Name: השרשה של סיבים אופטיות לגירוי Optogenetic כרוני של רקמת המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: למדו שיטה להשרשת סיבים אופטיים לגירוי אופטוגנטי כרוני של נוירונים במוח עכברים בהקיץ. טכניקה זו ממזערת נזק לרקמה ומאפשרת מחקר מעגלים עצביים לטווח ארוך.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להכיר בכך שהטכניקה זו תוארה לראשונה על ידי ספרטה et al., 2012 והותאמה בקלות לשימוש במעבדה שלנו.

* כל החומרים יחד עם יצרנים ו / או ספקים המפורטים להלן הפרוטוקול. 1. הרכבה של שתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת של אפוקסי סיבים האופטיים חום ניתן לריפוי על ידי הוספת 100 מ&quot;ג של מקשה ל1 גרם של שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד וחתכת כ 35 מ&quot;מ של סיבים אופטיים 125 מיקרומטר עם ליבת 100 מיקרומטר ידי ניקוד אותו עם סופר קרביד טריז קצה. מקם את ניצבת הסופר לסיבים האופטיים והניקוד בתנועה אחת, חד כיווני. חיתוך הסיבים לחלוטין יפגע בליבת הסיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס LC קרמיקת כפת מתכת עם 127 מיקרומטר קדח בסגן, צד קמור מופנה כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הסיב האופטי לתוך טבעת חזוק. הסיב האופטי צריך להחליק בצורה חלקה ושולי יבלוט מעבר לסוף הקמור של כובעון המתכת (האיור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל טיפה אחת של אפוקסי סיבים האופטיים חום לריפוי לסוף והחום השטוח עם אקדח חום עד אפוקסי הופך לשחור. אפוקסי צריךלמלא את טבעת חזוק כפי שהוא מתחמם ולפני ריפוי. אפוקסי צריך לרפא בתוך ~ 1 דקות של יישום חום קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את איפוקסי צדי טבעת חזוק, כפי שיקשה התממשקות עם המצמד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולני הסוף הקמור של טבעת חזוק באמצעות דיסק LC סיב אופטי ליטוש (FOPD) על יריעות אלומיניום תחמוצת ליטוש על משטח הליטוש (האיור 1b). הפוך דפוסי סיבוב מעגליים ולהבריק בארבע כיתות על פי הסדר הבא: 5, 3, חצץ 1 0.3 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הסיבים האופטיים בסוף השטוח לאורך כזה שהיא יהיה ממוקדת באזור של ריבית המתאים. האורך ניתן לקבוע באמצעות אטלס stereotaxic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השתל על ידי חיבורו לליזר דרך כבל המצמד המתואר להלן. הסוף המלוטש של השתל מוכנס לתוך השרוול של המצמד וצריך ליצור קשר ישיר עם טבעת חזוק יריב. השתל צריך להיות מסוגל לשמור על 10 mW של תפוקת אור, נמדד בקצה של הדואר סיבי שתל. שתל רע יהיה מוקד חלש ליד קצה הסיב האופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את השתלים המוגמרים (האיור 1 ג) בקצף עד לשימוש. </li></ol> 2. הרכבה של כבל מצמד סיבים אופטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת של אפוקסי סיבים האופטיים חום לריפוי כאמור לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד ולחתוך אורך מתאים של סיבים אופטיים 220 מיקרומטר עם ליבת 200 מיקרומטר ידי ניקוד אותו עם סופר קרביד טריז קצה. אורכו של הסיב צריך לאפשר את העכבר כדי לנוע בחופשיות סביב הדיור, אך לא לאפשר את העכבר כדי ללעוס דרך הסיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הסיבים האופטיים לאורכו של צינור מזלוג מעט ארוך יותר מאורך הסיבים האופטי. הצינורות צריכים קוטר פנימי מעט גדול יותר מהסיבים האופטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצועה ~ 25mm בקצה אחד של הסיב האופטי והכניסו אותו לסוף המתכת של MM FC Multimode כפת מתכת אסיפה עם 230 מיקרומטר נשא עד שייעצר. הסיב האופטי צריך לבלוט באמצעות ferruסוף le (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאבטח את החיבור עם cyanoacrylate (דבק סופר) בסוף המתכת. כיסוי החיבור עם אתחול מחבר וללטש סוף טבעת חזוק עם FC FOPD. הפוך דפוסי סיבוב מעגליים ופולנים בארבע כיתות, לפי הסדר הבא: 5, 3, 1, 0.3 מיקרומטר חצץ (האיור 2b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתפשט ולהכניס את הקצה השני של הסיב האופטי לתוך LC קרמיקת כובעון מתכת (230 מיקרומטר id המשעמם) עם סוף דיסטלי הקמור. תחול ירידה של אפוקסי עד הסוף והחום השטוח עד שנרפא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולני הסוף הקמור של טבעת חזוק באמצעות FC FOPD על גיליונות ליטוש תחמוצת אלומיניום כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסט שרוול טבעת חזוק LC על הקצה הקמור של טבעת חזוק עד נקודת האמצע של השרוול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום חום לכווץ צינורות מעל צינורות מזלוג והשרוול וחום לאבטח ולהגן על החיבור (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המצמד על ידי חיבורו למקור הליזר ומדידת outp האורut דרך המצמד עם ספקטרופוטומטר. אובדן האור בין פלט הליזר ופלט המצמד נמדד לא יעלה על 30%. </li></ol> 3. השרשת כירורגים * מדובר בהליך טיפים בלבד. מכשירים הם סטרילי אבל כפפות לא צריכות להיות בגלל מניפולציה מתמדת בין המכשירים והציוד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם עכבר עם תערובת intraperitoneal הזרקת קטמין / Xylazine 100 ו 10 מ&quot;ג / קילו בהתאמה באמצעות מחט 30-מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גילוח הקרקפת עם קוצץ. נגב את הקרקפת עם אלכוהול רפואי 70% ואחריו Betasept לנגב (4% פתרון chlorhexidine) עבור 2 דקות, חוזר פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר באסדת sterotaxic ולאבטח את הראש, להבטיח כי הגולגולת היא רמה. החל משחת עיניים לעיניים, כדי למנוע יובש וכאב שלאחר ניתוח. לשמור על הרדמה באמצעות% volatized isoflurane (1-3 המדולל בחמצן בהתאם למצב הפיזיולוגי של mouse, שצריך להיות במעקב רציף על ידי תגובה לקמצוץ זנב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בקו האמצע של הקרקפת, וחושף את הגולגולת ממסלולי העיניים למבדה. לדחוף הצידה רקמות חיבור במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במהדק Serafin להחזיק לאחור את העור ולשמור על גישה לגולגולת (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחרוט תבנית משובצת לאורך פני השטח של הגולגולת עם מכוש שיניים. שטוף את הלכלוך משם עם מי מלח סטרילית. להתייבש היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מי חמצן (3%) לגולגולת החשופה עם קיסם אוזניים ל~ 2-3 שניות כדי ליצור micropores. לשטוף מספר פעמים ויבשות ביסודיות. לחלופין, ניתן עוגנים מוברגים לגולגולת, כמתואר בספרטה et al. (2012). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, לחרוט תבנית משובצת לאורך הגולגולת עם מכוש שיניים ולשטוף את הלכלוך עם מי מלח. להתייבש היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי סיבובי, להפוך את הקוץ קטן חור craniotomy (&lt;1 מ&quot;מ קוטר) עם מקדח סטרילי(Autoclaved) מעל האזור של עניין, נקבע על ידי אטלס stereotaxic המכויל לגבחת ומבדה. היזהר שלא לשבור את הדורה או לפגוע בכל רקמה. לשטוף לכלוך ויבש ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את טבעת חזוק הסיבים האופטית (שתל) לתוך מחזיק החללית ולהתחבר לזרוע stereotaxic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את השתל במקום ישירות מעל האזור של עניין באמצעות זרוע stereotaxic (איור 3 ב). אם החדרת הסיב האופטי ברקמת המוח, סיבים יש לקדם לאט בקצב של ~ 2 מ&quot;מ / דקה. טבעת חזוק צריכה לנוח על הגולגולת שנותרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת של מלט שיניים. התערובת צריכה להיות מספיק צמיגות נמוכה בקלות להחיל על פני הגולגולת. התערובת תהיה שמישה עבור 2-4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קיסם סטרילי, תחול, גם שכבה דקה של מלט שיניים על פני גולגולת ועל החלק התחתון של השתל. שכבת הבסיס של מלט שיניים צריכה לכסות את פני שטח כל כך הרבה על הגולגולת כאפשרי. אל תתנה מלט השיניים באים במגע עם העור של העכבר. זה יוביל לקושי מוגבר בתפירה, כמו גם גירוי לעכבר. אם מלט השיניים אינו בא במגע עם העור, לאפשר לו להתייבש חלקית באופן שכל השכבה של מלט ניתן התקלפה לפני ההגדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לו להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחול אפילו שכבות של בטון שיניים ליצירת גבעה קטנה מעל הגולגולת וסביב השתל, המאפשר לכל שכבה להתייבש לחלוטין (איור 3 ג). השאר ~ 3-5 מ&quot;מ מהקצה הקמור של טבעת חזוק נקיה של מלט, כדי לאפשר חיבור חלק, ללא הפרעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור את הקרקפת על תלולית בטון שיניים וסביב השתל באמצעות תפרים סטריליים, שימוש יחיד משי קלועים (6-0) עם C22 מחט. הסר לאחר 7 ימים. אופציונלי: בונד וטרינר שימוש למחייבים נוסף לאחר תפירה. הקפד להשתמש בונד וטרינר מינימאלי. עודף יכול לגרום לניזק בעור חמור עקב גירוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immediately לאחר ניתוח, עכבר צריך להיות מוזרק מתחת לעור עם Ketprophen (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) כדי להקטין כאב שלאחר ניתוח. זה צריך להיות חזר 24 שעות מאוחר יותר. החל משככי כאבים אקטואליים (Bupivicaine) ואנטיביוטיקה (כוהל) לעור ונתפר מסביב לבסיס של השתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר בכלוב מעל שמיכת חימום להתאוששות מן ההרדמה. הנח את העכבר בכלוב התאוששות סטרילי, לאחר ניתוח. כלובי ההתאוששות לא צריכים להכיל כל מצעים כדי לשמור על טמפרטורה ולמנוע חנק. העכבר ניתן להחזירו לכלוב המקורי או כלוב פעם ערה חדש. </li></ol> הרכבה נכונה של שתל הסיבים האופטיים ותוצאות מצמד באובדן פוטון מינימאלי בין מקור האור וסופו של הסיב האופטי באזור של עניין. סיבים אופטיים מלוטש היטב צריך להעביר אור במדים, קונצנטרי העיגול (איור 2 ד). עם השתלה ותפירה זהירות, לא גורם לגירוי השתל גלוי להעכבר ויכול להישאר במקום למחקרים ארוכי טווח (איור 3D,&gt; 1 חודש, תצפיות שלא פורסמו) ללא כל שפלה משמעותית של הסיבים האופטיים או כמות האור המועבר. השתלה או תפירה לא נכונה יכולה לגרום לגירוי ויכולה לגרום לעכבר מגרד את הקרקפת שלה, וחושפת את שיני מלט, או שבירה של טבעת חזוק מבטון השיניים בגלל מניפולציה מתמשכת. תרשים סכמטי של המערכת המורכבת שניתן לראות באיור 4. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> איור 1. עצרת של סיבים אופטיים להשתלה. () הסיב האופטי מוכנס לתוך טבעת חזוק, שולי בולטת מעבר לקצה הקמור שצוין על ידי ראש החץ. (ב) הסוף הקמור של כובעון המתכת מלוטש באמצעות FOPD בכיתות בהדרגה מעודנות יותר של גיליונות ליטוש. (ג) opt הסיבים המושתל המוגמרIC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> איור 2. עצרת של מצמד סיבים אופטיים המשמש לקשור את המפרק הסיבובי הסיבים האופטי לשתל. (א) דבק סיבים אופטי דרך הרכבת טבעת חזוק. (ב) צד טבעת חזוק של ההרכבה מוכנס לתוך הכיתות בהדרגה העדינה FOPD ומלוטשות באמצעות נייר ליטוש. (ג) שרוול טבעת חזוק מצויד מעל טבעת חזוק ומאובטח עם צינורות חום פסיכולוג. (ד) מצמד הסיבים האופטיים סיים צריך לייצר אור קונצנטרי עם אובדן פוטון מינימאלי. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> איור 3. השתלת כירורגים בסיבים האופטיים. (א) את כל פני השטח של craniuמ &#39;חשוף ורקמות חיבור אינה מסומנות. (ב) שתל הסיבים האופטי מוחזק בעמדה עם זרוע stereotaxic. (ג) מלט שיניים מיושם תיקון שתל הסיבים האופטי לגולגולת. (ד)&gt; 1 חודש לאחר השתלה, העור נרפא סביב השתל ואין סימנים של גירוי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> איור 4. תרשים סכמטי של המערכת התפקודית

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li>
<li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li>
<li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li>
</ol>

Optogenetics היא טכניקה חדשה ורבת עצמה המאפשרת שליטה חסרת תקדים על תת עצבי ספציפיים. זו יכולה להיות מנוצלת כדי להשפיע על מסלולים עצביים עם דיוק האנטומי וזמני, תוך הימנעות מתא מהסוג חסר הבחנה ואפקטים פולשניים של גירוי חשמלי באמצעות אלקטרודה. השרשה של סיבים אופטיים מאפשרת לגירוי עקבי, כרוני של מעגלים העצביים מעל פגישות מרובות בערים, מתנהגת עכברים עם ניזק מינימאלי לרקמות. מערכת זו, במקור חלוץ ידי ספרטה et al. 8 ושונים שיתאימו למטרות שלנו, הולכים צעד אחד מעבר לצינו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב או הציוד </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שרוול LC כובעון מתכת </td><td> מוצרי סיבי דיוק (PFP) </td><td> SM-CS125S </td><td> מזהה מ&quot;מ 1.25 </td></tr><tr><td> FC MM מחבר מראש התאסף </td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230 מיקרומטר כפת מתכת </td></tr><tr><td> מילר FOPD-LC דיסק </td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> לLC ferrules </td></tr><tr><td> צינורות מזלוג </td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900 מיקרומטר od, שם מיקרומטר 250 </td></tr><tr><td> MM LC סטיק כפת מתכת 1.25 מ&quot;מ </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-1270 </td><td> זיהוי מיקרומטר 127 Bore </td></tr><tr><td> MM LC סטיק כפת מתכת 1.25 מ&quot;מ </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230 מיקרומטרזיהוי Bore </td></tr><tr><td> אפוקסי חום לריפוי, מקשה ושרף </td><td> PFP </td><td> ET-353ND-16OZ </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC וSC / מחשב דיסק ליטוש מחבר </td><td> ThorLabs </td><td> D50-FC </td><td> לFC ferrules </td></tr><tr><td> כוח אופטי דיגיטלי ומד אנרגיה </td><td> ThorLabs </td><td> PM100D </td><td> ספקטרופוטומטר </td></tr><tr><td> הפוליש Pad </td><td> ThorLabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;x 13&quot; 50 מד קשיות </td></tr><tr><td> תחמוצת אלומיניום מלחך פחים (פוליש): 0.3, 1, 3, 5 גריסי מיקרומטר </td><td> ThorLabs </td><td> LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P </td><td></td></tr><tr><td> סיבי Multimode חיפוי קשיחים סטנדרטיים </td><td> ThorLabs </td><td> BFL37-200 </td><td> OH נמוך, Core מיקרומטר 200, 0.37 NA </td></tr><tr><td> כלי עקירת סיבים </td><td> ThorLabs </td><td> T10S13 </td><td> לבוש / Coב: מיקרומטר 200/300 מיקרומטר </td></tr><tr><td> סיבי סיליקה / אופטיים סיליקה </td><td> טכנולוגיות Polymicro </td><td> FVP100110125 </td><td> הגבוה OH, UV משופר, 0.22 NA </td></tr><tr><td> 1x1 משותף רוטרי fiberoptic </td><td> עדשות דוריים </td><td> FRJ_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> מונה fiberoptic Patchcord </td><td> עדשות דוריים </td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> מחמם לכווץ צינורות, סנטימטר 1/8 </td><td> בעלות הברית אלקטרוניקה </td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td> אקדח חום </td><td> בעלות הברית אלקטרוניקה </td><td> 972-6966 </td><td> 250 ואט; 750-800 ° F </td></tr><tr><td> הכותנה הטתה applicators </td><td> הפוריטנית רפואית מוצרי חברה </td><td> 806-ב&quot;ש </td><td></td></tr><tr><td> דבק רקמות VetBond </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td> אקריליק בסיס התותב פלאש </td><td> ייטס Motloid </td><td> ColdPourPowder + liq </td><td></td></tr><tr><td> בון מיניאטורות מספרי איריס </td><td> Miltex Integra </td><td> 18-1392 </td><td> 3-1/2 &quot;(8.9cm), ישר, להבי 15 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> ג&#39;ונס הופקינס בולדוג קלאמפ </td><td> Miltex Integra </td><td> 7-290 </td><td> 1-1/2 &quot;(3.8 סנטימטרים), התעקל </td></tr><tr><td> MEGA-מומנט חשמלי מעבדת מוטור </td><td> וקטור </td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td> פנתר burs-Ball # 1 </td><td> קלרקסון מעבדה </td><td> 77.1006 </td><td></td></tr><tr><td> ויולט בלו ליזר מערכת </td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-O </td><td> אורך גל: 473 ננומטר </td></tr><tr><td> ספק כוח הליזר </td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td> דומון # 2 מלקחי Laminectomy </td><td> Fהגדרות משיווק מדעים </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> בדיקה </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 10140-02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 &quot;מלקחי סטרייט </td><td> Excelta </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td> מלחציים עם בסיס משוקלל </td><td> Altex אלקטרוניקה </td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

השרשה של סיבים אופטיות לגירוי optogenetic כרוני של רקמת המוח

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

דפוסי הבהרה של קישוריות עצבית כבר אתגר למדעי המוח קליניים ובסיסיים. אלקטרופיזיולוגיה כבר את תקן הזהב לניתוח דפוסים של קישוריות הסינפטית, אבל הקלטות אלקטרו לזווג יכולות להיות גם מסורבלות וניסוי מגביל. הפיתוח של optogenetics הציג שיטה אלגנטית כדי לעורר נוירונים ומעגלים, הוא ב1 מבחנת in vivo 2,3. על ידי ניצול פעילות תא ספציפית אמרגן סוג לנהוג ביטוי אופסין באוכלוסיות עצביות נפרדות, ניתן לעורר דווקא תת עצבי מוגדר גנטי במעגלים שונים 4-6. שיטות שתוארו היטב כדי לעורר נוירונים, כולל גירוי חשמלי ו / או מניפולציות תרופתיות, לעתים קרובות ללא הבחנת תאי סוג, פולשני, ויכולות להזיק לרקמות מסביב. מגבלות אלה עלולות לשנות את התפקוד נורמלי הסינפטי ו / או התנהגות מעגל. בנוסף, בשללאופי של המניפולציה, השיטות קיימות הן לעתים קרובות חריפות וסופנים. Optogenetics מקנה את היכולת לעורר נוירונים בצורה יחסית לא מזיקה, ובנוירונים ממוקדים מבחינה גנטית. רוב המחקרים שכלל בoptogenetics vivo כרגע להשתמש סיב אופטי מודרך דרך צינורית 6,7 מושתל, אולם מגבלות של שיטה זו כוללות רקמות פגועות מוח עם כניסה חוזרת של סיב אופטי, ושבירת פוטנציאל של הסיבים בתוך הצינורית. בהתחשב בתחום המתפתח של optogenetics, שיטה אמינה יותר לגירוי כרוני יש צורך להקל על מחקרים ארוכי טווח עם ניזק לרקמות ביטחונות מינימאליים. כאן אנו מספקים הפרוטוקול השונה שלנו כמאמר וידאו כדי להשלים את השיטה המתוארת ביעילות ובאלגנטיות בספרטה et al. 8 עבור הייצור של שתל סיבים אופטיים וקיבועו הקבוע על הגולגולת של עכברים מורדמים, כמו גם את ההרכבה של סיבמצמד אופטי חיבור השתל למקור אור. השתל, מחובר עם סיבים אופטיים לליזר מצב מוצק, מאפשר שיטה יעילה כרוני לphotostimulate מעגלים עצביים פונקציונליים עם ניזק לרקמות פחות 9 באמצעות חבלים, קטנים, נתיקים. קיבוע קבוע של שתלי הסיבים האופטיים מספק עקבי, לטווח ארוך במחקרי vivo optogenetic של מעגלים עצביים בעכברים, ערים מתנהגים 10 עם ניזק לרקמות מינימאלי.

הפיתוח של optogenetics מספק כעת את האמצעים בדיוק כדי לעורר נוירונים ומעגלים מוגדרים גנטי, שני<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em&gt;. כאן אנו מתארים את ההרכבה וההשתלה של סיבים אופטיים לphotostimulation הכרוני של רקמת מוח.

השרשה של סיבים אופטיות לגירוי Optogenetic כרוני של רקמת המוח

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

מטרת הניסוי הבא היא להפעיל ולחקור מעגלים עצביים לטווח ארוך בעכברים ערים ומתנהגים. שיטה זו מותאמת מהמושג שתואר במקור בספרטה ואחרים. זה מושג על ידי הרכבה ראשונה של כבל זוג סיבים אופטיים, המחבר את המפרק הסיבובי האופטי לשתל הסיבים האופטיים.לאחר מכן, הסיב האופטי מושתל על רקמת המוח המעניינת כדי ליצור מעבר לאור לעבור ישירות לתעלה המבטאת תאי עצב. לבסוף, מקור האור מחובר למפרק הסיבובי האופטי על מנת ליצור נתיב מחובר סדרתי ממקור האור לרקמת המוח. בסופו של דבר, ניתן להעריך ירי המושרה באור של נוירונים המבטאים תעלה אדום על סמך מחקרי in vivo, אלקטרופיזיולוגיה והתנהגות.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו צינוריות מנחות הוא שהיא ממזערת את הנזק לרקמת המוח הנגרם על ידי החדרה והסרה חוזרת של סיב אופטי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד המעגל העצבי, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כדי להבין טוב יותר את המנגנונים התלויים בסינפסה ובמעגל העומדים בבסיס סוגים מסוימים של הפרעות נוירולוגיות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.מכיוון שקשה לשלוט בשלבי ההשתלה, כל שלב מינורי לכאורה תורם רבות ליציבות ולאמינות הכללית של השיטה. התחל בחיתוך 35 מילימטרים של סיב אופטי בקוטר 125 מיקרון עם ליבה של 100 מיקרון על ידי מיקום סופר קרביד קצה טריז בניצב לסיב האופטי וניקוד הסיב בתנועה חד כיוונית אחת ואחריה משיכה ישר החוצה. כעת, הכנס פרא קרמי lc עם 127 מיקרון בקוטר קדח קמור המחודד כלפי מטה לתוך סגן ולאחר מכן הכנס את חתיכת הסיב האופטי לתוך הפרא.הסיב האופטי אמור להחליק פנימה בצורה חלקה ושולית מעבר לקצה הקמור של הפרא. לאחר מכן מרחו טיפה אחת של אפוקסי סיבים אופטיים טריים הניתנים לריפוי בחום על הקצה השטוח של הפרא, ולאחר מכן מרחו אקדח חום על האפוקסי. האפוקסי אמור למלא את הפרא כשהוא מחומם ונרפא כשהוא משחיר.לאחר הריפוי, נקה כל אפוקסי מצידי הפרא, ולאחר מכן באמצעות דיסק ליטוש סיבים אופטיים lc יוצר דפוסי סיבוב מעגליים כדי ללטש את הקצה הקמור של הפרא על יריעות ליטוש תחמוצת אלומיניום על כרית ליטוש בארבע דרגות יורדות. לאחר מכן חתוך את הסיב האופטי בקצה השטוח לאורך המתאים למיקוד לאזור העניין. כדי לבדוק את הסיבים האופטיים המלוטשים, הכנס את הקצה המלוטש של השתל לשרוול המצמד.עד שיורגש מגע ישיר עם הפרא היריב, לשתל גרוע תהיה נקודת מוקד חלשה ליד קצה הסיב האופטי, בעוד ששתל טוב יעביר מעגל אור קונצנטרי חלק ללא פלט. הספקים של עד 10 מיליוואט מאחסנים את השתלים המוגמרים בקצף עד לשימוש. התחל שלב זה על ידי מדידה ולאחר מכן ניקוד סיב אופטי בקוטר 220 מיקרון עם ליבה של 200 מיקרון כדי לאפשר לעכבר לנוע בחופשיות אך לא לאפשר לעכבר ללעוס את הסיב.לאחר מכן הכנס את הסיב האופטי לחתיכת צינור פרווה בקוטר פנימי מעט גדול יותר ואורך מעט קצר יותר מאלה של הסיבים האופטיים. כעת, הפשיטו כ-25 מילימטרים מקצה אחד של הסיב האופטי והכניסו אותו לקצה המתכת של מכלול פרא FC MM רב-מצב. עם קדח בקוטר של 230 מיקרון עד שהוא נעצר, הסיב האופטי אמור לבלוט החוצה דרך הקצה הפראי.לאחר מכן, אבטח את החיבור עם ציאנואקרילט בקצה המתכת וכסה את החיבור עם מחבר אתחול ללטש את הקצה הפראי עם דיסק ליטוש FC כפי שהודגם זה עתה. לאחר הפשטת הקצה השני של הסיבים האופטיים, הכנס אותו לתוך פרא קרמי lc עם הקצה הקמור הדיסטלי בלבד. לאחר מכן מרחו טיפת אפוקסי על הקצה השטוח וחממו עד לריפוי, כפי שהודגם זה עתה.לאחר ליטוש הקצה הקמור של הפרא כפי שהודגם זה עתה, החלק שרוול פראי lc על הקצה הקמור של הפרא עד שהפרא יגיע לנקודת האמצע של השרוול. לאחר מכן הנח צינור כיווץ חום מעל הצינור והשרוול וחמם את צינור כיווץ החום כדי לאבטח ולהגן על החיבור. לבסוף, חבר את הפרא למקור הלייזר ולאחר מכן בדוק אותו על ידי מדידת תפוקת האור דרך המצמד עם ספקטרופוטומטר, אובדן האור בין פלט הלייזר לתפוקת המצמד הנמדד לא יעלה על 30% לפני תחילת הניתוח.יש לחטא את אזור הניתוח באלכוהול בפרופיל איזופ ואחריו בתמיסת כלורהקסידין. לאחר מכן, הנח את העכבר במתקן הסטריאוטקסי ואבטח את הראש וודא שהגולגולת ישרה. מרחו משחה עיניים על עיני החיה כדי למנוע יובש וכאבים לאחר הניתוח.כעת בצע חתך דרך קו האמצע של הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת ממסלולי העיניים לתפר הלמבדה. השתמש במלחציים סרפין כדי לעכב את העור ולשמור על גישה לגולגולת. לאחר מכן השתמש בקיסם שיניים כדי לחרוט דפוס משובץ על פני הגולגולת.שוטפים את הפסולת שנוצרה במי מלח סטריליים. לאחר ייבוש יסודי, השתמש במקלון צמר גפן כדי למרוח מי חמצן 3% על הגולגולת החשופה במשך שתיים עד שלוש שניות ליצירת מיקרו-נקבוביות. לאחר מכן שטפו את הגולגולת מספר פעמים במי מלח סטריליים יותר וייבשו אותה היטב.לאחר חריטה, שטיפה וייבוש של תבנית לוח השחמט לתוך הגולגולת, שוב, הכנס את שתל הסיב האופטי למחזיק הבדיקה ולאחר מכן חבר אותו לזרוע הסטריאוטקסית. קבע את מיקום חור הבור עם אטלס סטריאוטקטי מכויל ל-bgma ולמבדה. לאחר מכן השתמש במקדחה דנטלית סיבובית כדי ליצור חור קטן בקוטר של פחות ממילימטר אחד מעל אזור העניין, והקפיד לא לשבור את הדורה או לפגוע ברקמה כלשהי.באמצעות מיקום הזרוע הסטריאוטקסית של השתל במקומו ישירות מעל אזור העניין, הפרא צריך לנוח על רקמת הגולגולת שמסביב. כעת השתמשו בקיסם סטרילי כדי למרוח שכבה דקה ואחידה של מלט דנטלי טרי שהוכן על הגולגולת ועל החלק התחתון של השתל. היזהר לא לבוא במגע עם עור החיה, שכבת הבסיס של מלט שיניים צריכה לכסות שטח פנים רב ככל האפשר על הגולגולת.ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא מריחת המלט הדנטלי מבלי שהוא ייגע בעור המסה. כדי להבטיח הצלחה, יש למרוח כמויות קטנות של מלט בכל פעם בשכבות דקות ולהמתין לייבוש מלא של כל שכבה לפני הוספת השכבה הבאה. מרחו שכבות אחידות של המלט הדנטלי ליצירת תלולית קטנה על גבי הגולגולת וסביב השתל.השאירו את שלושת עד חמישה המילימטרים של הקצה הקמור של הפרא נקיים ממלט כדי לאפשר חיבור חלק ללא הפרעה. לאחר מכן תפר את הקרקפת מעל תלולית המלט הדנטלי וסביב השתל ניתן להשתמש בדבק בונד וטרינרי לקשירה נוספת לאחר התפירה. לבסוף, מרחו משככי כאבים מקומיים ואנטיביוטיקה על עור התפר וסביב בסיס השתל, ולאחר מכן הניחו את העכבר בכלוב להתאוששות לאחר הניתוח.הרכבה נכונה של שתל הסיב האופטי והמצמד מביאה לאובדן פוטון מינימלי בין מקור האור לקצה הסיב האופטי באזור העניין. בעוד שסיבים אופטיים מלוטשים אמורים להעביר אור במעגל קונצנטרי אחיד בדומה למעגל המוצג כאן כפי שניתן לראות בתמונה זו עם השתלה ותפירה קפדנית, השתל אינו גורם לגירוי גלוי לעכבר ויכול להישאר במקומו למחקרים ארוכי טווח ללא כל השפלה משמעותית של הסיב האופטי או לכמות האור המועברת מבחנים התנהגותיים פונקציונליים בעכבר ער מראים תגובה ישירה מגירוי באמצעות סיב אופטי המושתל מעל קליפת המוח המוטורית, כפי שמעידים נתוני וידאו של אלקטרופיזיולוגיה in vivo המציגים את הפעלת נוירונים ממוקדים דרך השתל ואת התגובה ההתנהגותית של החיה במהלך גירוי מוחי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו גירוי פוטו של אזורי מוח ממוקדים על מנת לענות על שאלות נוספות כגון מהם דפוסי קישוריות המעגלים הקשורים לתאי המטרה?לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב שתלי סיבים אופטיים וחוטי מצמד, וכיצד להשתיל אותם על רקמת מוח המבטאת סבלים אופטוגנטיים.

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

נוירונים בוגרים שנולדו של הנורה חוש הריח יכול להיות נשלט באמצעות optogenetically Channelrhodopsin2-לבטא הזרקת lentiviral בזרם נודדות מקורי ו photostimulation כרונית עם מיניאטורי מושתל LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

הפיתוח האחרון של כלים מדעי המוח המשלבים גנטיקה ואופטיקה, המכונה "optogenetics", מאפשר שליטה על פעילות מעגלים עצבית ברמה חסרת תקדים של רזולוציה מרחב ובזמן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשילוב בהקלטה vivo עם המניפולציה optogenetic של תת קבוצות גנטית מוגדרות של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה וsubicular הקדם חזיתית.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

אופטוגנטיקה הפכה לכלי רב עוצמה לשימוש בניסויים במדעי המוח ההתנהגותיים. פרוטוקול זה מציע מדריך שלב אחר שלב לתכנון והקמה של מערכות לייזר, ומספק פרוטוקול מלא לביצוע גירויים אופטוגנטיים מרובים ובו זמנית התואמים לרוב פרדיגמות הבדיקות ההתנהגותיות של מכרסמים.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

פרוטוקול זה מתאר את השלבים וניתוח הנתונים הנדרשים לביצוע מוצלח של הדמיית תהודה מגנטית תפקודית אופטוגנטית (ofMRI). ofMRI היא טכניקה חדשה המשלבת קריאת fMRI בשדה גבוה עם גירוי אופטוגנטי, ומאפשרת מיפוי ספציפי לסוג התא של מעגלים עצביים פונקציונליים והדינמיקה שלהם על פני כל המוח החי.

MRI פונקציונלי optogenetic

כאן, אנו מציגים שיטה להעברת נגיפי ביטוי וקטורים למוח באמצעות סרטי משי fibroin. שיטה זו מאפשרת משלוח ממוקד של וקטורים ביטוי באמצעות סיבים אופטיים מצופים משי/AAV, סיבים אופטיים מחודדות וחלונות הגולגולת.

אין ויוו יישוב ביטוי של חלבונים Optogenetic באמצעות סרטי משי/AAV

עם מניפולציה אופטוגנטית של אוכלוסיות עצביות ספציפיות או אזורים במוח, התנהגות ניתן לשנות עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה בבעלי חיים נעים בחופשיות. באמצעות כלים אופטוגנטיים שונים בשילוב עם סיבים אופטיים מושתלים כרונית, ניתן לבצע מגוון של אפנון עצבי ובדיקות התנהגותיות.

מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית לווסת את ההתנהגות בעכברים נעים בחופשיות

כאן אנו מציגים את שיטת הייצור של מערכת אופטרודה עם סיבים אופטיים להעברת אור ומערך אלקטרודות להקלטה עצבית. ניסויי In vivo עם עכברים מהונדסים המבטאים את channelrhodopsin-2 מראים את ההיתכנות של המערכת לגירוי אופטוגנטי סימולטני ורישום אלקטרופיזיולוגי.

מערך Optrode לאפנון אופטוגנטי סימולטני והקלטה עצבית חשמלית

פרוטוקול זה מפרט הליך כירורגי לביצוע ניתוחי חוט שדרה ולהשתלה ואבטחה של שוק אופטי מעל חוט השדרה במכרסמים.

השתלת מכשירים אופטואלקטרוניים בחוט השדרה המכרסם

פיתחנו גישה פשוטה וחסכונית לייצור אלקטרודות וערכנו הקלטות של אותות באזורים מרובים בעכברים הנעים בחופשיות. שימוש באופטוגנטיקה, לצד אלקטרופיזיולוגיה רב-אזורית ורישום אותות סידן, איפשר גילוי של פעילויות עצביות באזורים שונים במודל הצתת ההתקפים.

שיטה משולבת ליצירת אופטרודים אלקטרופיזיולוגיים גמישים ונוחים להקלטה רב-אזורית in vivo

פרוטוקול זה מספק שיטה משולבת הכוללת העברת ויראלית, השתלת אופטרודה, השראה פוטותרומבוטית, רישום סימולטני של פעילות אסטרוציטים ונוירונים, וגירוי אופטוגנטי של אסטרוציטים. שיטה משולבת זו שואפת לספק חקירה מקבילה של מערכת היחסים בין האסטרוציטים לנוירון בשלבים החריפים ועד הכרוניים של שבץ איסכמי.

שיטה משולבת למידול שבץ פוטוטרומבוטי ורישום אופטרודה ב-vivo של פעילות נוירונית ואסטרוציטית בעכברים מתנהגים

למדו שיטה להשרשת סיבים אופטיים לגירוי אופטוגנטי כרוני של נוירונים במוח עכברים בהקיץ. טכניקה זו ממזערת נזק לרקמה ומאפשרת מחקר מעגלים עצביים לטווח ארוך.

השרשה של סיבים אופטיות לגירוי Optogenetic כרוני של רקמת המוח

גלה סרטונים נוספים