</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוג</strong</td&gt;<td<strong&gt; תגובות (אופציונלי)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; תעשיות ביולוגיות</td&gt;<td&gt; 02-023-1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Collagenase השני</td&gt;<td&gt; ורטינגטון</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Collagenase IV</td&gt;<td&gt; ורטינגטון</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease</td&gt;<td&gt; ורטינגטון</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; מסננת תא 70 מיקרומטר</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; המטוהר אנטי עכבר CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ויה חללית (7AAD)</td&gt;<td&gt; דואר Bioscience</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; אנטי עכבר CD140a-PE (PDGFRa)</td&gt;<td&gt; דואר Bioscience</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; אנטי עכבר F4/80- FITC</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM w / o אדומה פנול</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; סוג קולגן אני</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 354236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (facs)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

fibroblasts סרטן הקשורים (cafs) הוא סוג התא הבולט ביותר בתוך stroma הגידול של סוגי סרטן רבים, בסרטן השד בפרט, והנוכחות הבולטת שלהם קשורה לעתים קרובות עם 1,2 פרוגנוזה גרוע. Cafs הוא subpopulation הופעל של fibroblasts סטרומה, שרבים מהם להביע את סמן myofibroblast α-SMA ל 3. Cafs מקורן fibroblasts רקמות המקומיים, כמו גם מתאי מוח עצם שהופקו גויסו לגידול לפתח ולאמץ פנוטיפ CAF תחת השפעת גידול microenvironment 4. Cafs הוצג כדי להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות גידול תא, אנגיוגנזה, ופלישת 5-8. אנחנו הוכחנו כי cafs לשפר את צמיחת גידול על ידי תיווך דלקת גידול מקדם, החל בשלבים המוקדמים מראש neoplastic 9. למרות ראיות גוברות של cafs לשחק תפקיד המפתח בקידום צמיחת גידול,Cafs לומד כבר אתגר מתמשך בשל חוסר הסמנים CAF ספציפיים וההטרוגניות העצומה של תאים אלה, עם תת רבים שיתוף קיים בגידול microenvironment 10. יתר על כן, לומד fibroblasts במבחנה מתעכבת עקב העובדה שפרופיל ביטוי הגנים שלהם לעתים קרובות שינה בתרבית הרקמה 11,12. כדי לטפל בבעיה זו ולאפשר ביטוי פרופיל גנטי משוחד של fibroblasts מעכבר רענן ורקמות אדם, פתח שיטה המבוססת על פרוטוקולים קודמים למיון תא Fluorescence-Activated (FACS) 13,14. הגישה שלנו מסתמכת על ניצול PDGFRα כסמן משטח לבודד מעכבר fibroblasts טרי ורקמה אנושית. PDGFRα מתבטא בשפע על ידי שני fibroblasts וcafs 9,15 הנורמלים. שיטה זו מאפשרת בידוד של אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הרגיל, כולל, אך לא מוגבלת ל- SMA α + הופעל myofibroblasts. fibroblasts מבודד אז יכול להיותהמשמש לאפיון והשוואה של האבולוציה של ביטוי גנים המתרחשת בcafs במהלך tumorigenesis. ואכן, אנו ואחרים דיווחו על פרופיל ביטוי של fibroblasts בודד על ידי תא מיון 16. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה לבודד ופרופיל אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts מרקמות עור שד, סרטן לבלב וסרטן ריאות. יתר על כן, השיטה שלנו מאפשרת גם culturing של תאים ממוינים, על מנת לבצע ניסויים פונקציונליים וכדי למנוע זיהום על ידי תאים סרטניים, אשר לעתים קרובות מכשול גדול כאשר מנסה cafs התרבות.

שימוש PDGFRα כסמן לתוצאות פיברובלסטים בבידוד של אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts רקמות. רמת הטוהר לאחר המיון הייתה 99%, כלכמת את הניתוח שלאחר המיון (איור 2 א). הערכת אחוז תאים שאינם מזהם פיברובלסטים על ידי הביטוי היחסי של גני בקרת תא ספציפיים (האיור 2B) בדרך כלל מראה זיהום 0.1-0.6%. רמה זו של טוהר מאפשרת יצירת פרופילי transcriptome איכות גבוהה של fibroblasts המבודד 9. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direc...

Fibroblasts Associated הסרטן (cafs) להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות, אנגיוגנזה, ודלקת. כאן אנו מתארים שיטה לבודדה אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הנורמלי מעכבר רענן ורקמות אדם על ידי מיון תא, באמצעות PDGFRα כסמן פני שטח.

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) הם סוג התאים הבולט ביותר בתוך הסטרומה הגנונית של סוגי סרטן רבים, ובמיוחד בקרצינומה של השדיים, והם...

מטרת פרוצדורה זו היא לבודד פיברובלסטים נורמליים וכאלה הקשורים לסרטן מרקמות טריות. הדבר מתבצע תחילה על ידי הפרדה כירורגית של בלוטות החלב. השלב השני הוא הכנת תרחיפי תאים בודדים מבלוטות החלב, ולאחר מכן שימור התאים באמצעות נוגדנים ספציפיים לפיברובלסטים, וכן נוגדנים ספציפיים לאוכלוסיות תאים אחרות.השלב הסופי הוא ביצוע מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS). לבסוף, נעשה שימוש בפרופיל ביטוי של Q-R-T-P-C-R עבור סממנים ספציפיים המבוטאים באוכלוסיות התאים הממוינות כדי להעריך את טוהרן של אוכלוסיות תאים אלו. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לבידוד פיברובלסטים הוא שהיא מאפשרת בידוד של רוב הפיברובלסטים מהרקמה עם זיהום מינימלי של תאים חיסוניים או תאים אפיתליאליים, תוך הימנעות משלב של תרבית רקמה שעשוי לשנות את פרופיל ביטוי הגנים של הפיברובלסטים.השלכותיה של טכניקה זו חלות על כל טיפולי סרטן השד, שכן הבנה וזיהוי של מטרות מולקולריות עשויים לספק גישה שילובית חדשנית למאבק בהתקדמות סרטן השד, להארכת הישרדות המטופלים ובסופו של דבר לסייע בשיפור והתאמה של אפשרויות טיפוליות אינדיבידואליות. בנוסף לעין שלך, ד"ר Lena, מנהלת המעבדה, תדגים את הפרוצדורה. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הניחו את נקבת העכבר לאחר ההדשיה על גבה על משטח קלקר והשתמשו במחטים בכילוב (gauge) 25 כדי להצמיד בחוזקה את ארבע הגפיים.רססו את העכבר בנדיבות ב-70% ethanol תוך שימוש בפינצטה. משכו למעלה את עור הבטן בקו האמצע ובצעו חתך קטן בעזרת מספריים חדים החל מהנקודה הראשונה. גזרו את העור עד לצווארו של בעל החיים, תוך הקפדה להימנע מניקור חללי הבטן והחזה.חתכו את העור ברגליים האחוריות מהחתך המרכזי לכיוון הרגליים, כך שייווצר צורת Y. לאחר מכן, משכו את העור מהגוף של העכבר והצמידו אותו בעזרת סיכות כדי לחשוף את בלוטות החלב המחוברות לצד הפנימי של העור. אחד השלבים המאתגרים ביותר בפרוצדורה זו הוא להימנע מהסרת רקמת שריר.כדי למנוע בעיה זו, אקח רק את בלוטות החלב הרביעית והחמישית ולא את השנייה, הנמצאת בסמיכות גבוהה לרקמת השריר. השתמשו במקלוני צמר גפן כדי להפריד בעדינות את בלוטת החלב מהעור, תוך써 גזירת הרקמה המחברת בעזרת מספריים קטנים וחלקים כדי להפריד את בלוטת החלב לכיוון עמוד השדרה של העכבר, והסִירו כל אזור נמק שנמצא. העבירו את בלוטות החלב המבודדות ל-PBS על קרח.הדרך הקלה ביותר להשיג רקמת עור ללא צורך בהסרת שיער היא להשתמש באוזני עכבר. השתמשו במספריים חדות כדי לגזור את שתי האוזניים מהעכבר לאחר ההמתה. הניחו את האוזניים מיד בצנצנת עיכול המכילה נפח קטן של PBS על קרח.כדי להכין תרחיף תאים בודדים מבלוטת החלב, השתמשו במספריים מעוקלים כדי לקצוץ ביסודיות את בלוטות החלב בתוך כלי עיכול המכיל נפח קטן של PBS על קרח, והוסיפו 20 מיליליטר של תמיסת קולגנאז לרקמה הקצוצה. כמות זו של תמיסת קולגנאז תפרק ביעילות כחמישה גרמים של רקמת שדי או רקמת גידול ואוזניים מעד 15 עכברים. הניחו מיד על פלטת ערבוב בבן מרחץ מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius והדגיתו למשך 15 דקות תוך כדי ערבוב בקצב בינוני; כדי לעצור את התגובה, הוסיפו 30 מיליליטר של DMEM קר בתוספת 10%FCS.בשלב הבא, סננו את תערובת הרקמה והמדיום דרך מסנן תאים של 70 micron המונח על גבי מבחנה קונית של 50 milliliter. סבבו את המבחנה הקונית בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-450 times G בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. אם העכברים לא עברו פרפוזיה של הלב עם PBS לפני ההקרבה, יהיה צורך לבצע ליזיס לתאי הדם האדומים בדגימה לפני הצביעה האימונולוגית.יש לחסום קולטני Fc אנדוגניים לפני סימון פיברובלסטים ואוכלוסיות תאים אחרות. השעו את התאים ב-1 עד 3 מיליליטר של FACS buffer 1, ולאחר מכן הוסיפו FC block בדילול של 1:50. הדגירו על קרח למשך 10 עד 20 דקות. אין צורך לשטוף את ה-FC block; העבירו מנות של 100 µL תאים לפעולות בתוך פרועות Eppendorf שיהשמשו כביקורת לא צבועה וכביקורות לצבע בודד.בהתאם למספר הנוגדנים הפלואורסצנטיים המשמשים בהדגמה זו, ייעשה שימוש בשני נוגדנים פלואורסצנטיים לסיתמון פיברובלסטים באמצעות anti PDGF receptor alpha. נוגדן זה מצומד באופן ישיר לפלואור בדילול של 1:50 לדגימה המיון, וכן לבקרות הצבע הבודדות לסיתמון אוכלוסיות תאים אחרות. הוסיפו את הנוגדנים המתאימים המצומדים פלואורסצנטית לסמני שטח גם כן בדילול של 1:50.מומלץ להוסיף נוגדנים גם למבחנות בקרת צבע בודד מתאימות, כולל נוגדנים לתאי מערכת החיסון ולתאים אפיתליאליים, וזאת כדי לשלול אוכלוסיות כפולות-חיוביות ובכך להגביר את טוהר הפיברובלאסטים המבודדים. לאחר מכן, דגרו את התאים עם הנוגדנים למשך שעה אחת על קרח בחושך; לאחר שעה, שטפו את התאים על ידי מילוי המבחנות ב-fax buffer one וסבב של חמש דקות ב-450 ×g בטמפרטורה של 4 °C. שאבו את העל-מישוב ותלו את התאים מחדש ב-fax buffer one בריכוז המתאים ביותר למיון באמצעות המיון ב-fax sorter שבו תשתמשו. העבירו את התאים המסומנים למבחנות fax עם מכסי סינון וסננו את התאים לתוך המבחנות כדי למנוע התגבשות של תאים ולשלול תאים מתים.הוסף DPI לכל הדגימות למעט לביקורת ללא צביעה. שמור את הדגימות על קרח במהלך ניתוח ה-fax. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בתוכנת המיון (sorter) כדי להכין את הגדרות הפלואורסצנציה, הגדרות הרכישה והגדרות הטיפה ההידרודינמית.ערבבו כל דגימה במיקסר (Vortex) למשך זמן קצר כדי להשעות מחדש את התאים לפני הטענתם לממיס התאים (cell sorter). התחילו בניתוח הדגימה ללא צבע כדי להגדיר את השערים (gating) עבור כלל אוכלוסיית התאים, במטרה לסנן שיירי תאים ולקבוע את האוטופלואורסנציה או את צביעת הרקע. לאחר מכן, נתחו את הדגימה ללא צבע בתוספת DPI כדי לקבוע ולהגדיר את שער אוכלוסיית התאים החיים מתוך כלל אוכלוסיית התאים.נתחו כל אחת מבקרות הצבע הבודדות כדי לקבוע ולכייל פרמטרים כגון פיצוי (compensation). נתחו את דגימת הצביעה כדי להגדיר את מיקומי השערים (gates) למיון. לאחר שנקבעו הפרמטרים והשערים עבור אוכלוסיות התאים הרצויות, התחילו במיון אוכלוסיות התאים המסומנות לתוך מבחנות eph או מבחנות קוניות של 15 מיליליטר המכילות מצע גידול או בופר לליזיס של RNA.מיד לאחר סיום המיון, סבבו את התאים במצנטריפוגה והעבירו אותם למצע טרי או למסלק RNA. בהתאם למטרת הניסוי, אם הפיברובלסטים הממוינים מיועדים לתרבית, יש לשתול אותם תמיד בצלחות מצופות קולגן ולעולם לא ישתול אותם ישירות על פלסטיק, שכן הדבר יגרום להפעלת הפיברובלסטים ולהמשך שינויים בביטוי הגנים שלהם. שימוש ב-PDGF receptor alpha כסמן לפיברובלסטים מאפשר בידוד של אוכלוסיות מועשרות מאוד של פיברובלסטים רקמתיים.בדוגמה זו, תרחיפי תאים בודדים של בלוטות חלב של עכבר צבעו עם נוגדנים לקולטן PDGF alpha ו-F four 80. תרשים מיון התאים מוצג בפנל השמאלי, כאשר P two הוא שער הפיברובלסטים, ו-P four הוא שער המקרופאגים. ניתוח לאחר המיון בוצע כדי לקבוע את רמת הטוהר של הפיברובלסטים הממוינים המוצגים בפנל הימני ושל המקרופאגים המוצגים בפנל האמצעי.האיור הבא מציג ניתוח של טוהר המקור באמצעות Q-R-T-P-C-R של גנים בקרתיים ספציפיים לתאים עבור פיברובלסטים, תאי מערכת החיסון ותאים אפיתליאליים. התוצאות ננורמלו לשני גנים של תמיכה ביתית (housekeeping genes), ga, DH ו-mgus, והביטוי היחסי ל-gap. DH מוצג; ניתוחים מסוג זה מראים בדרך כלל זיהום של 0.1 עד 0.6%.רמה זו של טוהר מאפשרת ביצוע פרופילינג איכותי של התמלול (transcriptome) של פיברובלסטים מבודדים. כימות של ביטוי קולטן PDGF אלפא באוכלוסייה לא ממוינת של פיברובלסטים של בלוטות החלב מעיד כי כ-85% מסך הפיברובלסטים של הרקמה בבלוטות החלב הם חיוביים לקולטן PDGF אלפא. בידוד.ניתן לתרבת פיברובלסטים ישירות לאחר מיון, אך הם עשויים להזדקק למספר ימים כדי להתאושש. חיוני לבצע את כל הניסויים הבאים עם תאים בעלי מספר מעברים נמוך, מכיוון שפיברובלסטים ראשוניים עוברים הבחנה (senescence) במהלך השכפול. בתרבית, ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.אם התאים המופרדים מיועדים לתרבית, חשוב לזכור לבצע את כל הפרוצדורה בתנאים סטריליים. בצילום זה, לא ביצענו מיון סטרילי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים אוכלוסייה מועשרת מאוד של פיברובלסטים מרקמה טרייה.

isolation-normal-cancer-associated-fibroblasts-from-fresh-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד תאי האנדותל הלימפה בדופן כלי אנושיים מום הלימפה כמו ציסטה-ועורלות באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS). culturing התא הבא והתרחבות של תאים אלה מאפשרים רמה חדשה של תחכום ניסיוני למחקרים גנטיים, proteomic, פונקציונליים והתמיינות תאים.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

התנהגות פיברובלסטים עומדת בבסיס ספקטרום של ישויות קליניות, אך הן נשארות מאופיינות בצורה גרועה, בעיקר בשל ההטרוגניות הטבועה בהן. מחקר פיברובלסטים מסורתי מסתמך על מניפולציה במבחנה, המסווה התנהגות פיברובלסטים in vivo. אנו מתארים פרוטוקול מבוסס FACS לבידוד פיברובלסטים של עור עכבר שאינו דורש תרבית תאים.

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

כאן, מוצג פרוטוקול לבידוד והקמת תרביות פיברובלסטים/מיופיברובלסטים ראשוניים (MF) מתאי קיבה, מעי דק ורקמות מעי גס קפואים עם פנוטיפ MF. תאים אלה מבטאים CD90, α-SMA ווימנטין. MFs יכולים לשמש למגוון בדיקות פונקציונליות כולל פעילות אנזימטית וייצור ציטוקינים.

בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מבוסס-FACS לבידוד של העור האנושי ושרירי הלסת. זה חוסם בתרבות מבחנה אשר היה בלתי נמנע עם פרוטוקול הבידוד הנפוץ ביותר דרך תרבויות ההסבר. ערכות המשנה שמקורם הפיצוץ הם ברורים מבחינה פונקציונלית ולהציג ביטוי גנים דיפרנציאלי ולוקליזציה בתוך dermis.

הבידוד של העור האנושי על ידי מיון תאים שהופעלו על ידי קרינה פלואורסצנטית ורשתית

אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את הפיברוטים הראשוניים העיקריים באופן קל, מהיר ואמין, performable על ידי למתחילים (למשל, סטודנטים). הליך זה משלב את העיכול ברקמה אנזימטית ועצבנות מכנית עם גלי אולטרה סאונד כדי להשיג פיברוהטיות ראשונית. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לדרישות נסיוניות ספציפיות (לדוגמה, רקמת אדם).

אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ

קבלת אוכלוסייה טהורה של פיברותקיעות חיונית כדי ללמוד את תפקידם בתיקון פצעים פיברוזיס. המתואר כאן היא שיטה מפורטת כדי לבודד את הפיברוכדורים ומיוריסותליות מלבבות העכבר שנפגעו ונפצעו ולאחר מכן אפיון הטוהר והפונקציונליות שלהם על ידי immunofluorescence RTPCR, מיון תאים בסיוע פלואורסצנטית, ו התכווצות ג'ל לקולגן.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

מאמר זה נועד לספק פרוטוקול לבידוד ותרבות של פיברובלסטים הקשורים לסרטן ראשוני ממודל מורין סינגני של סרטן שד טריפל שלילי ויישומה למחקר פרה-אקליני של חלקיקים חדשניים שנועדו למקד את המיקרו-סביבה של הגידול.

בידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן ראשוני ממודל מורין סינגני של סרטן השד לחקר חלקיקים ממוקדים

הזיהוי המדויק של תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ותאי גזע של שרירים (MuSCs) הוא קריטי לחקר תפקודם הביולוגי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מספק הנחיות לבידוד, לטיהור ולתרבות של FAPs ו-MuSCs משרירי עכברים בוגרים.

בידוד ותרבית FACS של אבות פיברו-אדיפוגניים ותאי גזע של שרירים משרירי שלד עכברים לא מופרעות ופצועים

ספרואידים רב-תאיים של גידולים תלת-ממדיים הוכנו עם תאי אדנוקרצינומה של הריאה, פיברובלסטים ומונוציטים, ולאחר מכן בידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) מהספרואידים האלה. CAFs מבודדים הושוו לפיברובלסטים רגילים כדי להעריך את בריאות המיטוכונדריה על-ידי חקירת הפוטנציאל הטרנס-ממברני של המיטוכונדריה, מיני חמצן תגובתי ופעילויות אנזימטיות.

הערכה של בריאות המיטוכונדריה בפיברובלסטים הקשורים לסרטן שבודדו מספרואידים של גידולי ריאה רב-תאיים תלת-ממדיים

פרוטוקול זה מספק הליך מקיף לבידוד, הרחבה והנצחה של פיברובלסטים מכריתת ערמונית רדיקלית. יתר על כן, הוא מתאר מבחנים שפותחו כדי להעריך את ההשפעות התפקודיות של דיבור צולב בין תאי פיברובלסטים-גידול, תוך ניצול הן של טיפול במדיום מותנה והן של תרבית משותפת.

בידוד, תרבית ואפיון של פיברובלסטים הקשורים לסרטן הערמונית

למדו לבודד פיברובלסטים נורמלים ופיברובלסטים הקשורים לסרטן מרקמות טריות באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS). שיטה זו מבטיחה טוהר גבוה ומזערית זיהום מתאים חיסוניים או אפיתליים.

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

גלה סרטונים נוספים