Name: Microgavage של זחלי דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למדו שיטת מיקרוגאבג' לזחלי דג זברה באמצעות ציוד מיקרו-הזרקה סטנדרטי. טכניקה בטוחה ויעילה להעברת חומרים ישירות ללומן המעי לחקר תהליכים ביולוגיים ופיתוחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת Rawls על הצעות מועילות בנוגע לתוכן, ולד"ר Alan Fanning על דיונים בעלי ערך בנושא חדירות לגודל של צומת מהודק (tight junction) ושיטות להרסו. אנו מודים גם לד"ר Michael Chua ולד"ר Neal Kramarcy ממתקן המיקרוסקופיה Michael Hooker על התמיכה במיקרוסקופ קונפוקאלי. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health) מספרים T32 DK007737-15 (לחניך J.L.C.), F32 DK094592 (עבור J.L.C.), ו-R01 DK081426 (עבור J.F.R.).

<ol><li>Kuhlman, J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+mutations+affecting+development+and+function+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system.</a> Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).</li>
<li>Pack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+zebrafish+digestive+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of zebrafish digestive organs.</a> Development. 123, 321-328 (1996).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).</li>
<li>Hama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+digestive+organ+function+using+multiple+quenched+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).</li>
<li>Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-content+model+system+for+studies+of+gastrointestinal+transit%3A+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish.</a> Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).</li>
<li>Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+single+lumen+formation+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut.</a> Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).</li>
<li>Bagnat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cse1l+is+a+negative+regulator+of+CFTR-dependent+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion.</a> Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).</li>
<li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).</li>
<li>Brugman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone-induced+enterocolitis+in+zebrafish+depends+on+the+composition+of+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota.</a> Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+bowel+disease+%28IBD%29+susceptibility+genes+NOD1+and+NOD2+have+conserved+anti-bacterial+roles+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish.</a> Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).</li>
<li>Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+intestinal+cancer+models%3A+unraveling+gastrointestinal+homeostasis+and+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 361-376 (2009).</li>
<li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study.</a> Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).</li>
<li>Kanther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+colonization+induces+dynamic+temporal+and+spatial+patterns+of+NF-kappaB+activation+in+the+zebrafish+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract.</a> Gastroenterology. , (2011).</li>
<li>Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+zebrafish+reveal+evolutionarily+conserved+responses+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).</li>
<li>Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+genetic+analysis+link+bacterial+motility+and+symbiosis+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Bates, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+from+the+microbiota+promote+different+aspects+of+zebrafish+gut+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation.</a> Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).</li>
<li>Cheesman, S. E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+know+you+are+in+there%3A+conversing+with+the+indigenous+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota.</a> Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).</li>
<li>Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+detoxifies+lipopolysaccharide+and+prevents+inflammation+in+zebrafish+in+response+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota.</a> Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+cis-regulatory+modules+mediate+tissue-specific+and+microbial+control+of+angptl4%2Ffiaf+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription.</a> PLoS Genetics. , In Press (2012).</li>
<li>Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+proliferation+in+the+developing+zebrafish+intestine+is+regulated+by+the+Wnt+pathway+and+microbial+signaling+via+Myd88%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).</li>
<li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+pore+and+leak+pathways%3A+a+dynamic+duo%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).</li>
<li>Van Itallie, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+density+of+small+tight+junction+pores+varies+among+cell+types+and+is+increased+by+expression+of+claudin-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2.</a> J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).</li>
<li>Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+size-dependent+permeability+of+the+tight+junction+using+PEG+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling.</a> Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).</li>
<li>Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+of+tight+junctions+in+intestinal+cell+monolayers+using+polyethylene+glycol+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).</li>
<li>Rodgers, L. S., Fanning, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial+permeability+by+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+formation+in+cultured+epithelial+cells+%28MDCK%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK).</a> J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).</li>
<li>Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+regulation+of+tight-junction+permeability+and+structure+in+Necturus+gallbladder%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder.</a> Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).</li>
<li>Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+gut+motility+control+system+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).</li>
<li>Rich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit-like+immunoreactivity+in+the+zebrafish+gastrointestinal+tract+reveals+putative%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative.</a> 236, 903-911 (2007).</li>
<li>Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+and+TTX-insensitive+control+of+spontaneous+gut+motility+in+the+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae.</a> J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).</li>
<li>Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+peristalsis+in+the+guinea-pig+small+intestine+using+spatio-temporal+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio.</a> J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Clifton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+inhibitors+of+dietary+lipid+absorption+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish.</a> PLoS One. 5, e12386(2010).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+offer+the+potential+for+a+primary+screen+to+identify+a+wide+variety+of+potential+anticonvulsants%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants.</a> Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).</li>
</ol>

לא הצהרו על ניגודי עניינים.

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול חדש להחדרה ישירה של חומרים למעי של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרו-גavage. ישנם מספר שלבים קריטיים לאורך ההליך שיש לקחת בחשבון. ראשית, זחלי דגי הזברה צריכים להיות במצב בריאותי טוב לפני ניסוי ה-gavage כדי למנוע מקרי מוות שאינם קשורים לטיפול. גורם חשוב נוסף הוא איכות מחט ה-gavage. אחד החלקים הקשים ביותר בפרוטוקול הוא חיתוך המחט במיקום המתאים מבלי ליצור קצוות חדים ומשוננים. ניתן להשתמש במיקרופורג' (microforge) של מיקרופיפטה כדי להשיג שבירה עקבית יותר ולבצע ליטוש באש (fire-polish) לקצוות המחט כדי ל...

<table><tbody><tr><td>פינקל (Tricaine methanesulfonate)</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>MS-222</td><td>הרדמת זחלים</td></tr><tr><td>תמיסת Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100 ml</td><td>0.5% ב-DPBS, נבחן לתרביות תאים</td></tr><tr><td>שמן מינרלי, קל, לבן (בטוהר גבוה)</td><td>Amresco</td><td>J217-500 ml</td><td>למילוי חוזר של המחט ובדיקת נפח</td></tr><tr><td>TxRed-Dextran, 10,000 MW, lysine fixable</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>D-1863</td><td>סספנסיה של 1% ב-1x PBS/phenol red</td></tr><tr><td>FM4-64FX</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>F34653</td><td>תמיסת מלאי של 5 mM במים</td></tr><tr><td>מתילצלולוז</td><td>MP Biochemicals</td><td>0215549590</td><td></td></tr><tr><td>קפילריות זכוכית בורוסיליקט</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td>OD 1.14 mm, ID 0.53 mm, אורך 3.5 in</td></tr><tr><td>תבנית פלסטיק ליצירת תבניות</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>יחידת מיקרו-הזרקה Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>שובב מיקרו-פיפטות להבאה בלהבה, חריץ פילמנט ברוחב 3.0 mm</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97, FT330B</td><td>ייצור מחטים</td></tr><tr><td>פינצטה Student Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>0.1 x 0.06 mm, קיטום מחטים</td></tr><tr><td>סרגל עינית, 5 mm - 100 חלוקות</td><td>Leica</td><td>10394771</td><td>קיטום מחטים</td></tr><tr><td>מיקרו-פורג' (Microforge)</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>קיטום מחטים והחלקת להבה</td></tr><tr><td>מחט מזרק Tuberculin SlipTip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>1 ml, מחט 25G 5/8</td></tr><tr><td>מיקרו-ספירות Fluoresbrite YG (2.0 &amp;mu;m)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18338</td><td>ניתוח מוטיליות מעיים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td>הליך גavage</td></tr><tr><td>סטריאו-מיקרוסקופ פלואורסצנציה</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td>בדיקת מחסום דקסטראן</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>דימוי של דקסטראן במחזור הדם</td></tr></tbody></table>

microgavage של זחלי דג זברה

Microgavage of Zebrafish Larvae

דג הזברה הפך לאורגניזם מודל רב-עוצמה לחקר התפתחות המעי1-5, פיזיולוגיה6-11, מחלות12-16 ואינטראקציות בין המאחסן למיקרובים17-25. גישות ניסיוניות לחקר הביולוגיה של המעי דורשות לעיתים קרובות הכנסה in vivo של חומרים נבחרים לתוך חלל המעי. במודל של זחלי דג זברה, הדבר משיג בדרך כלל על ידי טבילה של הדגים בתמיסה של החומר הנבחר, או על ידי הזרקה דרך דופן הבטן. בשיטת הטבילה, קשה לנטר או לשלוט במדויק בנתיב או בתזמון של אספקת החומר למעי. מסיבה זו, חשיפה באמצעות טבילה עלולה לגרום לרעילות לא מכוונת ולהשפעות אחרות על רקמות מחוץ למעי, מה שמגביל את טווח הכמויות הפוטנציאלי של החומרים שניתן להחדיר למעי. כמו כן, כמות החומר הנבלעת במהלך חשיפה בטבילה עשויה להשתנות משמעותית בין זחלים בודדים26. למרות שבעיות אלו אינן מופיעות במהלך הזרקה ישירה דרך דופן הבטן, ביצוע הזרקה נכונה הוא קשה וגורם לנזק רקמתי שעלול להשפיע על תוצאות הניסוי. אנו מציגים שיטה למיקרו-גבג' (microgavage) של זחלי דג זברה. מטרתה של שיטה זו היא לספק דרך בטוחה, יעילה ועקבית להחדרת חומרים ישירות לחלל המעי הקדמי בזחלי דג זברה בתזמון מבוקר. מיקרו-גבג' משתמש בציוד סטנדרטי להזרקה מיקרוסקופית של עוברי דגים ובסטריאומיקרוסקופיה, הנפוצים ברוב המעבדות המבצעות מחקרים בדגי זברה. לאחר שהדגים ממוקמים כראוי במתילצלולוז, ניתן לבצע את הגבג' במהירות בקצב של כ-7-10 דגים לדקה, ושיעור ההישרדות לאחר הגבג' שואף ל-100% תלוי בחומר שהוכנס. אנו מראים גם כי מיקרו-גבג' מאפשר טעינה של חלל המעי בריכוזים גבוהים של חומרים שהם קטלניים לדגים כאשר הם נחשפים באמצעות טבילה. כדי להדגים את התועלת של שיטה זו, אנו מציגים בדיקת מיקרו-גבג' של דקסטראן פלואורסצנטי שניתן להשתמש בה כדי לכמת את המעבר מחלל המעי למרחבים מחוץ למעי. בדיקה זו יכולה לשמש לאימות ביצוע תקין של הליך המיקרו-גבג', וכן מספקת בדיקה חדשנית בדגי זברה לבחינת שלמות מחסום האפיתל של המעי תחת תנאים ניסיוניים שונים (למשל מניפולציה גנטית, טיפול תרופתי או חשיפה לגורמים סביבתיים). יתרה מכך, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בגבג' להערכת מוטיליות המעי על ידי הזרקה של מיקרוספירות פלואורסצנטיות וניטור המעבר שלהן לאחר מכן. ניתן להשתמש במיקרו-גבג' להחדרת חומרים מגוונים כגון מיקרואורגניזמים חיים, גורמים/רעלנים מיקרוביאליים מוקרטים, סוכנים פרמקולוגיים וגששים פיזיולוגיים. עם יכולות אלו, לשיטת המיקרו-גבג' בזחלי דג זברה יש פוטנציאל לשפר מגוון רחב של תחומי מחקר המשתמשים במודל דג הזברה.

כאשר הגavage מבוצע כראוי, החומר שהועבר צריך להיות כלוא כולו בתוך המעי הקדמי, עם מעט מאוד חומר שאריות או ללא חומר בכלל בוושט (איור 3). יש לבחור נפח הזרקה שניתן להכיל בתוך הפקעת הקדמית ושאינו דולף דרך הקלואקה או הוושט. אם נפח החומר או לחץ ההזרקה גבוהים מדי, הכוח הפיזי של הגavage עלול להוביל לנזק לאפיתל או לדליפה דרכו. הדבר עלול גם לדחוף החוצה או לשנות מרכיבים אחרים של הסביבה הלומנלית (למשל, מרה או ריר), מה שעלול לשנות את הסביבה הביוכימית המקומית ולגרום לשיבוש בתוצאות. באופן כללי, נסיגה מהירה של המ...

אנו מציגים שיטה חדשנית למיקרו-גבג' (microgavage) של זחלי דגי זברה תוך שימוש בציוד סטנדרטי להזרקה של עוברים ובמיקרוסקופ סטריאו. אנו מדגימים כי מיקרו-גבג' היא טכניקה בטוחה ויעילה, המועילה להחדרה של כמויות מבוקרות של חומרים מגוונים באופן ספציפי אל תוך חלל המעי של זחלי דגי זברה.

Microgavage של זחלי דג זברה

דג הזברה הפך לאורגניזם מודל רב-עוצמה לחקר התפתחות המעי1-5, פיזיולוגיה6-11, מחלות12-16, ואינטראקציה בין מאח ומיקרובים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא מתן חומרים דרך הפה אל תוך הלומן של המעי בזריקי zebrafish. ראשית, הזחלים מורדמים ומונחים על תבנית הזרקה מצופה במתיל צלולוז. לאחר מכן, הזחלים טובלים בעדינות בתוך התבנית ומיושרים עם הזווית של מחט הגavage והמיקרו-מניפולטור.לאחר מכן, מחדירים את המחט אל תוך פיו של הזחליל ומכוונים אותה אל הנורית המעיים. ברגע שהמחט במקומה, משחררים את החומר אל תוך הלומן. השלב הסופי הוא להוציא את הזחליל מהמתיל-צלולוז ולהעבירו למצע טרי כדי להתאושש מההרדמה.בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להחדיר חומרים באופן ספציפי ללומן של המעי בזריקים של דגי זברה, שם ניתן לחקור את ההובלה בתוך המעי או ברקמות חוץ-מעיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טבילה במים המכילים את החומר הנחקר, הוא שניתן לשלוט באופן קפדני בכמות החומר המוחדרת לבעל החיים, כמו גם בתזמון ובמינון. דבר זה מפחית את השונות הניסויית ובמקרים מסוימים את הרעילות הקשורה לחומרים מסוימים.הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר נתקלנו בקשיים בהחדרת גששים פלואורסצנטיים מסוימים בריכוזים גבוהים מספיק כדי שיהיו ניתנים לזיהוי ברכיב האפיתל של המעי באמצעות מיקרוסקופיה. ריכוזים גבוהים עלולים לעיתים להוביל למות הדגים, ועדיין לא להניב אות פלואורסצנטי חזק מספיק לצורך דימוי. לשלב ההתחלה, משכו מספר מחטי גavage באמצעות מושך מיקרו-פיפטות ושאלו קפילריות מזכוכית סיליקה.עברו למיקרוסקופ סטריאואופטי כדי לקצץ את המחטים. ראשית, יישרו את קצה המחט עם קצה של סרגל שקוף או דף גרפי. לאחר היישור, השתמשו בפינצטה עדינה של שעוניים כדי לקצץ את המחט במרחק של כ-1 millimeter מקצהה.בחן את קצה המחט בהגדלה של 100 פעמים. קוטר המחט צריך להיות כ-27 עד 30 מיקרונים והיא צריכה להיות קהה. יש להימנע ממחטים חדות או משוננות כדי להבטיח תוצאות עקביות יותר.ניתן להשתמש במיקרו-נforge כדי לשלוט טוב יותר בנקודת הקיפול של המחט ולבצע ליטוש באש למחט. קצו את הקצוות החדים. לאחר מכן, הכין את תמיסת ה-gavage.עבור רוב היישומים, מוסיפים פנול אדום (phenol red) כדי לסייע בויזואליזציה של המיקרו-מזריק ובמיקום של תמיססת ה-gavage. לאחר המילוי בשמן מינרלי, התקינו את מחט ה-gavage על יחידת המיקרו-הזרקה nano jet two. עטפו צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 10 סנטימטר בביופילם כדי לספק משטח שטוח וחסין מים, וטפטפו כ-2 µL מתמיססת ה-gavage על גבי הפארא-פילם.השלב הבא הוא מילוי ידני לאחור (backfill) של מחט הגavage. יש להיזהר לא להכניס בועות אוויר אל תוך השמן המינרלי. כדי לכוון את נפח ההזרקה, הזרקו טיפות קטנות לתוך צלחת פטרי קטנה מלאה בשמן מינרלי עד שגודלן יהיה עקבי, מדדו את קוטר הטיפות באמצעות הגרפיקה וחשבו את נפח הטיפה.העקביות בין המחטים מוצגת כאן. לפני שימוש במחט להזנה (gavage), הסיר שאריות של שמן מינרלי על ידי שטיפה בתמינה נקייה לגידול דגי זברה. לאחר חימום תבנית הארוס (aros mold), כסה שלושה חריצים ב-3% methyl cellulose. יש לכסות את החריץ בכמות מספקת כדי להחזיק את הדג, אך לא בכמות קטנה מדי שתיגרום ל-methyl cellulose להתייבש במהירות.בשלב הבא, העבירו מנה של כארבעה מיליליטרים של מדיום לדגי zebrafish לתוך בארי של פלטה בעלת שש בארי, והעבירו זחלי zebrafish עבור כל קבוצה ניסיונית לבארי נפרדים. כדי להרדימ את הדגים, הכינו תמיסת tricaine בריכוז של פי שלושה במדיום מתאים לדגי zebrafish. פעם אחת לבארי.הרדימו את הדגים על ידי ערבוב של נפח שווה של תמיסת trica לתוך המצע וסיבוב עדין. ברגע שהדגים מפסיקים לזוז, השתמשו בפיפטת סטיר בעלת פיית זכוכית רחבה כדי להעביר אותם אחד אחד אל תוך המתיל-צלולוז, כאשר ראשיהם מונחים על זווית 45 מעלות של החריץ וזנבותיהם פונים לעבר זווית 90 מעלות של החריץ. השתמשו במוט דיסקציה קהה כדי ללחוץ בעדינות על כל דג אל תוך המתיל-צלולוז, במטרה לייצב את מיקומם.בשלב הבא, כווננו את מתקן המיקרו-הזרקה nano jet two כך שהמחט תהיה נטוי במישור זוויתי רדוד. וודאו שטווח ההארכה יהיה מספיק כדי להגיע אל מעבר לתחתית הבאר. כדי לצמצם את הצורך בכיוונונים עתידיים, הגדירו את יחידת המיקרו-הזרקה לשחרור של 4.6 nanoliters באמצעות הגדרת הזרקה איטית (slow inject setting); השתמשו ביד אחת לביצוע כיוונונים קלים של הפלטה המכילה את הזחליים המקובעים, וביד השנייה לשליטה במניפולטור המיקרו של יחידת המיקרו-הזרקה.בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בתחילה, מכיוון שדגי zebrafish הם קטנים מאוד ופגיעים לפגיעה. נדרש תרגול כדי לזהות את מבנה הוושט תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי, וכדי לקבוע את כמות הלחץ המתאימה שיש להפעיל על מחט ה-gavage כדי להגיע לחלל המעי. ראשית, הכניסו בעדינות את מחט ה-gavage לתוך פיו של דג המורדם.עברו דרך הוושט והפעילו לחץ קל על הסוגר הוושטי כדי להחדיר את הקצה ממש בתוך הדופן הקדמית של המעי. לאחר הכניסה לנבב (bulb) הקדמי, מזגו בעדינות את החומר בהגדרות אלו. הנפח המוזרק צריך למלא בדיוק את הנבב הקדמי של המעי ולא לדלוף מהוושט או מהקלואקה (cloaca).שלפו את המחט במהירות ובחלק. הקפידו לא לשחרר כמויות משמעותיות של חומר אל תוך הוושט. לאחר הסרת מחט ההזנה, העבירו את הדג לכלי המכיל מצע טרי.העילו את הזחלים מההרדמה והסירו את המתיל-צלולוז על ידי שטיפתם במצע טרי מספר פעמים. העבירו את הזחלים לצלחת פטרי או לפלטה בעלת שישה בארות עד למועד השימוש. לצורך ניתוחים עוקבים, ניתן להשתמש במיקרו-גבג' (micro gavage) להחדרת חומרים שונים למערכת העיכול של דגי הזברה.ראשית, הכינו את תמיסאות הגavage הדרושות כדי להדגים שיטה זו. 10 KD dextran המשורבב ל-Texas Red משמש לניתוח של שלמות המחסום של האפיתל במעי.בצעו גavage לקבוצות של 10 עד 20 זחלי zebrafish עבור כל תנאי ניסויי, בהתאם לשלבים שהודגמו קודם לכן. חזרו על הפעולה בקבוצות כפולות או משולשות במידת האפשר. לאחר הגavage, המתינו להתאוששות הזחלים מההרדמה ואפשרו להם לשחות בחופשיות במצע טרי.לאחר כ-20 דקות, הרדימו שוב את הזחלים כפי שהודגם קודם לכן. לאחר ההרדמה, מקמו את הזחלים ב-3% methyl cellulose מעל בלוק של 3% agarose. דגמו את תמונת הזחלים באמצעות מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי ומסנן Texas red, ובחרו הגדלה המציגה את הזחלים מהחלק הקדמי (snout) ועד לאזור שמיד מאחורי סוף ה-cloaca. הפלואורסצנציה צריכה להיות עזה בתוך חלל המעי.עם זאת, תפקוד המחסום מוערך לפי רמת הדקסטראן המופיעה ברקמות מחוץ למעי; יש להתאים את החשיפה כדי לאפשר ויזואליזציה של הפלורסצנציה בגו. גם אם הדבר גורם לחשיפת יתר של הפלורסצנציה הלומנלית כאשר הדקסטראן מוגש לבדו, הדקסטראן נשאר בתוך לומי המעי. עם זאת, בזחלים שקיבלו במקביל EDTA, אשר משבש את הצומתים ההדוקים של האפיתל, הדקסטראן נראה במחזור הדם ובכלי דם ובחללים מסביב למעי.בדוגמאות אלו, נעשה שימוש ב-Image J כדי לכמת את ממוצע הפלואורסצנציה היחסי באזור עניין (ROI) בגוף דג הזברה, אשר נורמל ביחס ל-ROI מחוץ לדג כביקורת פנימית. כאן, תוצאות ממחט רגילה מושוות לאלו של מחט micro forge. פחות זחלים בקבוצת הדקסטרין בלבד הפגינו פלואורסצנציה חוץ-מעית, מה שמרמז כי מחטי micro forge נוטות פחות לגרום נזק לזחלים.בבחינה מקרובה יותר של אזור אחד, ניתן לראות שוב כי ה-dextran מוגבל ללומן של המעי מבלי לדלוף לכלי הדם או לחללים מחוץ למעי. בהיעדר EDTA, כאשר ה-dextran מוזרק יחד עם EDTA, ניתן להבחין בו בחללים מחוץ למעי ובתוך הלומן של האורטה הגבית והוריד הקרדינלי האחורי; אות הדם כאן נובע מזרימת הדם. בעת ביצוע פרוצדורה זו, ודאו שלסיכה אין קצוות משוננים, שהדגים ממוקמים היטב ומעוגנים ב-Methylcellulose, והיו זהירים וסבלניים בזמן הלמידה של תמרון הסיכה דרך הוושט של הזחלים.ניתן להשתמש בטכניקה זו במגוון רחב של יישומים בדגי הזברה הדורשים הכנסה מבוקרת או ויזואליזציה של חומרים בתוך המעי. היא מאפשרת בקרה קפדנית על התזמון, נתיב ההגשה והמינון המוחדר לבעל החיים, ומפחיתה באופן משמעותי את השונות בתוך ניסוי אחד ובין ניסויים שונים.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מראה כיצד morpholino או mRNA יהיה ניתן להזריק לתוך עוברי דג הזברה בשלב אחד התא כדי להגדיל או להקטין את רמת המוצרים גן מסוים במהלך ההתפתחות הבאים.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

מקור: לי, ג'. ואחרים. פיתוח מודל זיהום דג זברה זחל עבור Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).הסרטון הזה מדגים את הליך המיקרוגבאז', שבו זחל דג זברה מורדם משותק באגרוז ומוזרק דרך הפה לחיידק פתוגני באמצעות מחט מונחית על ידי טרייסר. המשלוח הלא פולשני מדמה זיהום טבעי, ומאפשר ניתוח של שכפול חיידקים, שחרור רעלים ונזק אפיתל במעי.

פיתוח מודל זיהום זחל בדג זברה באמצעות מיקרוגאבאז'

השימוש הגובר של דג הזברה כמודל חיה דורש פיתוח שיטות יעילות לאספקה ​​של כמויות ידועות של תרכובות ופתרונות. ההליך המתואר להלן gavage מאפשר משלוח האוראלי של כמויות מדויקות של פתרון אמין, בטוח ויעיל לדג זברה מבוגר.

Gavaging דג הזברה למבוגר

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

מניפולציות ממוקדות לגרימת מתח מכוון או מוות בתאים בודדים היו קשות יחסית לביצוע. כאן, מתוארת גישת אבלציה ברזולוציה של תא יחיד ללחץ סלקטיבי ולהרוג תאים בודדים בתרבית תאים ובבעלי חיים על בסיס לייזר UV קונפוקלי סטנדרטי.

מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד רקמת האשכים של דג הזברה הזחל, אשר יקל על חקירות של בידול מין דג הזברה ותחזוקה.

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

אבלציה בלייזר היא טכנולוגיה ישימה לחקר התחדשות במערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מתאר שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר לאבלציה בלייזר והדמיית זמן-לשגות של התחדשות תאים interneuromast בקו רוחבי של דגי הזברה.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

בהירות אופטית היא יתרון משמעותי לעבודה הביולוגית והפיזיולוגית של התא בדגי זברה. מתוארות שיטות חזקות למדידת צמיחת תאים בבעלי חיים בודדים המאפשרות תובנות חדשות על האופן שבו צמיחת שרירי השלד והרקמות השכנות משולבת עם צמיחת כל הגוף.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

פרוטוקול זה מדגים את המיקרו-הזרקה של ליפופוליסכריד לאזור חדר המוח במודל של זחל דג זברה כדי לחקור את התגובה הנוירו-דלקתית והרעילות העצבית המתקבלות כתוצאה מכך.

מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

למדו שיטת מיקרוגאבג' לזחלי דג זברה באמצעות ציוד מיקרו-הזרקה סטנדרטי. טכניקה בטוחה ויעילה להעברת חומרים ישירות ללומן המעי לחקר תהליכים ביולוגיים ופיתוחיים.

Microgavage של זחלי דג זברה

גלה סרטונים נוספים