השרשה של סיבים אופטיות לגירוי Optogenetic כרוני של רקמת המוח

מטרת הניסוי הבא היא להפעיל ולחקור מעגלים עצביים לטווח ארוך בעכברים ערים ומתנהגים. שיטה זו מותאמת מהמושג שתואר במקור בספרטה ואחרים. זה מושג על ידי הרכבה ראשונה של כבל זוג סיבים אופטיים, המחבר את המפרק הסיבובי האופטי לשתל הסיבים האופטיים.

לאחר מכן, הסיב האופטי מושתל על רקמת המוח המעניינת כדי ליצור מעבר לאור לעבור ישירות לתעלה המבטאת תאי עצב. לבסוף, מקור האור מחובר למפרק הסיבובי האופטי על מנת ליצור נתיב מחובר סדרתי ממקור האור לרקמת המוח. בסופו של דבר, ניתן להעריך ירי המושרה באור של נוירונים המבטאים תעלה אדום על סמך מחקרי in vivo, אלקטרופיזיולוגיה והתנהגות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו צינוריות מנחות הוא שהיא ממזערת את הנזק לרקמת המוח הנגרם על ידי החדרה והסרה חוזרת של סיב אופטי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד המעגל העצבי, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כדי להבין טוב יותר את המנגנונים התלויים בסינפסה ובמעגל העומדים בבסיס סוגים מסוימים של הפרעות נוירולוגיות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.

מכיוון שקשה לשלוט בשלבי ההשתלה, כל שלב מינורי לכאורה תורם רבות ליציבות ולאמינות הכללית של השיטה. התחל בחיתוך 35 מילימטרים של סיב אופטי בקוטר 125 מיקרון עם ליבה של 100 מיקרון על ידי מיקום סופר קרביד קצה טריז בניצב לסיב האופטי וניקוד הסיב בתנועה חד כיוונית אחת ואחריה משיכה ישר החוצה. כעת, הכנס פרא קרמי lc עם 127 מיקרון בקוטר קדח קמור המחודד כלפי מטה לתוך סגן ולאחר מכן הכנס את חתיכת הסיב האופטי לתוך הפרא.

הסיב האופטי אמור להחליק פנימה בצורה חלקה ושולית מעבר לקצה הקמור של הפרא. לאחר מכן מרחו טיפה אחת של אפוקסי סיבים אופטיים טריים הניתנים לריפוי בחום על הקצה השטוח של הפרא, ולאחר מכן מרחו אקדח חום על האפוקסי. האפוקסי אמור למלא את הפרא כשהוא מחומם ונרפא כשהוא משחיר.

לאחר הריפוי, נקה כל אפוקסי מצידי הפרא, ולאחר מכן באמצעות דיסק ליטוש סיבים אופטיים lc יוצר דפוסי סיבוב מעגליים כדי ללטש את הקצה הקמור של הפרא על יריעות ליטוש תחמוצת אלומיניום על כרית ליטוש בארבע דרגות יורדות. לאחר מכן חתוך את הסיב האופטי בקצה השטוח לאורך המתאים למיקוד לאזור העניין. כדי לבדוק את הסיבים האופטיים המלוטשים, הכנס את הקצה המלוטש של השתל לשרוול המצמד.

עד שיורגש מגע ישיר עם הפרא היריב, לשתל גרוע תהיה נקודת מוקד חלשה ליד קצה הסיב האופטי, בעוד ששתל טוב יעביר מעגל אור קונצנטרי חלק ללא פלט. הספקים של עד 10 מיליוואט מאחסנים את השתלים המוגמרים בקצף עד לשימוש. התחל שלב זה על ידי מדידה ולאחר מכן ניקוד סיב אופטי בקוטר 220 מיקרון עם ליבה של 200 מיקרון כדי לאפשר לעכבר לנוע בחופשיות אך לא לאפשר לעכבר ללעוס את הסיב.

לאחר מכן הכנס את הסיב האופטי לחתיכת צינור פרווה בקוטר פנימי מעט גדול יותר ואורך מעט קצר יותר מאלה של הסיבים האופטיים. כעת, הפשיטו כ-25 מילימטרים מקצה אחד של הסיב האופטי והכניסו אותו לקצה המתכת של מכלול פרא FC MM רב-מצב. עם קדח בקוטר של 230 מיקרון עד שהוא נעצר, הסיב האופטי אמור לבלוט החוצה דרך הקצה הפראי.

לאחר מכן, אבטח את החיבור עם ציאנואקרילט בקצה המתכת וכסה את החיבור עם מחבר אתחול ללטש את הקצה הפראי עם דיסק ליטוש FC כפי שהודגם זה עתה. לאחר הפשטת הקצה השני של הסיבים האופטיים, הכנס אותו לתוך פרא קרמי lc עם הקצה הקמור הדיסטלי בלבד. לאחר מכן מרחו טיפת אפוקסי על הקצה השטוח וחממו עד לריפוי, כפי שהודגם זה עתה.

לאחר ליטוש הקצה הקמור של הפרא כפי שהודגם זה עתה, החלק שרוול פראי lc על הקצה הקמור של הפרא עד שהפרא יגיע לנקודת האמצע של השרוול. לאחר מכן הנח צינור כיווץ חום מעל הצינור והשרוול וחמם את צינור כיווץ החום כדי לאבטח ולהגן על החיבור. לבסוף, חבר את הפרא למקור הלייזר ולאחר מכן בדוק אותו על ידי מדידת תפוקת האור דרך המצמד עם ספקטרופוטומטר, אובדן האור בין פלט הלייזר לתפוקת המצמד הנמדד לא יעלה על 30% לפני תחילת הניתוח.

יש לחטא את אזור הניתוח באלכוהול בפרופיל איזופ ואחריו בתמיסת כלורהקסידין. לאחר מכן, הנח את העכבר במתקן הסטריאוטקסי ואבטח את הראש וודא שהגולגולת ישרה. מרחו משחה עיניים על עיני החיה כדי למנוע יובש וכאבים לאחר הניתוח.

כעת בצע חתך דרך קו האמצע של הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת ממסלולי העיניים לתפר הלמבדה. השתמש במלחציים סרפין כדי לעכב את העור ולשמור על גישה לגולגולת. לאחר מכן השתמש בקיסם שיניים כדי לחרוט דפוס משובץ על פני הגולגולת.

שוטפים את הפסולת שנוצרה במי מלח סטריליים. לאחר ייבוש יסודי, השתמש במקלון צמר גפן כדי למרוח מי חמצן 3% על הגולגולת החשופה במשך שתיים עד שלוש שניות ליצירת מיקרו-נקבוביות. לאחר מכן שטפו את הגולגולת מספר פעמים במי מלח סטריליים יותר וייבשו אותה היטב.

לאחר חריטה, שטיפה וייבוש של תבנית לוח השחמט לתוך הגולגולת, שוב, הכנס את שתל הסיב האופטי למחזיק הבדיקה ולאחר מכן חבר אותו לזרוע הסטריאוטקסית. קבע את מיקום חור הבור עם אטלס סטריאוטקטי מכויל ל-bgma ולמבדה. לאחר מכן השתמש במקדחה דנטלית סיבובית כדי ליצור חור קטן בקוטר של פחות ממילימטר אחד מעל אזור העניין, והקפיד לא לשבור את הדורה או לפגוע ברקמה כלשהי.

באמצעות מיקום הזרוע הסטריאוטקסית של השתל במקומו ישירות מעל אזור העניין, הפרא צריך לנוח על רקמת הגולגולת שמסביב. כעת השתמשו בקיסם סטרילי כדי למרוח שכבה דקה ואחידה של מלט דנטלי טרי שהוכן על הגולגולת ועל החלק התחתון של השתל. היזהר לא לבוא במגע עם עור החיה, שכבת הבסיס של מלט שיניים צריכה לכסות שטח פנים רב ככל האפשר על הגולגולת.

ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא מריחת המלט הדנטלי מבלי שהוא ייגע בעור המסה. כדי להבטיח הצלחה, יש למרוח כמויות קטנות של מלט בכל פעם בשכבות דקות ולהמתין לייבוש מלא של כל שכבה לפני הוספת השכבה הבאה. מרחו שכבות אחידות של המלט הדנטלי ליצירת תלולית קטנה על גבי הגולגולת וסביב השתל.

השאירו את שלושת עד חמישה המילימטרים של הקצה הקמור של הפרא נקיים ממלט כדי לאפשר חיבור חלק ללא הפרעה. לאחר מכן תפר את הקרקפת מעל תלולית המלט הדנטלי וסביב השתל ניתן להשתמש בדבק בונד וטרינרי לקשירה נוספת לאחר התפירה. לבסוף, מרחו משככי כאבים מקומיים ואנטיביוטיקה על עור התפר וסביב בסיס השתל, ולאחר מכן הניחו את העכבר בכלוב להתאוששות לאחר הניתוח.

הרכבה נכונה של שתל הסיב האופטי והמצמד מביאה לאובדן פוטון מינימלי בין מקור האור לקצה הסיב האופטי באזור העניין. בעוד שסיבים אופטיים מלוטשים אמורים להעביר אור במעגל קונצנטרי אחיד בדומה למעגל המוצג כאן כפי שניתן לראות בתמונה זו עם השתלה ותפירה קפדנית, השתל אינו גורם לגירוי גלוי לעכבר ויכול להישאר במקומו למחקרים ארוכי טווח ללא כל השפלה משמעותית של הסיב האופטי או לכמות האור המועברת מבחנים התנהגותיים פונקציונליים בעכבר ער מראים תגובה ישירה מגירוי באמצעות סיב אופטי המושתל מעל קליפת המוח המוטורית, כפי שמעידים נתוני וידאו של אלקטרופיזיולוגיה in vivo המציגים את הפעלת נוירונים ממוקדים דרך השתל ואת התגובה ההתנהגותית של החיה במהלך גירוי מוחי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו גירוי פוטו של אזורי מוח ממוקדים על מנת לענות על שאלות נוספות כגון מהם דפוסי קישוריות המעגלים הקשורים לתאי המטרה?

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב שתלי סיבים אופטיים וחוטי מצמד, וכיצד להשתיל אותם על רקמת מוח המבטאת סבלים אופטוגנטיים.