ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

מטרת הניסוי הבא היא לנתח את התפתחות תאי השוואן לאורך אקסונים גדלים, בית הגידול הטבעי שלהם. זה מושג על ידי הוצאה ראשונה של גרעיני צוואר הרחם העליונים, או S cgs של עוברי עכברים על מטריצות קולגן כשלב שני. ה-S cgs מטופלים בגורם גדילה עצבי או NGF, המאפשר צמיחה אקסונלית מנוירוני SCG בצורה קורונלית.

בנוסף לצמיחה אקסונלית מאקספלן X, ניתן לראות תאי שוואן אנדוגניים נודדים לאורך האקסונים המורחבים לכיוון הפריפריה. ניתן לנתח את התפתחות תאי שוואן על ידי הדמיית זמן-lapse וגם על ידי ניתוח נקודות קצה של רקמה קבועה, המאפשר מדידות מרחק. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו בדיקת נדידת שריטות, הוא שבית הגידול הטבעי של תאי הברבור נכלל בבדיקה זו.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. שכן ההרכבה הנכונה של מדדי הקולגן והחיתוך הנכון של ה-sgs הם המפתח להצלחה. שלבים אלה אינם קשים במיוחד ללמידה.

הם רק צריכים להתאמן קודם. תוך כדי עבודה בתרבית רקמה הבנו את התנאים שלנו עם כל הפתרונות על הקרח. הכן מדיום תרבית מלאי, וקולגן זנב חולדה על פי ההוראות בפרוטוקול הכתוב.

מערבבים, 800 מיקרוליטר של קולגן זנב עכברוש עם 210 מיקרוליטר של מדיום המלאי. מבלי להכניס בועות, התמיסה צריכה להישאר בצבע אדום. אם התמיסה הופכת לצהובה, אז תמיסת הקולגן של Ratal חומצית מדי ויש להכין אותה מחדש עם ריכוז גדול יותר של פיפטת נתרן הידרוקסיד 100 שחרור מיקרו של התמיסה לכל באר של מגלשה מרובת בארות ולוודא שתחתית כל באר מכוסה לחלוטין.

מניחים את הכלים באינקובטור תרבית רקמה לח המוגדר על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים. לאחר הקציר שלנו, עוברים E 16 עד E 18 מונחים בצלחת פטרי המכילה PBS ואז מנותחים ממי השפיר ועורפים את ראשם בקורטל ישר של עצם הבריח C. אזורי הראש והצוואר מועברים לאחר מכן לצלחת תחתית סיליקון, ותוך כדי הסתכלות דרך מיקרוסקופ מנתח, מחטי חרקים משמשות להצמדת הרקמה באזורים התת-לסתיים ובריח.

כעת השתמש במלקחיים כדי להסיר את העור והרקמה התת עורית של האזור התת-לסת. לאחר מכן הסר את בלוטות הרוק התת-לסתיות כדי לחשוף את השרירים הסופרה היואידים, התת-קרקעיים והסטרנוקלידומסטואידים. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את שרירי האינפרה-היאל והסטרנוקלידומסטואיד כדי לחשוף את הגרון וקנה הנשימה.

אחוז בקנה הנשימה בעזרת המלקחיים והרם החוצה את קנה הנשימה והגרון. לאחר הסרת הגרון וקנה הנשימה, עורקי הצוואר נראים לעין, הם שני צידי השרירים הקדם-חולייתיים. גרעיני צוואר הרחם העליונים ממוקמים בהתפצלות עורקי הצוואר וניתן לזהותם כצורה אליפסה.

השתמש במלקחיים ובמחזיק מחט המותקן עם מחט חרקים כדי להסיר את גרעיני צוואר הרחם העליונים ולהניח בכלי טרי המכיל PBS ואז לנתח את כל כלי הדם או הרקמה המחוברת מהגנגליונים. בעזרת מחטי מזרק, הסר את ג'לי הקולגן הג'לטין מהחממה והשתמש במחטי מזרק המותקנות על מזרקים כדי להעביר את הגרעינים אל הג'לים. הנח את האקספלנטים בחממת תרבית הרקמה המוגדרת על 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ותנאים לחים למשך שעה עד שעתיים.

לאחר שעה עד שעתיים של דגירה, נשלפים צמחי הגנגליון הצווארי העליונים מאינקובטור תרבית הרקמה ומוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום נוירו-בסיסי המכיל תוסף B 27 גלוטמין ואנטיביוטיקה לכל אקספלן. לאחר מכן, 200 מיקרוליטר של מדיום נוירו-בסיסי המכיל 60 ננוגרם למיליליטר. NGF מתווסף גם לבארות כדי להקל על צמיחה אקסונלית.

ניתן להוסיף גם חומרי בדיקה בשלב זה, המוגדר כ-Day in vitro zero כדי לחקור את ההשפעה על תאי ברבור שכבר החלו לנדוד. ניתן לתת חומרי אקסונים בשלושה ימים במבחנה על ידי הסרת 180 מיקרוליטר מהחומר הקיים והחלפתם ב-200 מיקרוליטר של מדיה המכילה את החומר המעניין ו-NGF בריכוז כפול מהסופי, הדמיית זמן-lapse מתבצעת באמצעות מערך מיקרוסקופ הפוך שיאפשר דגירה מקבילה של תרבית תאים והדמיית זמן-lapse להשוואה בין חומרי בדיקה שונים. בניסוי אחד, הגדרה מרובת מיקומים מומלצת בנקודת הסיום של הניסוי.

לאחר קיבוע האקספלנטים בתוך התרבית, החלקות עם 4% PFA למשך שלוש עד ארבע שעות ושטיפה עם PBS מבצעות את האימונוהיסטוכימיה כדי לאמת את צמח ה-X מכיוון שה-SCG חוסם את הרקמה עם PBS המכיל 10% סרום חמור רגיל ו-2% טריטון X 100 למשך שעתיים. לאחר מכן המשיכו עם דגירה ראשונית של נוגדנים בתמיסת חסימה למשך הלילה. למחרת לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים העבירו את האקספלן X המכיל ג'לים לצלחת של 24 בארות לאחר שטיפה עם PBS הדגרו עם נוגדנים משניים עם תווית פלואורסצנטית למשך שעתיים כשהם מוגנים מאור, ואז שטפו עם PBS ודגרו עם תמיסה מטושטשת למשך 10 דקות.

לאחר שטיפה מספר פעמים, הניחו את ג'לי הקולגן המכילים את אקספלן X על מיקרוסקופ, החליקו, יבשו את השקופיות ולאחר מכן הרכיבו עם עגל. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל כדי לקבל תמונות לניתוח כמותי מאוחר יותר. זה מועיל אם תוכנת המיקרוסקופ מסוגלת להקליט מטא נתונים.

ניתן לבצע ניתוח כמותי של תמונות שהתקבלו באמצעות תוכנת פיג'י או ImageJ, בה ניתן להשתמש ללא תשלום ליישומים מדעיים. צמיחה אקסונלית מ-SCGX EXPLAN סכמטי במשך ארבעה ימים במבחנה מודגמת בסרט זה. ניתן לבצע את האימונוהיסטוכימיה ביום הרביעי במבחנה כדי לזהות בבירור את הגנגליון המושתל בבורר.

כגנגליון סימפתטי, ניתן לראות תאי שוואן נודדים לאורך האקסון, עוברים מהגנגליון הצווארי העליון לפריפריה. סרטון זה מציג את אותו דפוס נדידה כפי שנראה רק בהגדלה גבוהה יותר. ניתן למדוד בקלות את מרחקי הנדידה על דגימות נגד גרעינים עם DPI על ידי מדידת המרחק מהגרעינים של תאי השוואן המובילים לגבול ה-SCG המושתל במספר מיקומים כפי שמתואר בסכימה והתמונה של דגימה שטופלה ב-NGF עם התווית DPI בארבעה ימים במבחנה, סרט זה מציג נדידת תאי שוואן בגבול של הרחבת SCG.

השילוב של שדה בהיר ופלואורסצנטי מאפשר הדמיה של תאי ברבור חיוביים S 100 GFP והאקסונים. לבסוף, הסרט הזה מראה נדידת תאי שוואן בגבול של גנגליון צוואר הרחם העליון ex explan. כאן מוצג רק ערוץ הקרינה המאפשר פירוש קל יותר של תאי שוואן חיוביים S 100 GFP.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניתוח כמותי נוסף כמו כימות של התפשטות תא אחד או כימות של אפופטוזיס של תא אחד. כמובן, יש לבצע את האימונוהיסטוכימיה המתאימה לניתוח נקודות קצה או להשתמש בבעלי החיים הטרנסגניים הספציפיים כדי להראות את ההשפעות בהקשר החי.