Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

השיטה המוצגת בסרטון זה משתמשת במפות גורל של עובר אופוס בשלב המחשוף כדי לזהות תרבית של בלייזר בודד בבידוד כדי להעריך אם סולפט עוברי נקבע על ידי הוראות פנימיות או חיצוניות, נאספים שני עוברי תאים ראשונים שבהם תלם המחשוף הראשון חוצה את האזור הפיגמנטי הקל של חצי הכדור החי. עוברים אלה מתורבתים כאשר העוברים מגיעים ל-16 עד 32 תאים, לאחר מכן מסירים את קרום הוויטל ותאים שכנים מנותחים הרחק מהתא הנבחר. לצורך ההסבר, הפיצוץ המנותח מועבר לאחר מכן לשקע בתרבית מצופה מקדחה, היטב ומתורבת.

ברגע שהאקספלן מגיע לשלב הרצוי, הוא נקצר כדי להעריך את ביטוי הגנים או החלבונים באמצעות הכלאה באתר, QPCR או אימונוהיסטוכימיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני אחרות כגון תרבית, קבוצות גדולות של תאים עובריים או איברים בכניסה, הוא שניתן לגדל חילול קודש עוברי יחיד שגורלו ההתפתחותי ידוע ממחקרי מעקב אחר שושלת ללא תוספת גורמי גדילה או נוכחות של תאים שכנים. לפיכך, ניתן לבחון ישירות האם גורמים מהותיים לתא מורים לחילול הקודש להפוך למבשר של רקמה מסוימת או שמא הוא דורש אותות מהתאים הסובבים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שניתוח בלייר והעברתם לבארות תרבית דורש מניפולציות עדינות תחת מיקרוסקופ סטריאו. בסרטון זה, אשתמש בשיטה זו כדי להדגים אם mRNAs שמקורם באימהות מטים תאים לעבר גורל עצבי בעבודה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השחיז ארבעה סטים של מלקחיים באמצעות סרט שוחק של Illumina.

זוג אחד של מלקחיים משמש כגיבוי למקרה שקצה ניזוק במהלך ההליך, חיטוי כל ארבעת המלקחיים ואחסון במיכל סטרילי, הכנת 500 מיליליטר כל אחד של 0.1 x ו-1.0 x של תמיסת מלח בארת' שונה או MBS ומסנן אותם לעקר אותם. אחסן את התמיסות הללו בטמפרטורה של 14 עד 18 מעלות צלזיוס למשך חודשים בבקבוק פקק בורג מזכוכית, הכן ארוס בדרגת אלקטרופורזה של 2% ב-100 מיליליטר של תרבית X אחת. חיטוי בינוני להמסת הארוס במיקרוגל, להנזלת הארוס כשהוא נחוץ בפעם הבאה בזמן שהארוס נוזלי.

שופכים כ- 0.5 מיליליטר על תחתית כל באר של צלחת תרבות סטרילית של 24 בארות. זה ימנע מהשתלים להיצמד לפלסטיק. לאחר מכן יוצקים כשניים עד שלושה מיליליטר על תחתית של שניים עד 360 מילימטר צלחות פטרי ומערבבים בעדינות לפיזור.

אלה ישמשו ככלי חיתוך והארוס מונע מעוברים להידבק לפלסטיק. לאחר הסרת הממברנות שלהם, כאשר הארוס התקרר והתקשה, קצה פיפטת מרעה בגודל שישה אינץ' עד שהוא נמס לכדור. מסגר מחדש את הכדור בקצרה, ואז גע בו קלות על פני הארוס בבאר של צלחת התרבות.

זה ייצור שקע רדוד שלתוכו יוצב ה-Xplan. חזור על כל באר בצלחת. לאחר מכן, מלאו כל באר של צלחת התרבות במיליליטר אחד של מדיום תרבית סטרילי אחד.

לאחר מכן מלאו את צלחת החיתוך ב-0.1 XMBS כדי להקל על הפרדת הפיצוץ. לאחר הכנת כלי הניתוח, העבירו ביצים מופרות עם שכבות הג'לי שהוסרו לצלחות פטרי בגודל 100 מילימטר המכילות 0.5 x מדיום תרבית. אלה שאינם בשימוש מיידי ניתנים לתרבית ב-14 מעלות צלזיוס בעוד שהמנה הראשונה נסקרת עבור שני עוברי תאים.

סקרו את העוברים בצלחת הפטרי הראשונה באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה באמצעות פיפטה להעברה מפלסטיק העבירו כ-101 תאים ושני עוברי תאים לצלחת נפרדת מלאה בתרבית פי 0.5. בינוני. מניחים את צלחת הפטרי באינקובטור של 14 מעלות צלזיוס. היכולת של בדיקה זו להעריך במדויק את הפוטנציאל ההתפתחותי של תא מסתמכת על ניתוח חילול הקודש הנכון על סמך מפות גורל.

לכן, חיוני לבחור עוברים עם דפוס פיגמנטציה נכון בשלב שני התאים התואמים כתוצאה מכך לדפוסי מחשוף רגילים. כפי שמודגם כאן. מחשופים רגילים מתרחשים לרוב רק בצד אחד של העובר.

עוברים אלה עדיין יכולים לשמש כתורמים אם התא התורם מקורו בצד הרגיל. כאשר העוברים מגיעים לשלב שני התאים, מיין את אלה שבהם תלם המחשוף הראשון חוצה את האזור בעל הפיגמנט הקל בחצי הכדור של בעלי החיים לצלחת נפרדת, מיין בערך פי חמישה יותר עוברים ממה שינותח. אלה יהיו התורמים לתערוכה.

שמור את שני עוברי התאים הנותרים בצלחת נפרדת ליד העוברים התורמים לאורך כל ההליך כדי לשמש כבקרות אחים לבימת האקספלור. לאחר מיון וניתוח העוברים, חזרו לכלים באינקובטור כדי למצוא עוד עוברים של תא אחד ושני תאים. מכיוון שלוקח לעובר תא אחד כ-90 דקות להתחלק, ניתן לעשות זאת עד שעתיים לאחר איסוף הביציות.

להכנת האקספלן, הניחו חמישה עד 10 עוברים בכלי דיסקציה. לאחר מכן מקם את העובר הראשון כך שניתן יהיה לתפוס את קרום הוויטל השקוף בעזרת מלקחיים. בדרך כלל לא ניתן לראותו, אך ניתן לתפוס אותו בקוטב החיה, שם הוא מופרד על ידי חלל פרל ברור מעל פני העובר.

בעזרת מלקחיים מושחזים ביד אחת, אחוז במרחק מהפיצוץ שיש לנתח כדי להימנע מפגיעה בו. ואז בעזרת מלקחיים מושחזים, לעומת זאת, אחוז את הממברנה קרוב לקצה המלקחיים האחרים ומשוך בעדינות לכיוונים מנוגדים כדי לקלף את הממברנה. העובר ישתטח לאחר הסרת הממברנה.

לאחר מכן, תפוס תא שכן עם המלקחיים והשתמש בתא זה כידית כך שהתא המיועד לניתוח לא ייגע ישירות במלקחיים ביד השנייה, משך בעדינות את התאים השכנים הנותרים הרחק מחילול הקודש הרצוי. אם תאי קו האמצע החולקים את אותו גורל ממוקדים, ניתן להסיר אותם יחד כזוג. לבסוף, נתח את תא נקודת האחיזה.

הרם את חילול הקודש או את זוג האמרי עם פיפטה מזכוכית סטרילית, הימנע מבועות אוויר ויניקה מוגזמת. הניחו את קצה פיפטת המרעה מתחת לפני השטח של מדיום התרבות בבאר של צלחת התרבות X explan, והוציאו בעדינות את הפיצוץ. זה אמור להחליק לשקע הרדוד על ידי כוח הכבידה.

ניתן לשלב חילול הקודש של יותר מעובר אחד להסבר יחיד על ידי הפקדתם באותו שקע בתרבית. ובכן, חזור על הליך זה עם העוברים הנותרים בצלחת הדיסקציה בזה אחר זה. לאחר כ -10 עוברים, צלחת הדיסקציה תתמלא בפסולת תאית.

כאשר זה קורה, שנה לצלחת החיתוך הבאה. לאחר ביצוע כל הנתיחות, בדוק אם האקספלן נמצא בשקעים הרדודים. אם לא, ניתן לדחוף אותם בעדינות לתוך השקע עם לולאת שיער שעוברה עיקור ב-70% אתנול ושתלי דגירה מיובשים באוויר בטמפרטורת החדר על הספסל כשעה לאחר הדיסקציה האחרונה.

הסר פסולת סביב החלל הנרפא עם תרבית פיפטות מרעה מזכוכית סטרילית. צלחת האקספלן ב-14 עד 20 מעלות צלזיוס ליד צלחת הפטרי המכילה את עוברי הביקורת של האחים. עוברי אחים יצביעו על שלב ההתפתחות של הסבר חילול הקודש.

לאחר כשעה עד שעתיים בתרבית, הבלסטומרים המושתלים יתפצלו כארבע פעמים ויסלקו את רוב הפסולת שנותרה מהתאים השכנים הפגועים. לאחר 20 שעות הם יוצרים כדורי תאים קטנים ויציבים. כאשר האחים מגיעים לשלב ההתפתחותי הרצוי, קצרו את ההסבר.

האקספלן הזה שורד די טוב, גם אם חלק מהתאים מתפרקים. לכן, אם יש מסה עכורה בתרבות, חקור אותה היטב עם לולאת שיער או מלקחיים כדי לקבוע אם קבור בפנים אקספלן בריא. הרם את האקספלן בנפח קטן של תמיסת תרבית עם מעבר לפיפטה שלך והוציא אותם בעדינות לתוך מאגר קיבוע או ליזה המתאים לביצוע הבדיקה.

שני חילול הקודש הגבי או שני חילול הקודש הגחוני נותחו בשלב 16 התאים ותרבו ב-XMBS אחד ב-14 מעלות צלזיוס עד שהעוברים האחים הגיעו לשלבי הלוח העצבי המוקדמים. כל דגימה נבדקה לביטוי של צלחת עצבית זיגוטית. Gene Sox שניים על ידי הכלאה באתר, שנתפסת כתוצר התגובה הכחולה.

תוצאות בדיקה זו מראות שרוב חילולי הקודש של בעלי החיים בגב, שהם קודמים של הלוח העצבי, יכולים לבטא SOX שני באופן אוטונומי. זאת ללא איתות נוסף מאזורים אחרים של העובר. ייתכן שהסברים שאינם מבטאים SOX 2 זוהו באופן שגוי בזמן הנתיחה.

לעומת זאת, אף אחד מחילולי הקודש של בעלי החיים הגחוניים, שהם מבשרי האפידרמיס הגחוני, מבטא SOX 2. נתונים אלה מצביעים על כך שלמחללי הקודש של חיות הגב יש יכולת מהותית ליצור רקמה עצבית, בעוד שמחללי הקודש של חיות הגחון אינם מציינים זאת. חלק מהאקספלן הגבי הוארך גם מורפולוגיה המעידה על היווצרות מזודרם גבי.

בלסטומרים אלה גם דהויים ליצירת הנור בעובר השלם ותרבית אקספלן מבטאת חלבון סמן נור כדי לבדוק את ההשפעה של שינוי הרמות האנדוגניות של גן עצבי אימהי מבוטא. חמישה mRNA של Fox D הוזרקו לשמונת מבשרי הגחון של התאים. כפי שמוצג כאן, רוב השתלים הגחוניים ביטאו SOX שתיים.

לעומת זאת, כאשר הרמה האנדוגנית של Fox D five הופחתה על ידי הזרקת אוליגונוקלאוטידים של מורף אנטיסנס לתוך שמונת התאים המבשרים של הגב, רק כמה אקספלן גבי ביטאו SOX שתיים. ניסויים אלה מצביעים על כך שהביטוי האימהי של Fox D five ממלא תפקיד ביכולת הפנימית של חילול הקודש הגבי לרכוש גורל עצבי לפני הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון הזרקה לבלייר לניתוח mRNA לשיפור תפקוד או אוליגונוקלאוטידים מורפו אנטיסנס לאובדן תפקוד כדי לענות על שאלות נוספות.

לדוגמה, אילו גנים מעורבים ביכולת הפנימית של תאים להוליד גורל התפתחותי מסוים? בנוסף, ניתן לבדוק גורמי איתות ידועים על ידי הוספת גורמים מטוהרים למדיום התרבית. ניתן להשתמש בגישה זו גם כדי להשתיל מגדפים בודדים למקומות חדשים בעובר השלם.

בדיקה זו האם התא המושתל מחויב לגורלו ההתפתחותי המקורי, מידע זה הוא קריטי להגדרת המנגנונים התאיים שבאמצעותם תא עוברי פלוריפוטנטי הופך להיות מבשר של רקמה מוגדרת.