ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

פרוטוקול זה מבסס פלטפורמה חדשנית של תרבית משותפת של אקסונים עצביים ואסטרוגליה (Astroglia) לצורך ניתוח אינטראקציות בין נוירונים לתאי דבקה (ggl) באמצעות דימוי ברזולוציה גבוהה. ראשית, יש להרכיב את תא התרבית המיקרופלואידי, להכין תרביות נוירונים ולעודד את האקסונים העצביים להיכנס לצדו השני של ה-MCP. לאחר מכן, יש להוסיף אסטרוציטים מתורבדים כדי לבסס מערכת תרבית משותפת מופרדת למחיצות; תוצאות, כולל דימוי של שינויים לאורך זמן (time-lapse) באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית, יכולות לסייע בהבנת האינטראקציות בין אקסונים, אסטרוגליה ואקסונים עצביים.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ניסינו להפריד בין ההשפעה של תהליכים עצביים לבין הפרשה עצבית על הבקרה של ה-GT. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו להוביל את האקסון לחלק אחר של המדור הצילולרי. הדבר דורש צפיפות גבוהה של נוירונים בריאים שנזרעו בצד הנוירונלי, כאשר הנוירונים נזרעים בקרבת התעלות המרכזיות.

תאי ה-MCP הפתוחים מיועדים לתרביות מופרדות של סוגים שונים של תאים; ציפויים של פוליאוריטן ולמינין נחוצים לזריעת נוירונים ואסטרוציטים בתרבית משותפת (co-culture). ראשית, מרססו תמיסת פוליאוריטן בריכוז 1 mg/mL על צלחות עם תחתית זכוכית סטריליות והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה. שטפו את צלחות הזכוכית המצופות שלוש פעמים במים מזוקקים פעמיים, ולאחר מכן הניחו אותן תחת מנדף סטרילי לייבוש.

בשלב הבא, יש לצפות את הצלחת ב-1 mg/mL laminin ולייבש תחת אור UV למשך שעה אחת. יש להכין את הרכבת ה-MCP על הצלחת בעלת התחתית הזכוכיתית טרי לפני השימוש. מקמו את פלטפורמת התרבית המיקרופלואידית כך שתעליי הדרכים המקשרים המרכזיים יפנו כלפי מטה, וצרו איטום הדוק עם הזכוכית המצופה.

צלחות תחתונות. הוסף מצע גידול רגיל לנוירונים או לאסטרוציטים משני צדדיו של ה-MCP המורכב. דגרי את התא למשך שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורה של 37 °C וודא שאין דליפה בין ה-MCP לזכוכית.

מנתח תחתון. תרביות של תאי עצב קורטיקליים מוכנות באופן טרי ממוחות של עכברים עובריים בני 14 עד 16 ימים. לאחר הדיסקציה של מוח העכבר, הסר את הקרומים מהקורטקס תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

השתמשו בלהב תער כדי לקצוץ את הרקמה לבלוקים קטנים של רקמה והעבירו את חתיכות הרקמה למבחנה לאחר סבב צנטריפוגה. השליכו את המצע שמעל למשקע והוסיפו 0.05% Try למשך 10 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. הפרידו את התאים באמצעות טריטורה עדינה עם פיפטת פסטור שעברה ליטוש באש.

סננו את הדגימה דרך מסננת של 70 micron כדי לקבל תרחיף תאי עצבים צלול. השתמשו במדיום לזריעת תאי עצבים המועשר ב-5% FBS. זרעו 150 microliters של תאי עצבים בצדו הימני של לוח ה-MCP המורכב.

צפיפות גבוהה של נוירונים, שכן רק הנוירונים הנצמדים לאזור שימור התאים מסוגלים לגדל אקסונים דרך התעלות המרכזיות אל הצד השני של ה-MCP המורכב. ביום למחרת, שאבו בזהירות את המצע מאזור זריעת התאים של התא והחליפו את מצע זריעת הנוירונים במצע גידול נוירונים רגיל.

תוסיף למצע, בריכוז של 20 nanograms per milliliter, glial derived neurotrophic factor או GDNF לצד האסטרוציטים של התא. פעולה זו יוצרת מפל כימי שיסייע להשראת צמיחת אקסונים מהצד הנוירונלי דרך התעלות המרכזיות של ה-MCP המורכב. לאחר יומיים, יש לבחון את נוכחותם של אקסונים הנכנסים לתעלה המרכזית.

לאחר שהאקסונים נכנסים לתעלת המרכז, הם בדרך כלל מגיעים לצד השני תוך יום אחד. האקסונים נותרים בדרך כלל שלמים למשך שבוע אחד לפחות לאחר כניסתם לצד השני. לאחר הפרדת המוח מעכברים בגיל P1 עד P3, זורעים אסטרוציטים לתוך צלחות בקוטר 10 סנטימטרים מצופות פוליאוריטן.

טרבחו את התאים למשך לילה, והשלים את מצע התרבית של האסטרוציטים מדי יום בשני הימים הבאים, ולאחר מכן פעם בשלושה ימים. לאחר שבעה ימים, כאשר האסטרוציטים יוצרים שכבה אחת (monolayer) בנשיאות של 90%, קצור את התאים באמצעות trypsin. כחמישה ימים לאחר זריעת הנוירונים, שאב את ה-GDNF. לאחר מכן, זרע 150 µL של האסטרוציטים התלוים במתלה אל הצד השמאלי של ה-MCP המורכב. כאשר האקסונים עומדים להיכנס או שזה עתה נכנסו לאחר זריעת האסטרוציטים מחדש, אקסונים שנכנסו לצדו השמאלי של ה-MCP המורכב יקימו אינטראקציה ישירה עם האסטרוציטים, בין אם באמצעות מגע אקסוני ישיר ובין אם על ידי שחרור גורמים ממיסים.

עקבו אחר היצמדות האסטרוציטים לאזור שימור התאים. בצעו צביעה אימונוהיסטוכימית לתאים במערכת התרבית המשותפת המאורגנת בתאים כדי להדמיאן חלבונים ספציפיים, כגון אלו המעורבים באינטראקציה בין האקסונים לאסטרוציטים. מערכת התרבית המשותפת של נוירונים ואסטרוציטים בחלוקה לתאים מאפשרת רק לתהליכים הנוירונליים, ובמיוחד לאקסונים, לקיים אינטראקציה סלקטיבית עם אסטרוציטים.

כאן אנו מתארים הפעלה תעתוקית של נשא גלוטמט באסטרוגליה המושרית על ידי אקסונים. מחקרים אלו משתמשים בעכברים טרנסגניים, אשר מבטאים רפורטר פלואורסצנציה של EGF תחת בקרה של הפרומוטור הגנומי של GT1. צפיפות גבוהה של נוירונים גודלה באזור שימור התאים של ה-MCPA המורכב; תצוגה מוגדלת מראה את האקסונים חוצים את התעלות המרכזיות ונכנסים לצד השני, כאשר צביעת beta three tubulin חושפת את קונו הגדילה של האקסון.

מערכת ה-MCP מאפשרת ניטור של צרורי האקסונים בעודם גדלים דרך התעלה המרכזית ונכנסים לצד השני. צביעה אימונוהיסטוכימית ל-GT one מזהה אסטרוציטים בצד הגליאלי של מערכת ה-MCP שהופיעו. התמונה מציגה כאן מגע בין אקסונים לאסטרוציטים חיוביים ל-GLT one.

הביטוי של הדגין EGFP נמצא במתאם עם הפעלת הקידוד האנדוגנית של GT one, ביטוי חלבון ופעילות תפקודית. הערכה של פעילות הקידוד של GT one באסטרוציטים בודדים ב-C two מראה על עלייה משמעותית ב-immunoreactivity של GLT one במערכת של תרבית משותפת מופרדת לתאים (compartmentalized co-culture system). חשוב לציין כי מערכת ה-MCP מאפשרת צילום time-lapse למעקב אחר שינויים דינמיים.

לדוגמה, נתונים אלו מראים הפעלה של מקדם GT1 המושרית על ידי אקסונים עם אסטרוציטים מסוג GT1 EGFP ונוירונים מסוג wild type יום אחד לאחר זריעת האסטרוציטים. נצפית פלואורסצנציית EGFP מינימלית מאוד. עוצמת ה-EGFP עולה באופן משמעותי 48 שעות לאחר תרבית משותפת, כאשר האקסונים חודרים היטב לצד של האסטרוציטים ומקיימים אינטראקציה באמצעות מגע ישיר עם האסטרוציטים כאן.

טיפול בקינין בצד הנוירונלי של ה-MCP שהורכב הוביל למוות של תאי עצב. באופן מעניין, הוא גרם גם לנסיגה וניוון של אקסונים, וכן לירידה ב 하며-פלורסצנציה של EGFP אקסונלי. שינויים דינמיים אלו בעוצמת הפלורסצנציה של EGFP בתגובה לאקסונים הדגימו בבירור כי פעילות הפרומוטור של Astroglia GT one מושפעת מהאינטראקציה עם האקסון.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקים את מערכת תרביות הליבה באמצעות פלטפורמת התרביות המיקרופלואידית; ברגע שתשלטו בטכניקה זו, ניתן יהיה לבצעה כראוי תוך מספר ימים.