בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

Fibroblasts Associated הסרטן (cafs) להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות, אנגיוגנזה, ודלקת. כאן אנו מתארים שיטה לבודדה אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הנורמלי מעכבר רענן ורקמות אדם על ידי מיון תא, באמצעות PDGFRα כסמן פני שטח.

מטרת הליך זה היא לבודד פיברובלסטים רגילים וקשורים לסרטן מרקמות טריות. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של בלוטות החלב. השלב השני הוא הכנת בלוטות חלב, תרחיפי תאים בודדים, התא הבא הנתמך עם נוגדנים ספציפיים לפיברובלסטים, כמו גם נוגדנים ספציפיים לאוכלוסיות תאים אחרות.

השלב האחרון הוא לבצע מקורות תאים או עובדות מופעלות פלואורסצנטיות. בסופו של דבר, פרופיל ביטוי Q-R-T-P-C-R של סמנים ספציפיים המתבטאים באוכלוסיות התאים הממוינות משמש להערכת הטוהר של אוכלוסיות התאים הממוינות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות לבידוד פיברובלסטים הוא בכך שהיא מאפשרת בידוד של רוב הפיברובלסטים ברקמות עם זיהום מינימלי על ידי תאי חיסון או תאי אפיתל, תוך הימנעות משלב תרבית רקמה שעלול לשנות את פרופיל ביטוי הגנים של הפיברובלסטים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על כל הטיפול בסרטן השד מכיוון שהבנה וזיהוי מטרות מולקולריות עשויות לספק גישת קומבינטור חדשה למאבק בהתקדמות סרטן השד, להאריך את הישרדות המטופלת ובסופו של דבר לעזור לשפר ולהתאים אפשרויות טיפוליות מותאמות אישית. בנוסף לעין שלך, ד"ר לנה לבדה, מנהל המעבדה ידגים את ההליך כדי להתחיל בהליך זה. הנח את העכבר הנקבה שהורדמה על גבו על משטח קלקר והשתמש במחטים בגודל 25 כדי להצמיד היטב את כל ארבעת הגפיים.

רססו את העכבר בנדיבות עם 70% אתנול באמצעות מלקחיים. משוך כלפי מעלה את עור הבטן בקו האמצע ובצע חתך קטן עם מספריים חדים החל מהחתך. חותכים את העור עד צוואר החיה תוך הימנעות מניקוב חללי בית החזה בבטן.

חותכים את העור ברגליים האחוריות מהחתך בקו האמצע לכיוון הרגל, וכתוצאה מכך צורת Y. לאחר מכן, הרחיקו את העור מגוף העכבר והצמידו כלפי מטה וחשפו את בלוטות החלב המחוברות לחלק התחתון של העור. אחד הדברים הבעייתיים ביותר בהליך זה הוא להימנע מנטילת רקמת שריר.

על מנת להימנע מבעיה זו, אקח רק את בלוטת החלב הרביעית והחמישית ולא את השנייה, שנמצאת בסמיכות לרקמת השריר. השתמש בקצות Q כדי להפריד בעדינות את בלוטת הזיכרון מהעור תוך חיתוך רקמת הלחמית במספריים חדות קטנות כדי להפריד את בלוטת הזיכרון לכיוון עמוד השדרה של העכבר, הסר את כל האזורים הנמקיים שנמצאו. הנח את בלוטות הזיכרון המנותחות ב-PBS על קרח.

הדרך הקלה ביותר להשיג רקמת עור מבלי להתמודד עם הסרת שיער היא להשתמש באוזני עכבר. השתמש במספריים חדים כדי לנתק את שתי האוזניים מהעכבר שהורדם. מניחים את האוזניים מיד בצנצנת עיכול המכילה נפח קטן של PBS על קרח.

להכנת תרחיף תא בודד של בלוטת החלב השתמש במספריים מעוקלים כדי לטחון היטב את בלוטות החלב בצנצנת עיכול המכילה נפח קטן של PBS על קרח, הוסף 20 מיליליטר תמיסת קולגנאז לרקמת הטחון. כמות זו של תמיסת קולגנאז תנתק ביעילות כחמישה גרם של זיכרון או רקמת גידול ואוזניים מעד 15 עכברים. מניחים מיד על צלחת ערבוב באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים למשך 15 דקות תוך ערבוב בקצב בינוני כדי לעצור את התגובה ב -30 מיליליטר DMEM קר בתוספת 10% FCS.

לאחר מכן, מסננים את תערובת הרקמה והמדיה דרך מסננת תאים של 70 מיקרון המונחת על גבי צינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה של הצינור החרוטי למשך חמש דקות ב-450 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. אם העכברים לא היו חדורי לב עם PBS לפני ההקרבה, תאי הדם האדומים בדגימה יצטרכו להיות שקרים לפני צביעה חיסונית.

יש לחסום תאים ל-FC אנדוגני לפני תיוג פיברובלסטים ואוכלוסיות תאים אחרות. Resus השהה תאים ב-1 עד 3 מיליליטר של מאגר פקס אחד, ולאחר מכן הוסף בלוק FC בדילול של 1 עד 50 דגירה על קרח למשך 10 עד 20 דקות. אין צורך לשטוף את בלוק ה-FC להעביר 100 מיקרוליטר תאים כדי להוציא צינורות orph שישמשו כבקרה לא מוכתמת ובקרות צבע יחיד.

בהתאם למספר הנוגדנים הפלואורסצנטיים המשמשים בהדגמה זו, שני נוגדנים פלואורסצנטיים ישמשו לסימון פיברובלסטים בקולטן אלפא נגד PDGF. זה מצומד ישירות לפלואור בדילול של 1 עד 50 לדגימת המיון, כמו גם בקרות הצבע הבודד כדי לתייג אוכלוסיות תאים אחרות. הוסף את הנוגדנים המצומדים פלואורסצנטיים המתאימים לסמני פני השטח גם בדילול של 1 עד 50.

מומלץ להוסיף נוגדנים גם לצינורות בקרה בצבע יחיד מתאימים, כולל נוגדנים לתאי חיסון ותאי אפיתל על מנת לשלול אוכלוסיות חיוביות כפולות ובכך לשפר את הטוהר של פיברובלסטים מבודדים. לאחר מכן, דגרו על התאים בנוגדנים למשך שעה על קרח בחושך לאחר שעה שטפו את התאים על ידי מילוי צינורות במאגר פקס אחד וסיבוב במשך חמש דקות ב-450 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס, US aspirate sate ו-resus bend cells במאגר פקס אחד לריכוז המתאים ביותר למיון עם סדרן הפקס לשימוש. העבר תאים מסומנים לצינורות פקס עם צמרות סינון ותאי סינון לתוך הצינורות כדי למנוע גושי תאים, גושים כדי לא לכלול תאים מתים.

DPI לכל הדגימות למעט הבקרה הלא מוכתמת. שמור דגימות על קרח במהלך ניתוח פקס. כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בתוכנת מיון העובדות כדי להכין את הגדרת הפלואורסצנט, הגדרת הרכישה והגדרת הטיפה ההידרודינמית.

מערבולת כל דגימה לזמן קצר כדי להשעות מחדש תאים לפני הטעינה לסדרן התאים. התחל בניתוח הדגימה הלא מוכתמת על מנת להגדיר את השער עבור אוכלוסיית התאים הכוללת כדי להוציא פסולת תאים ולקבוע אוטופלואורסצנטיות או צביעת רקע. לאחר מכן, נתח את הדגימה הלא מוכתמת בתוספת DPI כדי לקבוע ולשער את אוכלוסיית התאים החיים מכלל אוכלוסיית התאים.

נתח כל פקד צבע בודד כדי לקבוע ולכייל פרמטרים כגון פיצוי. נתח את דגימת הכתם כדי להגדיר את מיקום השערים למיון. לאחר שנקבעו הפרמטרים והשערים לאוכלוסיות התאים הרצויות, התחל למיין את אוכלוסיות התאים המסומנות לצינורות eph או צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר המכילים מדיום תרבית או מאגר ליזה RNA.

מיד לאחר סיום המיון, מסובבים תאים כלפי מטה ומעבירים למדיום טרי או למאגר ליזה RNA. בהתאם למטרת הניסוי שלך, אם ממוין, יש לתרבית פיברובלסטים, תמיד צלחת על צלחות מצופות קולגן לעולם לא צלחת ישירות על פלסטיק, מכיוון שהדבר יביא להפעלת הפיברובלסטים שיובילו לשינויים בביטוי הגנים שלהם. שימוש בקולטן PDGF אלפא כסמן לפיברובלסטים מביא לבידוד אוכלוסיות מועשרות מאוד של פיברובלסטים ברקמות.

בדוגמה זו, תרחיפי תאים בודדים של בלוטות החלב של העכבר נצבעו בנוגדנים אלפא של קולטן PDGF ו-F 4 80. תרשים מיון העובדות מוצג בפאנל השמאלי שבו P 2 הוא שער הפיברובלסטים, ו-P 4 הוא שער המקרופאגים. ניתוח לאחר המקור בוצע כדי לקבוע את טוהר הפיברובלסטים הממוינים המוצגים בפאנל הימני והמקרופאגים המוצגים בפאנל האמצעי.

האיור הבא מציג ניתוח של טוהר המקור על ידי Q-R-T-P-C-R של גנים בקרה ספציפיים לתאים עבור פיברובלסטים, תאי חיסון ותאי אפיתל. התוצאות נורמלו לשני גנים של משק בית, ga, DH ו-mgus, וביטוי יחסי לפער. DH מוצג שניתוחים כאלה מראים בדרך כלל זיהום של 0.1 עד 0.6%.

רמת טוהר זו מאפשרת פרופיל טרנסקריפטום באיכות גבוהה של פיברובלסטים מבודדים. כימות ביטוי אלפא של קולטן PDGF באוכלוסייה לא ממוינת של פיברובלסטים חלביים מצביע על כך שכ-85% מכלל הפיברובלסטים ברקמות בבלוטות החלב הם חיוביים לקולטן אלפא PDGF. התבודדתי.

ניתן לתרבית פיברובלסטים ישירות לאחר המיון, אך עשויים לדרוש מספר ימים להתאוששות. חיוני לבצע את כל הניסויים הנוספים עם תאי עיסוי נמוכים מכיוון שפיברובלסטים ראשוניים עוברים הזדקנות במהלך ההתפשטות. בתרבות, לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.

אם התאים השלישיים מיועדים לתרבית, מיובא לזכור לבצע את כל ההליך בתנאים סטריליים. בצילום הזה לא ביצענו מיון סטרילי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד אוכלוסייה מועשרת מאוד של פיברובלסטים מרקמה טרייה.