עיבוד של הפחתה מאמופלסטית אדם ורקמות כריתה לתא תרבות
3 בינואר 2013
שיטה לעיבוד חומרי פסולת אנושיות חלב כירורגית מתוארת. רקמת מעובד, בצורה של organoids, ניתן לאחסן קפוא ללא הגבלה זמן או להציב בתרבות לצמיחה לטווח ארוך. שיטה זו מאפשרת בדיקה ניסיונית של ביולוגיה של תא נורמלית אנושית אפיתל, ואת ההשפעות של הפרעות חיצוניות.
פרוטוקול זה נועד לבודד את חלקי האפיתל של בלוטת החלב ללא תאי סטרומה חלביים קשורים. התחל בדיסקציה מצטברת של חומר ההשלכה הכירורגי כדי להעשיר את מבני האפיתל באמצעות עיכול אנזימטי. הפרד את האורגנואידים האפיתל מהחומר הסטרומלי מחוץ לקרום המרתף.
לאחר מכן עבד את האורגנואידים המעוכלים דרך מסנני תאים בגודל נקבוביות קבוע כדי להשיג שברים מועשרים. זרע את האורגנואידים לתרבית מיידית או הקפיא מלאי לשימוש עתידי. בסופו של דבר, האורגנואידים האפיתל משמשים ליצירת תרביות ארוכות טווח של תאי אפיתל חלב אנושיים רגילים.
פיתחתי את השיטה הזו לראשונה בסוף שנות ה-70 כדי לקדם את תחום הביולוגיה של תאי האפיתל האנושיים וסרטן. חומר השלכה כירורגי בשפע מרקמות זיכרון אנושיות רגילות היה זמין. מה שהיה דרוש היה שיטה לעבד את החומר ההטרוגני בתפזורת כדי להפוך אותו למתאים לתרבית תאי אפיתל טהורה ולמדיה כדי לתמוך בצמיחה ארוכת טווח.
הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה, במיוחד לציון כיצד לבצע את הניתוח הגס. איך נראים אורגנואידים מעוכלים כהלכה? סינון האורגנואידים וציפוי האורגנואידים לתרבית.
היתרון בטכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת שברי אפיתל נקיים שכן סטרומה ותאי האפיתל נשארים שלמים. אורגנואידים, שמצאנו, נותנים את הצמיחה הראשונית הטובה ביותר וממקסמים את מספר התאים שניתן להשיג. שני מדענים מהמעבדה הלאומית לורנס ברקלי, ג'יימס גארווי ומארק לה-בארג' ידגימו כעת הליך זה מהחומר המושלך של הליכים כירורגיים.
השג רקמת חלב אנושית במיכלים סטריליים המכילים בופר או מדיום שלם בתוספת אנטיביוטיקה בארבע מעלות צלזיוס. חותכים חתיכות מהרקמה ומניחים אותן בכלי זכוכית סטרילי גדול. הפרד את אזורי האפיתל מהמטריצה הסטרומלית של רקמת השומן, רקמת החיבור וכלי הדם.
נתח בעדינות את הגדילים הלבנים של אזורי האפיתל המוטבעים במטריצה הסטרומלית הצהובה יותר. החזיקו את החומר בעזרת מלקחיים וגרדו את החומר השומני הגס בעזרת אזמל. לאחר מכן, בעזרת אזמלים מנוגדים, חותכים את רקמת האפיתל לחתיכות של כארבעה מילימטרים כדי להקל על העיכול.
העבירו את רקמת האפיתל המנותחת לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 או 15 מיליליטר ברקמה סיבית בכבדות. יהיה יותר חומר לבן מוצק שאינו אפיתל. אם קשה לנתח את תאי האפיתל מתוך מטריצות סיביות כאלה.
ניתן לחתוך את הרקמה לחתיכות שטח מרובעות של מילימטר עד שלושה מילימטר ולעכל בנפרד. מלאו את הצינור באמצעי העיכול המכיל קולגנאז גולמי וימי אלוור גבוהים, והשאירו מרחב אוויר קטן כדי לאפשר ערבוב במהלך הסיבוב. דגרו את הדגימה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס על מסובב 360 מעלות בשמונה סל"ד לאחר העיכול.
גלולה את הדגימות על ידי צנטריפוגה 600 גרם למשך חמש דקות. השליכו את השומן והמדיום הסופרנטנטי בהתאם להנחיות המוסדיות לסילוק רקמות אנושיות. כדי לעקוב אחר עיכול הרקמות, יש לדלל Eloqua קטן של הכדור במדיום ולבחון מיקרוסקופית באורגנואידים מעוכלים לחלוטין יראה סטרומה מחוברת.
חזור על העיכול האנזימטי עד שהרקמה מתעכלת לחלוטין לאורגנואידים טהורים. אם יש צורך בעיכול לילה שני, ייתכן שיהיה צורך להפחית את ריכוז האנזימים כדי למנוע עיכול יתר. אורגנואידים מעוכלים כראוי יראו מבנים מכתשית צינורית או צינורית חלקים ללא סטרומה מחוברת.
בסיום העיכול, יש להחיות את הכדור הסופי באנטיביוטיקה בינונית. העבירו את הדגימה המעוכלת ב-quats דרך מסננת סטרילית של 100 מיקרון מעל צינור סטרילי של 50 מיליליטר. לאחר שהמדיום התנקז לצינור, שטפו את האורגנואידים בשלושה מיליליטר מדיום.
חזור על הפעולה עד שכל הכדור המרחף הועבר. לאחר מכן הפוך בזהירות את המסנן על צינור סטרילי ושטוף את האורגנואידים לתוך הצינור עם מדיום נוסף. זוהי בריכת האורגנואידים של 100 מיקרון.
כעת העבירו את החומר שהתנקז לצינור המקורי של 50 מיליליטר דרך מסננת של 40 מיקרון כדי להפריד את המבנים המכתשית ממאגר הסינון של תאים בודדים וגושים קטנים של תאים מזנכימליים ואפיתל וחתיכות קטנות של רקמת כלי דם. צנטריפוגה של 100 מיקרון 40 מיקרון ובריכות סינון ב-600 גרם למשך חמש דקות. הרכיבו מחדש כל דגימה באמצעות מיליליטר אחד של סמ"ק.
שתי תמיסות הקפאה לכל 0.1 מיליליטר חיך ארוז. יש לשמור על ארבע מעלות צלזיוס. מניחים בזהירות 0.1 מיליליטר מכל אחת משתי בריכות האורגנואידים.
טיפה אחר טיפה בחלוקה אחידה על פני מנה אחת או שתיים של 35 מילימטר. הימנע מגירוד משטח הכלי לאחר מספר דקות של מתן אפשרות לאורגנואידים להיצמד. הוסף אמצעי גידול לאט כדי למנוע עקירת האורגנואידים.
לאחר מכן דגרו את התרביות הראשוניות ב-37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 לחה. כמו כן זרע 0.1 מיליליטר מבריכת הסינון ישירות על פלסטיק תרבית רקמות עם מדיום פיברובלסטים. דגרו על התרביות העיקריות ב-37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 לחה.
לאחר 24 עד 48 שעות, בדוק אם יש נדידת תאים מהאורגנואידים ולאחר יומיים-שלושה, עקוב אחר תרבית צמיחה מיטוטית. התאים כמעט מפגש מחדשים את המדיום כל יומיים-שלושה. חתיכות קטנות של כלי הדם עלולות להיצמד ולגרום לצמיחת תאי פיברובלסטים.
במקרים של צמיחה פיברובלסטים משמעותית. בצע טריפין דיפרנציאלי כדי להסיר את הפיברובלסטים מכתמי האפיתל הגדולים. שטפו את התאים פעם אחת במאגר STE.
לאחר מכן הוסיפו 0.5 מיליליטר STE טרי כדי לכסות את המנה בהתבוננות מיקרוסקופית רציפה ודפיקות עדינות אך חדות של המנה על משטח קשה. חפש ניתוק פיברובלסטים בזמן שתאי האפיתל הם עדיין מעבר דבק. התרביות העיקריות כאשר כתמי צמיחת האפיתל מתקרבים למפגש.
כדי לשמור על התרבות הראשונית וליצור תרביות משניות מרובות, השתמש בטריפסין חלקי. שטפו את התאים פעם אחת במאגר STE, ואז הוסיפו STE טרי רק לכלי הכיסוי. עקוב אחר ניתוק של כ-50% מהתאים.
לאחר מכן מוסיפים שני מיליליטר סרום המכיל מצע גידול וקוצרים את התאים. לאחר מכן העבירו את התאים לצינור סטרילי של 15 מיליליטר לאחר שתי כביסות. אפרט את התאים שנקטפו והתרבית ניתן לחזור על איזציה חלקית כארבע עד שמונה פעמים עם צמיחה מחודשת של תאים טובים מהמנות הראשוניות ועם צמיחה ארוכת טווח שווה ערך מתת-התרבות או משניים קפואים.
אנו ממליצים להקפיא את התאים מהטריפסין החלקי הראשון לשמירה ולהשתמש בתאים מה-PT השני לתת-תרבית. כאשר הרקמה מתעכלת ומסוננת כראוי, ניתן לראות אורגנואידים המציגים, מבנים צינוריים ומכתשית עם קצוות חלקים ללא סטרומה מחוברת. אם לא מתעכל, יהיה חומר מחובר וזיהום פיברובלסטים יותר אם מתעכל יתר על המידה הקצוות יהיו מחוספסים וההצמדה תהיה פחות יעילה לאחר הצמדת אורגנואידים.
צמיחת האפיתל מתחילה תוך 48 עד 72 שעות ב-48 שעות. עדיין אין חלוקת תאים פעילה עם מיטוזה נראית לעין עד 72 שעות. המיטוזה צריכה להיות גלויה יותר.
חתיכות קטנות של כלי דם יכולות להוות מקור לצמיחת תאים מזנכימליים לאחר ארבעה ימים. גידולי אפיתל מציגים כאן אוכלוסיות הטרוגניות מבחינה מורפולוגית המוכתמות בנוגדנים לקרטין 14 וקרטין 19 מסמן את השושלות הירוקות K 19 לומינליות חיוביות ואדום K 14 חיובי, וגם את תאי האב החיוביים K 14 הצהובים K 19. ניתן לתרבת את HMEC בנוסחאות מדיה שונות.
מצע לחץ נמוך כגון M 87 a בתוספת רעלן כולרה ואוקסיטוצין יתמוך בצמיחה ארוכת טווח טובה יותר של HMEC לפני קיפאון נורמלי, כמו גם צמיחה של שושלות HMEC מרובות. תוצאות ניתוח העובדות ממחישות את מגוון השושלות באורגנואידים הלא מתורבתים ובקטע הרביעי, HMEC מתורבת ב-M 87, מדיום A. כאן, אוכלוסיות הלומינל והשריר מזוהות על ידי ביטוי של סמני לומינל, EPCA ו-CD 2 27 וסמני שריר השריר CD 49 F ו-CD 10 מצופים מחדש.
הקטע הרביעי, HMEC. עובדות מועשרות עבור הסמנים הלומינליים והמיואפיתליים הקודמים אושרו באמצעות ניתוחי אימונופלואורסצנציה עבור קרטין K 14 ו-K 19 HMEC. מתורבת על פלסטיק למעבר ארבע מסוגלים ליצור מבנים מאורגנים עם קשרי שושלת דמויי in vivo של תאים לומינליים ומיואפיתליים כאשר הם ממוקמים ב-CD 2, 27 ו-CD 10 מתאימים, משמשים להעשרה עבור שתי השושלות הללו.
HMCs שומרים על יכולתם ליצור ארגון תאים תלת-ממדי תקין בבארות מיקרו תלת-ממדיות בדוגמת מיקרו עם תאי לומינל פנימיים לתאי שריר האפיתל. עובדות תאי אב מועשרים יכולים גם ליצור מבנים תלת מימדיים חזקים כאשר הם מצופים במטריג'ל המחקה מבנים צינוריים ומכתשית. המבנים התלת-ממדיים ב-Matrigel מציגים גם ארגון עצמי תלת-ממדי תקין.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר את חלקי האפיתל של בלוטת החלב ללא סטרומה החלבית הנלווית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו במהלך יומיים-שלושה. הטכניקה של עיבוד רקמות היא בדרך כלל פשוטה.
חשוב לזכור להפסיק את העיכול בנקודה הנכונה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לעיבוד חומרים שנפסלו מניתוחים של בלוטת השד האנושית לאורגנואידים, אותם ניתן לאחסן בהקפאה או לגדל בתרבית לצמיחה ארוכת טווח. טכניקה זו מקלה על חקר הביולוגיה של תאי אפיתל אנושיים נורמליים ועל השפעתם של גורמים חיצוניים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר תאי אפיתל אנושיים
רקע
- רקמות שד אנושיות נזרקות לעיתים קרובות במהלך הליכים כירורגיים.
- קיים צורך בשיטות לבידוד תאי אפיתל מרכיבים סטרומליים.
- אורגנואידים מספקים מודל בר-קיימא לחקר הביולוגיה של האפיתל.
- שיטה זו פותחה כדי לשפר את המחקר בתחומי הקרצינוגנזה והביולוגיה התאית.
מטרת המחקר
- לבידוד תאים אפיתליאליים מרקמות בלוטת השד.
- ליצירת שיטה מהימנה לתרבית ארוכת טווח של תאים אפיתליאליים של שד אנושי.
- לאפשר בחינה ניסוית של ביולוגיה של התא והפרעות (perturbations).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח של חומרים שנשארו לאחר ניתוח כירורגי להעשרת מבנים אפיתליאליים.
- עיכול אנזימטי להפרדת אורגנואידים אפיתליאליים מחומר סטרומלי.
- סינון דרך מסנני תאים לקבלת פראקציות מועשרות של אורגנואידים.
- תרבית או הקפאה של אורגנואידים לשימוש עתידי.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של אורגנואידים אפיתליאליים טהורים מרקמות שד.
- הדגמה של היכולת לגדל אורגנואידים אלו למשך תקופות ממושכות.
- מתן הדרכה ויזואלית לשלבי הנתיחה והעיבוד.
- הוכחה כי האורגנואידים מניבים צמיחה ותפוקת תאים אופטימלית.
מסקנות
- השיטה מאפשרת מחקר יעיל של תאי אפיתל של בלוטת העלה האנושית.
- היא מספקת הפרדה נקייה של תאי אפיתל מהסטרומה.
- טכניקה זו יכולה לקדם את המחקר בביולוגיה של האפיתל ובסרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
עיבוד מהימן של רקמות כירורגיות משכירי העגלה של בני אדם לאורגנואידים אפיתליאליים טהורים מאפשר יצירת מערכות תאים סטנדרטיות הרלוונטיות למחלה, לצורך גילוי מוקדם ובחינת סיכונים מכניסטיים במחקרי אונקולוגיה והזדקנות. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בתיקוף מטרות ובמחקרים תפקודיים, על ידי אספקת מודלים של תאי אדם הניתנים להרחבה ומאומתים מבחינת השושלת התאית. השיטה נותנת מענה לנקודת מפנה קריטית להמשכיות תרגומית ולסינון תיקי פיתוח במחקר ופיתוח פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מסלולים ספציפיים לאדם בדיפרנציאציה של תאי אפיתל, בהזדקנות תאית (senescence) ובטרנספורמציה.
- תומך בהסרת סיכונים מתוך שיקולים מכניסטיים על ידי אספקת אוכלוסיות תאים בעלות רלוונטיות פיזיולוגית ומאומתות מבחינת השושלת התאית.
- מסייע להגברת הביטחון החזוי בתיקוף מטרות באמצעות מנות תאים סטנדרטיות וניתנות לשחזור.
- מאפשר בחינה ניסויית בקיבולת גבוהה (high-throughput) תוך שימוש בחומר אנושי ראשוני.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק פראקציות אפיתליאליות טהורות ומאומתות לפיתוח בדיקות (assays) חסון ולסריקת תרכובות.
- תומך בשחזור ובסקילביליות (scalability) על ידי מתמירה של סטנדרטיזציה של סדרות וקריו-שימור של אורגנואידים.
- משפר את המוכנות של הבדיקה על ידי שמירה על מספר סממני שושלת וגיוון תפקודי.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות תרכובות במערכות אנושיות הרלוונטיות למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם ביולוגיה רלוונטית למחלה לצורך גילוי ותיקוף של סממנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מודלים ממקור אנושי.
- מפחית את הסיכון לארטיפקטים תלויי-מין על ידי שימוש ברקמות אנושיות במקום במודלים של מכרסמים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות נתונים רלוונטיים פיזיולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו לעיבוד רקמות משתלבת בממשק שבין הגילוי המוקדם למחקר הפרה-קליני, ובכך מאפשרת רצף שלב המעבר מבדיקת היפותזות ועד לזיהוי מועמדים (lead identification) ומחקרי תרגום (translational studies).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים במערכות אפיתליאליות אנושיות.
- סריקה: מספקת תוצרים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות ואפיון תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות המבוססות על שושלת (lineage) וסמנים לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: שומרת על מאפיינים רלוונטיים למחלה לצורך התאמה לסמנים ביולוגיים ומידול פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור צרכים ניסויים מגוונים בקרב צוותי מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תאי אנוש.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה, שיפור השחזוריות ותמיכה בייצור תאים בר-הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקה של תהליכים (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום של תוכניות בתחומי האונקולוגיה וההזדקנות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של רקמות, עיכול אנזימטי וטכניקות של תרביות תאים.
- נדרשת גישה למתקני עיבוד סטריליים ולתשתית אנליטית לאימות שושלת תאים.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים עבור עיבוד מנות ובקרת איכות.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות לסוגי רקמות שונים או להקשרי מחלה שונים.
- ניטור קפדני של שלבי העיכול והסינון הוא קריטי לצמצום זיהומים ולמקסום התוצר.
