Microinjection האינסולין היפוקמפוס ו
11 בינואר 2013
אפנון של זכרון עבודה המרחבי hippocampally תלוי על ידי microinjection intrahippocampal הישיר, מלווה ואחרי In vivo Microdialysis למטבוליטים ב, בעלי חיים מודעים מתנהגים.
המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד את המטבוליזם ההיפוקמפלי במהלך בדיקה התנהגותית. דבר זה מושג על ידי הכנה כירורגית של בעל חיים שעבר הרגלה באמצעות קנולה מנחה למיקרודיאליזה. ביום הבדיקה, מוחדרת גשש מיקרודיאליזה אל תוך הקנולה ומאשרים את זרימת ה-PERFUSE eight.
בשלב הבא, מאפשרים לגסס להגיע לשיווי משקל בזמן שהחיה שוהה בתא בקרה. לבסוף, נעשה שימוש בשיטות אנליטיות מתאימות, למשל, תגובת glucose oxidase, NADP, N-A-D-P-H ואנליזה פלואורימטרית. אם מדידת גלוקוז משמשת להצגת רמת המטבוליזם ו/או השחרור הנוירוכימי לאורך תקופת הבדיקה, אחד ההיבטים המאתגרים ביותר בטכניקה זו הוא הזהירות הנדרשת בטיפול בצינוריות המיקרודיאליזה, שכן ללא זהירות, החיות עשויות ללעס אותן או לסבך את הצינורות.
הפעם הראשונה שבה השתמשתי במיקרודיאליזה היפוקמפלית במהלך בדיקות התנהגותיות הייתה במהלך עבודת הדוקטורט שלי, כאשר רצינו לבדוק האם המודלים הקיימים לאספקת גלוקוז תואמים למעשה לנתונים הפסיכולוגיים הידועים בנוגע לשיפור הזיכרון על ידי גלוקוז. מתודולוגיה זו אפשרה לנו להראות שבפועל, המודלים הקיימים של הזרקת גלוקוז למוח היו שגויים לחלוטין.
בהתאם לנהלי ניתוח סטנדרטיים, הכינו את בעל החיים, חשפו את הגולגולת וקדחו חורים להחדרת הקנולה. הכניסו קנולה בקואורדינטות שנקבעו מראש ולאחר מכן הורידו אותה באיטיות לעומק היעד. לאחר מיקום נכון, קבעו את הקנולה במקומה באמצעות צמנט דנטלי.
השתמשו בתפר כירורגי סטרילי לסגירת הפצע במידת הצורך. לבסוף, השתמשו בסטיליס (style) כדי לשמור על פתיחות הקנולה. לאחר מכן, הכינו את ה-PERFUSE eight לשימוש במיקרודיאליזה.
יש לציין כי הרכב נוזל מדויק הוא חיוני להשגת תוצאות אופטימליות. ביום הבדיקה יש להוסיף bovine serum albumin BSA ולהמיס אותו לחלוטין. לאחר ההכנה, יש לסנן את ה-PERFUSE eight באמצעות מסנן של 0.2 micron.
בשלב הבא, הכינו את הטיפול שיועבר למוח, אם קיים כזה, באמצעות אליקוט של A ECF שהוכן. במקרה זה, אינסולין מוכן להחדרה להיפוקמפוס. יש להכין גשושית (probe) וקו מיקרודיאליזה טריים יום לפני הבדיקה.
צרו שני קווים נפרדים עבור זרימה פנימה (inflow) וזרימה החוצה (outflow). השתמשו בצינוריות PE 50 כדי לחבר שתי פיסות של צינוריות FEP באורך מטר אחת, והבטיחו שיהיה מינימום של נפח מת של קו (dead space) בין הקווים. יש לקצץ את הצינוריות כפי שמוצג כדי ליצור קצוות אלכסוניים להקל על ההחדרה לתוך מחברי ה-PE 50.
חברו את צינור הכניסה למזרק Hamilton בנפח 1 ml המלא במים דה-יוניים מסוננים וסטריליים, וחברו את הפרובה לקצה השני כדי לאפשר לבעל החיים לנוע בחופשיות בזמן המדידות. חברו את קווי הכניסה והיציאה למסובב (swivel) בעל שני ערוצים. לאחר מכן, חברו את צינור היציאה למשאבה והפעילו אותה בקצב של 1.5 µL לדקה עד שתראו מים דה-יוניים יוצאים מצינור היציאה שבפרובה.
כבו את המשאבה וחברו את הקו השני בין צינור המוצא לצינור איסוף דגימות. העבירו 5 mL דרך הצינור והניחו את הפרוב בתוך מבחנה המכילה מים דה-יוניים סטריליים למשך הלילה, תוך הבטחה שקצה הפרוב יישאר רטוב תמיד. 24 שעות לפני הבדיקה, בצעו הכנה מוקדמת של נבדק הניסוי על ידי הסרת הסטילט המדומה והחדרת פרוב למיקרודיאליזה המשמש למטרה זו בלבד.
במשך 10 דקות לאחר מכן, החליפו את גוף הדמה והחזירו את החולדה לכלוב שלה. לחלופין, ניתן להשתמש בגשש חדש בשלב זה ולהשאירו במקומו ללא הסרה עד למדידות. למחרת.
ביום ביצוע המיקרודיאליזה, מלאו את מזרק ההמילטון ואת בקבקי הסינצילציה ב-A ECF מסונן והמתינו שעה אחת להתייצבות המשאבה. במידת הצורך, מלאו מזרק המילטון שני בחומר הטיפול שהוכן והניחו אותו במשאבת המזרקים. המפתח להצלחה בפרוצדורה זו הוא לשמור על רוגע ולטפל בבעל החיים באופן נרחב ומקיף.
לכן הישארו רגועים, פעלו באיטיות ובדיוק ומעל לכל התאמנו. כאשר השיווי המשקלי הושלם, הוציאו את המנדרין הפיקטיבי (dummy stylet) והחדירו בעדינות את פרוב המיקרודיאליזה שעבר שיווי משקלי אל תוך מוח החולדה דרך הקנולה. הניחו את החולדה בקופסת פלסטיק שקופה המכילה חלק מהמצע הביתי של החולדה.
יש לוודא שקיימת איזון למסרת הצינוריות. חברו מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.6 milliliter מלאה במים לצינוריות מחוץ לכלוב, באופן שבו כוח הכבידה ישמור על קווי המיקרודיאליזה ללא קפלים אך לא מתוחים. המתינו שעתיים להתרגלות (equilibrate) של הגשושית והחולדה.
בתחילת תקופה זו, ודאו שזרימת ה-Perfuse eight אינה חסומה. כדי לעשות זאת, אספו את תפוקת ה-PERFUSE eight לאורך פרק זמן מוגדר ושקלו את הדגימה כדי לוודא שהנפח הצפוי יוצא מהמערכת לפני איסוף הדגימות. ודאו שהמתאם בין דיאלזה של הדגימה לאיסוף שלה חושב במדויק.
כאן יש לנו נפח של 30 µL בין הגשושית לנקודת האיסוף בקצב של 1.5 µL לדקה. קיים פיגור של 20 דקות מהרגע שבו הדגימה יוצאת מהמוח ועד שהיא נאספת. לאחר תקופת ההתייצבות, אספו לפחות שלוש דגימות בזמן שהחולדה נמצאת במצב מנוחה בתא הבית.
כדי לבסס קו בסיס יציב של מדידות לפני הבדיקה ההתנהגותית, תכננו בקפידה את תזמון הגשת הטיפול למוח. במערך זה, שבו קיים נפח של 30 µL בין קצה המזרק לבין הפרובה הנכנסת למוח החיה, נחליף את מזרק הטיפול לתמיסת הטיפול Profuse 8 כ-20 דקות לפני כן. אנו רוצים שהטיפול יגיע להיפוקמפוס עד להחלפת המזרקים.
נתקו פשוט את קו הכניסה ממזרק ה-perfuse eight של הבקרת וחברו אותו במהירות למזרק ה-perfuse eight של הטיפול. פעולה זו לא אמורה להיארך יותר מחמישה שניות כדי למנוע הפרעה לזרימה של ה-PERFUSE eight. הקפידו לא להחדיר בועות אוויר שעלולות לפגוע ביעילות בפרק הזמן המתאים.
לאחר מתן הטיפול, העבירו בעדינות את החולדה למכשיר הבדיקה ההתנהגותית הנבחר. במקרה זה, תחלופיות ספונטנית נמדדת במבוך בצורת סימן פלוס בגודל של אמה. אפשרו לבעל החיים לחקור את המבוך באופן חופשי למשך 20 דקות.
תעד את הרצף ואת התזמון של זרוע Aries באמצעות הקלטה בווידאו או באופן ידני לצורך איסוף דגימות. במהלך תקופה זו, העבר את צינור הניקוז למבחנת איסוף חדשה. מדי חמש דקות החזק את הצינור כך שייענך באופן חופשי.
הדבר לא צריך להפריע לתנועת החולדה או לזוז לפני בעל החיים ולהסיח את דעתו; הישארו ללא תנועה כדי שתנועותיכם לא ישפיעו על התנהגות החולדה. לאחר הבדיקה, הוציאו בעדינות את החולדה מהמבוך והחזירו אותה לתא הבקרה. המשיכו באיסוף דגימות מיקרודיאליזה למשך ארבע דגימות לפחות, כדי לכסות את תקופת ההתאוששות מביצוע המשימה.
לאחר איסוף הדגימות הרצויות, הוצא בעדינות את הפרובה מראש החיה והנח אותה במבחנה לאחסון. החזר את החיה לכלוב המגורים שלה ועקוב מקרוב אחר כל שינוי בבריאות או בהתנהגות לאחר הניסוי. לבסוף, שטוף את הצינור על ידי מעבר למזרק המכיל תמיסת catho כדי למנוע צמיחת מיקרובים.
דוגמה זו מראה ירידה ברמת הגלוקוז בנוזל החוץ-תאי (ECF) בהיפוקמפוס הקשורה למשימה. התיבה האפורה מייצגת את הזמן שבו שהה בעל החיים במבוך. הקו הסגול מראה את רמת הגלוקוז בהיפוקמפוס בבעלי חיים שלא עברו בדיקת מבוך, בעוד שהקו האדום מייצג בעלי חיים שביצעו את משיבת החילופים הספונטניים של הזרוע.
הקו הכתום מציג מדידות בבעלי חיים שביצעו את גרסת שלוש הזרועות הקלה יותר של משימה זו. כאן נראים השינויים בהיפוקמפוס, בגלוקוז ובלקטט לאחר מתן אינסולין. שימו לב כי שינויים אלו נצפים ללא כל בדיקה התנהגותית, ולפיכך הם משקפים את השפעתו של האינסולין לבדו בתנאי בסיס.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב מאוד להישאר רגועים. חולדות יכולות לחוש את הלחץ במהלך הניסוי והן ייהפכו חסרות מנוחה, דבר שעלול להקשות משמעותית על התהליך ואף להוביל לתוצאות מוטעות. שילוב של טכניקות אלו איפשר ביצוע מחקר נוירוכימי מדויק של תהליכים התנהגותיים.
טכניקות דומות נמצאות כעת בשימוש גם בחולים בבני אדם. לדוגמה, למטופלים עם אפילפסיה שהושתלו להם אלקטרודות לצורך מיקום מוקד ההתקף, עשויות להיות מושתלות גם קנולות למיקרודיאליזה כדי לאפשר מדידות מטבוליות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הוויסות של זיכרון עבודה מרחבי התלוי בהיפוקמפוס באמצעות מיקרו-הזרקה תוך-היפוקמפלית ישירה, בשילוב עם מיקרודיאליזה in vivo לניתוח מטאבוליטים בבעלי חיים בהשכמה ובזמן התנהגות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- בדיקות התנהגותיות
- ניתוח מטבולי
רקע
- להיפוקמפוס תפקיד מכריע בזיכרון העבודה המרחבי.
- מיקרודיאליזה מאפשרת מדידה של מטבוליטים בזמן אמת.
- הבנת המטבוליזם ההיפוקמפלי יכולה לספק תובנות לגבי תפקודים קוגניטיביים.
- בדיקות התנהגותיות הן חיוניות כדי להקרין שינויים מטבוליים עם ביצועי זיכרון.
מטרת המחקר
- למדידת המטבוליזם בהיפוקמפוס במהלך משימות התנהגותיות.
- להערכת ההשפעות של מיקרו-הזרקה ישירה על זיכרון עבודה מרחבי.
- לשימוש במיקרודיאליזה in vivo לצורך ניתוח בזמן אמת של שינויים נוירוכימיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה כירורגית של בעלי חיים עם קנולה מנחה למיקרודיאליזה.
- החדרה של פרוב מיקרודיאליזה לאיסוף מטבוליטים.
- השגת שיווי משקל של הפרוב בתא בקרה.
- שיטות אנליטיות הכוללות גלוקוז אוקסידאז ואנליזה פלואורימטרית.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של המטבוליזם בהיפוקמפוס במהלך משימות.
- מתאם בין שינויים מטבוליים לבין ביצועים בזיכרון עבודה מרחבי.
- סימון אתגרים בטיפול בציוד למיקרודיאליזה.
- תובנות לגבי שחרור נוירוכימי במהלך בדיקות התנהגותיות.
מסקנות
- המחקר מדגיש את חשיבותו של חילוף החומרים בהיפוקמפוס במשימות זיכרון.
- מיקרו-הזרקה ישירה יכולה לווסת זיכרון עבודה מרחבי.
- מיקרודיאליזה in vivo היא כלי בעל ערך לחקר תהליכים מטבוליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הזרקה מיקרוסקופית ישירה של אינסולין להיפוקמפוס, בשילוב עם מיקרודיאליזה in vivo, מאפשרת מדידה בזמן אמת של שינויים נוירוכימיים ומטבוליים במהלך משימות של זיכרון מרחבי במודלים של בעלי חיים ערים ומתנהגים. גישה זו מספקת תובנות יישמיות לגבי מטבוליזם ספציפי לאזורי מוח ו modulate פרמקולוגי, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובביטחון תחזוי בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). השיטה נותנת מענה לנקודת מפנה קריטית עבור תיקוף מטרות והמשכיות תרגומית בפורטפוליו של נוירופרמקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מסלולים מטבוליים העומדים בבסיס התפקוד הקוגניטיבי במערכות הרלוונטיות למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור התערבות פרמקולוגית לתוצרי פלט נוירוכימיים והתנהגותיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד תגובות של ההיפוקמפוס לטיפולים אקוטיים.
- מספק ביטחון חיזוי לקידום מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) בהתבסס על מדדים מטבוליים כמותיים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מקיים מודלים מאושרים in vivo לסריקת השפעות מטבוליות ונוירוכימיות של תרכובות מועמדות.
- מספק מדידות כמותיות הניתנות לשחזור של גלוקוז ולאקטט חוץ-תאיים במהלך משימות התנהגותיות.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי בקרה של השפעות לא ספציפיות, כגון סטרס או פעילות מוטורית.
- מכין פלטפורמות חסונות להערכה המשכית של תרכובות בנתיבי פיתוח הממוקדים במערכת העצבים המרכזית (CNS).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם סמנים ביולוגיים (biomarkers) מטבוליים פרה-קליניים עם נקודות קצה התנהגותיות הרלוואנטיות להפרעות קוגניטיביות.
- מבטיח רצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות שילוב של נתונים נוירוכימיים והתנהגותיים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת ראיות ישירות להשפעות פרמקודינמיות in vivo.
- מסייע בפיתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים עבור תוכניות פיתוח תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני בכך שהיא מאפשרת בדיקה מונחית-היפותזה של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS), סוכנים פרמקולוגיים ומסלולים מטבוליים במודלים של בעלי חיים ערים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים עבור מטרות הקשורות לזיכרון.
- סריקה: מספקת פלטים מטבוליים ונוירוכימיים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות בזמן אמת של גלוקוז ולאקטט להשוואת תנאי טיפול.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי התאמת שינויים מטבוליים לתוצאות התנהגותיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה לשימוש חוזר עבור מחקרים מגוונים בפרמקולוגיה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) ובמטבוליזם.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות מטבוליות והתנהגותיות in vivo לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי אספקת נתונים כמותיים אמינים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים וקידום של מועמדים לתרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים סטריאוטקסיים, מיקרודיאליזה ומדעי המוח ההתנהגותיים.
- מחייב מכשור ייעודי למיקרודיאליזה, איסוף דגימות וכמותניקה אנליטית.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדנית של פרוטוקולים וניתוח נתונים בין צוותים שונים.
- התאמה למינים או לאזורי מוח שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- טיפול זהיר בציוד המיקרודיאליזה חיוני למניעת ארטיפקטים טכניים ולהבטחת שלמות הנתונים.
