Microgavage של זחלי דג זברה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא מתן חומרים דרך הפה אל תוך הלומן של המעי בזריקי zebrafish. ראשית, הזחלים מורדמים ומונחים על תבנית הזרקה מצופה במתיל צלולוז. לאחר מכן, הזחלים טובלים בעדינות בתוך התבנית ומיושרים עם הזווית של מחט הגavage והמיקרו-מניפולטור.

לאחר מכן, מחדירים את המחט אל תוך פיו של הזחליל ומכוונים אותה אל הנורית המעיים. ברגע שהמחט במקומה, משחררים את החומר אל תוך הלומן. השלב הסופי הוא להוציא את הזחליל מהמתיל-צלולוז ולהעבירו למצע טרי כדי להתאושש מההרדמה.

בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להחדיר חומרים באופן ספציפי ללומן של המעי בזריקים של דגי זברה, שם ניתן לחקור את ההובלה בתוך המעי או ברקמות חוץ-מעיות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון טבילה במים המכילים את החומר הנחקר, הוא שניתן לשלוט באופן קפדני בכמות החומר המוחדרת לבעל החיים, כמו גם בתזמון ובמינון. דבר זה מפחית את השונות הניסויית ובמקרים מסוימים את הרעילות הקשורה לחומרים מסוימים.

הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר נתקלנו בקשיים בהחדרת גששים פלואורסצנטיים מסוימים בריכוזים גבוהים מספיק כדי שיהיו ניתנים לזיהוי ברכיב האפיתל של המעי באמצעות מיקרוסקופיה. ריכוזים גבוהים עלולים לעיתים להוביל למות הדגים, ועדיין לא להניב אות פלואורסצנטי חזק מספיק לצורך דימוי. לשלב ההתחלה, משכו מספר מחטי גavage באמצעות מושך מיקרו-פיפטות ושאלו קפילריות מזכוכית סיליקה.

עברו למיקרוסקופ סטריאואופטי כדי לקצץ את המחטים. ראשית, יישרו את קצה המחט עם קצה של סרגל שקוף או דף גרפי. לאחר היישור, השתמשו בפינצטה עדינה של שעוניים כדי לקצץ את המחט במרחק של כ-1 millimeter מקצהה.

בחן את קצה המחט בהגדלה של 100 פעמים. קוטר המחט צריך להיות כ-27 עד 30 מיקרונים והיא צריכה להיות קהה. יש להימנע ממחטים חדות או משוננות כדי להבטיח תוצאות עקביות יותר.

ניתן להשתמש במיקרו-נforge כדי לשלוט טוב יותר בנקודת הקיפול של המחט ולבצע ליטוש באש למחט. קצו את הקצוות החדים. לאחר מכן, הכין את תמיסת ה-gavage.

עבור רוב היישומים, מוסיפים פנול אדום (phenol red) כדי לסייע בויזואליזציה של המיקרו-מזריק ובמיקום של תמיססת ה-gavage. לאחר המילוי בשמן מינרלי, התקינו את מחט ה-gavage על יחידת המיקרו-הזרקה nano jet two. עטפו צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 10 סנטימטר בביופילם כדי לספק משטח שטוח וחסין מים, וטפטפו כ-2 µL מתמיססת ה-gavage על גבי הפארא-פילם.

השלב הבא הוא מילוי ידני לאחור (backfill) של מחט הגavage. יש להיזהר לא להכניס בועות אוויר אל תוך השמן המינרלי. כדי לכוון את נפח ההזרקה, הזרקו טיפות קטנות לתוך צלחת פטרי קטנה מלאה בשמן מינרלי עד שגודלן יהיה עקבי, מדדו את קוטר הטיפות באמצעות הגרפיקה וחשבו את נפח הטיפה.

העקביות בין המחטים מוצגת כאן. לפני שימוש במחט להזנה (gavage), הסיר שאריות של שמן מינרלי על ידי שטיפה בתמינה נקייה לגידול דגי זברה. לאחר חימום תבנית הארוס (aros mold), כסה שלושה חריצים ב-3% methyl cellulose. יש לכסות את החריץ בכמות מספקת כדי להחזיק את הדג, אך לא בכמות קטנה מדי שתיגרום ל-methyl cellulose להתייבש במהירות.

בשלב הבא, העבירו מנה של כארבעה מיליליטרים של מדיום לדגי zebrafish לתוך בארי של פלטה בעלת שש בארי, והעבירו זחלי zebrafish עבור כל קבוצה ניסיונית לבארי נפרדים. כדי להרדימ את הדגים, הכינו תמיסת tricaine בריכוז של פי שלושה במדיום מתאים לדגי zebrafish. פעם אחת לבארי.

הרדימו את הדגים על ידי ערבוב של נפח שווה של תמיסת trica לתוך המצע וסיבוב עדין. ברגע שהדגים מפסיקים לזוז, השתמשו בפיפטת סטיר בעלת פיית זכוכית רחבה כדי להעביר אותם אחד אחד אל תוך המתיל-צלולוז, כאשר ראשיהם מונחים על זווית 45 מעלות של החריץ וזנבותיהם פונים לעבר זווית 90 מעלות של החריץ. השתמשו במוט דיסקציה קהה כדי ללחוץ בעדינות על כל דג אל תוך המתיל-צלולוז, במטרה לייצב את מיקומם.

בשלב הבא, כווננו את מתקן המיקרו-הזרקה nano jet two כך שהמחט תהיה נטוי במישור זוויתי רדוד. וודאו שטווח ההארכה יהיה מספיק כדי להגיע אל מעבר לתחתית הבאר. כדי לצמצם את הצורך בכיוונונים עתידיים, הגדירו את יחידת המיקרו-הזרקה לשחרור של 4.6 nanoliters באמצעות הגדרת הזרקה איטית (slow inject setting); השתמשו ביד אחת לביצוע כיוונונים קלים של הפלטה המכילה את הזחליים המקובעים, וביד השנייה לשליטה במניפולטור המיקרו של יחידת המיקרו-הזרקה.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו בתחילה, מכיוון שדגי zebrafish הם קטנים מאוד ופגיעים לפגיעה. נדרש תרגול כדי לזהות את מבנה הוושט תחת מיקרוסקופ סטריאואופטי, וכדי לקבוע את כמות הלחץ המתאימה שיש להפעיל על מחט ה-gavage כדי להגיע לחלל המעי. ראשית, הכניסו בעדינות את מחט ה-gavage לתוך פיו של דג המורדם.

עברו דרך הוושט והפעילו לחץ קל על הסוגר הוושטי כדי להחדיר את הקצה ממש בתוך הדופן הקדמית של המעי. לאחר הכניסה לנבב (bulb) הקדמי, מזגו בעדינות את החומר בהגדרות אלו. הנפח המוזרק צריך למלא בדיוק את הנבב הקדמי של המעי ולא לדלוף מהוושט או מהקלואקה (cloaca).

שלפו את המחט במהירות ובחלק. הקפידו לא לשחרר כמויות משמעותיות של חומר אל תוך הוושט. לאחר הסרת מחט ההזנה, העבירו את הדג לכלי המכיל מצע טרי.

העילו את הזחלים מההרדמה והסירו את המתיל-צלולוז על ידי שטיפתם במצע טרי מספר פעמים. העבירו את הזחלים לצלחת פטרי או לפלטה בעלת שישה בארות עד למועד השימוש. לצורך ניתוחים עוקבים, ניתן להשתמש במיקרו-גבג' (micro gavage) להחדרת חומרים שונים למערכת העיכול של דגי הזברה.

ראשית, הכינו את תמיסאות הגavage הדרושות כדי להדגים שיטה זו. 10 KD dextran המשורבב ל-Texas Red משמש לניתוח של שלמות המחסום של האפיתל במעי.

בצעו גavage לקבוצות של 10 עד 20 זחלי zebrafish עבור כל תנאי ניסויי, בהתאם לשלבים שהודגמו קודם לכן. חזרו על הפעולה בקבוצות כפולות או משולשות במידת האפשר. לאחר הגavage, המתינו להתאוששות הזחלים מההרדמה ואפשרו להם לשחות בחופשיות במצע טרי.

לאחר כ-20 דקות, הרדימו שוב את הזחלים כפי שהודגם קודם לכן. לאחר ההרדמה, מקמו את הזחלים ב-3% methyl cellulose מעל בלוק של 3% agarose. דגמו את תמונת הזחלים באמצעות מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי ומסנן Texas red, ובחרו הגדלה המציגה את הזחלים מהחלק הקדמי (snout) ועד לאזור שמיד מאחורי סוף ה-cloaca. הפלואורסצנציה צריכה להיות עזה בתוך חלל המעי.

עם זאת, תפקוד המחסום מוערך לפי רמת הדקסטראן המופיעה ברקמות מחוץ למעי; יש להתאים את החשיפה כדי לאפשר ויזואליזציה של הפלורסצנציה בגו. גם אם הדבר גורם לחשיפת יתר של הפלורסצנציה הלומנלית כאשר הדקסטראן מוגש לבדו, הדקסטראן נשאר בתוך לומי המעי. עם זאת, בזחלים שקיבלו במקביל EDTA, אשר משבש את הצומתים ההדוקים של האפיתל, הדקסטראן נראה במחזור הדם ובכלי דם ובחללים מסביב למעי.

בדוגמאות אלו, נעשה שימוש ב-Image J כדי לכמת את ממוצע הפלואורסצנציה היחסי באזור עניין (ROI) בגוף דג הזברה, אשר נורמל ביחס ל-ROI מחוץ לדג כביקורת פנימית. כאן, תוצאות ממחט רגילה מושוות לאלו של מחט micro forge. פחות זחלים בקבוצת הדקסטרין בלבד הפגינו פלואורסצנציה חוץ-מעית, מה שמרמז כי מחטי micro forge נוטות פחות לגרום נזק לזחלים.

בבחינה מקרובה יותר של אזור אחד, ניתן לראות שוב כי ה-dextran מוגבל ללומן של המעי מבלי לדלוף לכלי הדם או לחללים מחוץ למעי. בהיעדר EDTA, כאשר ה-dextran מוזרק יחד עם EDTA, ניתן להבחין בו בחללים מחוץ למעי ובתוך הלומן של האורטה הגבית והוריד הקרדינלי האחורי; אות הדם כאן נובע מזרימת הדם. בעת ביצוע פרוצדורה זו, ודאו שלסיכה אין קצוות משוננים, שהדגים ממוקמים היטב ומעוגנים ב-Methylcellulose, והיו זהירים וסבלניים בזמן הלמידה של תמרון הסיכה דרך הוושט של הזחלים.

ניתן להשתמש בטכניקה זו במגוון רחב של יישומים בדגי הזברה הדורשים הכנסה מבוקרת או ויזואליזציה של חומרים בתוך המעי. היא מאפשרת בקרה קפדנית על התזמון, נתיב ההגשה והמינון המוחדר לבעל החיים, ומפחיתה באופן משמעותי את השונות בתוך ניסוי אחד ובין ניסויים שונים.