Name: ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: חקור את התפתחות תאי שוואן לאורך האקסונים הגדלים באמצעות שתלים של גנגליון צווארי עליון מעכברים על מטריצות קולגן. שיטה זו מאפשרת צפייה בזמן אמת בהגירת תאי שוואן בסביבתם הטבעית לחקר מנגנוני החלמה עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו רוצים להודות Arumae Urmas לשיתוף קולגן פרוטוקול ויוטת פיי ואורסולה Hinz לקבלת סיוע טכני מעולה. כמו כן אנחנו רוצים להודות לכריסטיאן פ אקרמן, אולריקה אנגל וניקון מרכז ההדמיה באוניברסיטת היידלברג וגם יואכים קירש לחביבות לעזור לshoting הווידאו. העבודה מומנה באופן חלקי באמצעות Forschungsgemeinschaft דויטשה (SFB 592).

1. הכנת ג&#39;לי קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני מניות, המכיל 455 MEM μl 10x, 3 112 μl 7.5% NaHCO, גלוטמין μl 50 וNaOH. הריכוז וכמות NaOH תלוי בהכנת עכברוש זנב קולגן (ראה 1.2), הנפח הסופי של מדיום המנייה להיות μl 1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קולגן עכברוש זנב פי Ebendal (1). אחסן את פתרון קולגן ב 4 ° C. שפלה של קולגן הפתרון לא יכולה להיות שנצפתה. לאחר ההכנה של קבוצה חדשה, להעריך את ריכוז NaOH דרוש למדיום המניות (ראה 1.1). השתמש כאינדיקטור של pH של המדיום לטיטרציה של הכמות והריכוז של NaOH. 800 קולגן חומצי μl עכברוש זנב צריך להפוך גוון אדום כאשר מעורבב עם 210 μl של מדיום המניות. אם הריכוז של NaOH הוא נמוך מדי פתרון קולגן יהפוך צהוב, בשל מדד החומציות של המדיום. הוסף קולגן לבינוני ומערבבים ללא לדרבןucing בועות. בצע את השלבים הבאים על קרח. פילמור מתרחש בתוך 2 שעות לאחר פתרון קולגן ובינוני המנייה היו מעורבים והפתרון החדש הודגרו ב 37 ° C. בדיקה זו לפני תחילת ניסוי. 1.3) מערבבים 800 μl של פתרון קולגן עם μl 210 מתוך מניות בינוניות (ראה 1.2). 100 μl המקום של פתרון זה בבארות של שקופיות קאמריות 8 היטב. דגירת השקופיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ותנאי לחות בתא תרבות חממה. הכן את ג&#39;לי קולגן תחת ספסל תרבית תאים ותנאים סטריליים. קולגן gelatinizes בתוך 2 שעות. </li></ol> 2. נתיחה של SCGs העוברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים של עכברי קציר זמן הריון (E16-18) מהרחם ולשמור אותם בPBS, עד לביצוע הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח שעוברים אחד מamnion. לערוף את זנב העובר של רמת clavicular. תקן הראש על צלחת תחתית סיליקון עם מחטים &quot;חרקים&quot;. צד הגחון של הראש יש לך להתמודדד יש לך לראות את אזור הלסת התחתון. הקיבעון מאפשר הכנה קלה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור באזור הלסת התחתון ימינה ושמאלה ועימו רקמת חיבור תת עורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בלוטות רוק הלסת תחתונות מהמיקום שלהם כדי לנקות את התצוגה על גבי הלשון ו, שרירי infrahyoidal ושרירי sternocleidomastoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השרירים האלה בזהירות כדי לנקות את התצוגה על הגרון וקנה נשימה. הסר את קנה הנשימה והגרון. עורקי הראש הם אז גלויים משני הצדדים על שרירי prevertebral. SCG ממוקם בהסתעפות של עורקי הראש ויש צורת אליפסה. מוציא בזהירות את הגרעינים ולמקם אותם בערוץ המדע. הסר את הגרעינים בעדינות מכלי הנתיחה אם הם דבוקים אליהם. זה מועיל כדי להשתמש במלקחיים וכן מחזיק מחט רכובה עם &quot;מחט חרק&quot; להסרת SCG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם ב PBS, לאחסן גרעינים בטמפרטורת החדר בPBS עד שנתחת enouגרעיני gh. ואז לנקות את הגרעינים מכלי דם ורקמות חיבור. לבצע נתיחה וניקוי SCG תחת מיקרוסקופ לנתח תחת ספסל זרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, מקם גרעיני explanted על גבי ג&#39;לי קולגן gelatinized בעזרת מחטי מזרק רכובים על מזרק לטיפול קל יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת explants SCG על קולגן gelatinized בתא תרבות חממה על 37 מעלות צלזיוס, עם CO 2 ולחים תנאי 5%. </li></ol> 3. טיפול בexplants SCG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרת 1-2 שעות, לכסות קולגן המכיל explant SCG עם מדיום 100 μl Neurobasal תא התרבות המכיל תוסף B27, גלוטמין ואנטיביוטיקה. עכשיו את הבארות של השקופיות הקאמריות מכילות נפח של 200 μl (ג&#39;ל 100 μl ובינוני μl 100). הוסף 200 μl אחר של המדיום, אולם בה עכשיו NGF (60 ng / ml) כדי להקל על צמיחת אקסונלית. בהתאם לריכוז NGF הסופי הוא 30 ng / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחקור את ההתפרצות של SC הגירה, להוסיף גורמים נוספים ישירות ביום במבחנת 0 (DIV0). ממס את הגורמים במדיום המכיל NGF בריכוז הכפול צורך (2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לנתח את ההשפעה על SCS, שכבר נכתב על הנדידה לאורך האקסונים, להוסיף גורמים נוספים בDIV3 עד DIV4 (תחנת פוטנציאל של הניסוי). לשם כך, להסיר בזהירות 180 μl של הפתרון, בDIV3, ולהוסיף NGF 200 μl החדש בינוני מכיל וגורמים הנוספים של ריבית בריכוז הכפול (2). </li></ol></li></ol> 4. הדמית זמן לשגות השתמש במיקרוסקופ הפוך לניתוחים. יעדים שונים ניתן להשתמש, מגדיר את שדה הראיה והגדלה. היבט חשוב אחד, עם זאת, הוא מרחק העבודה של המטרה בשימוש, כמו הדמיה של explants SCG מתבצעת באמצעות שקופית הזכוכית וקולגןג&#39;ל. במסגרת שיעור ההקלטה של 1/10-30 דקות הראתה תוצאות טובות (2). עם זאת, היבט זה צריך להיות מותאם לשאלה המדעית. מצלמת CCD רגילה יכולה לשמש לרכישה של תמונה. לזמן לשגות הדמית תא דגירת תרבות תא יש שיצורף לשלב של המיקרוסקופ. דגירת הרקמה במהלך הדמיה על 37 מעלות צלזיוס, עם CO 2 ולחים תנאי 5%. התחל שעה אחת מערכת הדגירה לפני תחילת ההדמיה. זה מאפשר את חלקי מיקרוסקופ (אובייקטיבי למשל) כולל שקופיות הקאמריות להסתגל לטמפרטורה ומונע מרחף טמפרטורה מושרה. להגדיר אזורים ספציפיים של ניתוחים (בתוך בexplant ובין explants השונה) עם העזרה של תוכנת מיקרוסקופ ושלב תוכנת שליטה ממונעת (התקנת מספר מיקומים) עבור ניתוחים בו זמניים של תנאים מיושמים שונים לexplants SCG. לרקמת זמן לשגות הדמית wildtype כמו גם רקמות מבעלי חיים מהונדסים יכול לשמשסימון SCS (s100b: GFP) (3). לfluorophores הדמית מקור אור ניאון צריך להיות מיושם בהתקנת micropscope. השתמש במסננים סטנדרטיים. 5. כימות של מרחקי SC הגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת הסיום (DIV4 למשל), לתקן את ג&#39;לי קולגן עם 4% PFA בשקופית החדר לשעתי 3-4. רצף לשטוף את ג&#39;לי קולגן 5 פעמים למשך 10 דקות עם PBS. החל פרוטוקולים סטנדרטיים לimmunocytochemistry (2). אם אתה חדש להכנת SCGs, לאמת את הזהות של גנגליון כגנגליון אוהד ידי אימונוהיסטוכימיה נגד hydroxylase טירוזין (TH) סמן משותף לתאי catecholaminergic. במהלך אימונוהיסטוכימיה (לאחר הנוגדן הראשוני), להעביר את ג&#39;לי קולגן המכיל explant ל 24 גם צלחות, שיש נפח גדול יותר, שהוא מועיל לשטיפה בג&#39;לי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אימונוהיסטוכימיה, למקם את ג&#39;לי קולגן בזהירות על שקופיות זכוכית. זהירותלהסיר את הפתרון שנותר ולתת לקולגן לייבש / להתכווץ לשני ממדים. זה מאפשר מדידות קלות של מרחקים (2). אחרי זה, יעלה את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, למדוד מרחקי נדידה עם העזרה של תוכנת פיג&#39;י (NIH). לא נמצא תוספים מיוחדים דרושים למטרה זו. כדי לאפשר למידות נכונות במיקרומטר, בדוק את מטה הנכונים הדמיה ואת ההגדרות תחת פיג&#39;י, תמונה וקנה המידה. השתמש בפיג&#39;י גם לכימות של תאים. </li></ol>

<ol><li>Ebendal, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEbendal%2C+T+%22Use+of+collagen+gels+to+bioassay+nerve+growth+factor+activity%22">Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity</a>. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).</li>
<li>Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+1+type+III%2FErbB+signaling+is+crucial+for+Schwann+cell+colonization+of+sympathetic+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons.</a> PloS One. 6 (12), e28692(2011).</li>
<li>Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience.+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).</li>
<li>Levi-Montalcini, R., Booker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXCESSIVE+GROWTH+OF+THE+SYMPATHETIC+GANGLIA+EVOKED+BY+A+PROTEIN+ISOLATED+FROM+MOUSE+SALIVARY+GLANDS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).</li>
<li>Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuron-glia+signal+beta-neuregulin+promotes+Schwann+cell+motility+via+the+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway.</a> Glia. 34 (1), 39-51 (2001).</li>
<li>Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+directly+activates+the+exchange+factor+Dock7+to+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration.</a> The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).</li>
<li>Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+its+low-affinity+receptor+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).</li>
<li>Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+growth+factor+2%2C+a+soluble+neuregulin%2C+directly+increases+Schwann+cell+motility+and+indirectly+promotes+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).</li>
<li>Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+regulate+Schwann+cell+migration+by+activating+divergent+signaling+pathways+dependent+on+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).</li>
<li>Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycaemia+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+and+restricts+regeneration+of+axons+and+Schwann+cells+from+adult+murine+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+cell+death+using+an+Hsp90+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).</li>
<li>Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+and+reliable+FRET%2FFLIM+pair+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins.</a> BMC Biotechnology. 9, 24(2009).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

התפתחותה של מערכת העצבים ההיקפית היא תהליך מרתק. כאשר הפיתוח יושלם, אקסונים הensheathed ידי SCS לאורך כל האורך, אשר יכול, בבני אדם, לעתים קרובות יהיה מעל 100 סנטימטר. לצורך כך את המספר הנכון של SCS הנדרש יש שיוקם במהלך הפיתוח וSCS גם צריך לנוע לאורך האקסונים מתארכים לפריפריה כדי להבטיח כיסוי מלא אקסונלית. זה נכון גם לגבי אקסונים unmeylinated myelinated אלא גם ל. בשני המקרים כל האקסונים נמצאים בקשר עם SCS ותלוי בתמיכתם. ללמוד פיתוח SC, מבחנים דרושים שייקחו את תא אקסונלית בחשבון ולכ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> MEM 10x </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט (7.5%) </td><td> Gibco </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> מרק </td><td> 109137 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> רוש </td><td> 1058231 </td><td> מו&quot;פ # 556-NG-100 </td></tr><tr><td> בינוני Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> B27 מוסף </td><td> Gibco </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> אנטיביוטיקה </td><td> Gibco </td><td> 15640 </td><td></td></tr><tr><td> d-PBS </td><td> Gibco </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> מחטי חרקים </td><td> FST </td><td> 26002-20 </td><td></td></tr><tr><td> מחט מזרק </td><td> בראון </td><td></td><td> BD # 300013 </td></tr><tr><td> שקופית קאמרית 8 היטב </td><td> המעבדת tek </td><td> 177402 </td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח התפתחות תאי שוואן murine לאורך האקסונים של גידול

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

הפיתוח של עצבים היקפיים הוא תהליך מרתק. הנוירונים שולחים אקסונים לinnervate מטרות ספציפיות, אשר בבני אדם הן לעתים קרובות במרחק יותר מ 100 סנטימטרים מסומה של תא העצב. הישרדות עצבית במהלך התפתחות תלויה בגורמי גדילה המופקים מהיעד, אלא גם על התמיכה של תאי שוואן (SCS). לאקסונים קצה זה SC ensheath מאזור סומה העצבית (או המעבר ממרכז למערכת עצבים היקפית) לסינפסה או צומת neuromuscular. תאי שווא הם נגזרים של הרכס העצבי ונודדים כמבשרים לאורך האקסונים המתפתחים עד שכל האקסון מכוסה בSCS. זה מראה את החשיבות של SC הגירה להתפתחות מערכת העצבים ההיקפית ומדגיש את הצורך לחקור את התהליך הזה. על מנת לנתח את SC פיתוח, התקנה יש צורך שליד SCS כולל גם המצע שלהם הפיזיולוגי להגירה, לאקסון. בשל התפתחות תוך רחמית <eמ&gt; בתחום הדמית vivo זמן לשגות, לעומת זאת, אינו ישים בחוליות שליה כמו עכבר (mus musculus). כדי לעקוף את זה, התאמן גנגליון טכניקת צוואר הרחם המעולה (SCG) explant. לאחר הטיפול בגורם גדילה עצבי (NGF) explants SCG להאריך האקסונים, ואחרי מבשרי SC הנודדים לאורך האקסונים מגנגליון לפריפריה. היופי של שיטה זו הוא שSC נגזר מברכה של SC אנדוגני ושהם נודדים לאורך האקסונים הפיסיולוגיים שלהם שצומחים באותו הזמן. מערכת זו היא מעניינת במיוחד, משום שפיתוח SC לאורך האקסונים יכול להיות מנותח על ידי הדמית זמן לשגות, פתיחת אפשרויות נוספות כדי לקבל תובנה לתוך הגירת SC.

צמיחת axonal היא הקל מSCG explants על טיפול עם NGF (4) (מזימת סרט ערכת S1 איור 1). תהליך זה נראה בקלות על ידי כל מיקרוסקופ הפוך ויכול להיות מלווה בזמן לשגות הדמיה (סרט S2). אם מדען הוא חדש לביתור SCG מעוברי עכברים אנו ממליצים אימות של הטכניקה על ידי hydroxylase אנטי טירוזין פשוט (TH) אימונוהיסטוכימיה. TH הוא סמן שכיח לנוירונים catecholaminergic (במקרה זה נוירונים סימפטים) ועושה גם אקסונים תווית (איור 2 ב &#39;). בדרך זו אורכי axon...

כאן אנו מתארים תא שוואן (SC) assay הגירה שבSCS מסוגל לפתח לאורך האקסונים של הארכה.

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

מטרת הניסוי הבא היא לנתח את התפתחות תאי השוואן לאורך אקסונים גדלים, בית הגידול הטבעי שלהם. זה מושג על ידי הוצאה ראשונה של גרעיני צוואר הרחם העליונים, או S cgs של עוברי עכברים על מטריצות קולגן כשלב שני. ה-S cgs מטופלים בגורם גדילה עצבי או NGF, המאפשר צמיחה אקסונלית מנוירוני SCG בצורה קורונלית.בנוסף לצמיחה אקסונלית מאקספלן X, ניתן לראות תאי שוואן אנדוגניים נודדים לאורך האקסונים המורחבים לכיוון הפריפריה. ניתן לנתח את התפתחות תאי שוואן על ידי הדמיית זמן-lapse וגם על ידי ניתוח נקודות קצה של רקמה קבועה, המאפשר מדידות מרחק. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו בדיקת נדידת שריטות, הוא שבית הגידול הטבעי של תאי הברבור נכלל בבדיקה זו.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. שכן ההרכבה הנכונה של מדדי הקולגן והחיתוך הנכון של ה-sgs הם המפתח להצלחה. שלבים אלה אינם קשים במיוחד ללמידה.הם רק צריכים להתאמן קודם. תוך כדי עבודה בתרבית רקמה הבנו את התנאים שלנו עם כל הפתרונות על הקרח. הכן מדיום תרבית מלאי, וקולגן זנב חולדה על פי ההוראות בפרוטוקול הכתוב.מערבבים, 800 מיקרוליטר של קולגן זנב עכברוש עם 210 מיקרוליטר של מדיום המלאי. מבלי להכניס בועות, התמיסה צריכה להישאר בצבע אדום. אם התמיסה הופכת לצהובה, אז תמיסת הקולגן של Ratal חומצית מדי ויש להכין אותה מחדש עם ריכוז גדול יותר של פיפטת נתרן הידרוקסיד 100 שחרור מיקרו של התמיסה לכל באר של מגלשה מרובת בארות ולוודא שתחתית כל באר מכוסה לחלוטין.מניחים את הכלים באינקובטור תרבית רקמה לח המוגדר על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים. לאחר הקציר שלנו, עוברים E 16 עד E 18 מונחים בצלחת פטרי המכילה PBS ואז מנותחים ממי השפיר ועורפים את ראשם בקורטל ישר של עצם הבריח C. אזורי הראש והצוואר מועברים לאחר מכן לצלחת תחתית סיליקון, ותוך כדי הסתכלות דרך מיקרוסקופ מנתח, מחטי חרקים משמשות להצמדת הרקמה באזורים התת-לסתיים ובריח.כעת השתמש במלקחיים כדי להסיר את העור והרקמה התת עורית של האזור התת-לסת. לאחר מכן הסר את בלוטות הרוק התת-לסתיות כדי לחשוף את השרירים הסופרה היואידים, התת-קרקעיים והסטרנוקלידומסטואידים. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את שרירי האינפרה-היאל והסטרנוקלידומסטואיד כדי לחשוף את הגרון וקנה הנשימה.אחוז בקנה הנשימה בעזרת המלקחיים והרם החוצה את קנה הנשימה והגרון. לאחר הסרת הגרון וקנה הנשימה, עורקי הצוואר נראים לעין, הם שני צידי השרירים הקדם-חולייתיים. גרעיני צוואר הרחם העליונים ממוקמים בהתפצלות עורקי הצוואר וניתן לזהותם כצורה אליפסה.השתמש במלקחיים ובמחזיק מחט המותקן עם מחט חרקים כדי להסיר את גרעיני צוואר הרחם העליונים ולהניח בכלי טרי המכיל PBS ואז לנתח את כל כלי הדם או הרקמה המחוברת מהגנגליונים. בעזרת מחטי מזרק, הסר את ג'לי הקולגן הג'לטין מהחממה והשתמש במחטי מזרק המותקנות על מזרקים כדי להעביר את הגרעינים אל הג'לים. הנח את האקספלנטים בחממת תרבית הרקמה המוגדרת על 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ותנאים לחים למשך שעה עד שעתיים.לאחר שעה עד שעתיים של דגירה, נשלפים צמחי הגנגליון הצווארי העליונים מאינקובטור תרבית הרקמה ומוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום נוירו-בסיסי המכיל תוסף B 27 גלוטמין ואנטיביוטיקה לכל אקספלן. לאחר מכן, 200 מיקרוליטר של מדיום נוירו-בסיסי המכיל 60 ננוגרם למיליליטר. NGF מתווסף גם לבארות כדי להקל על צמיחה אקסונלית.ניתן להוסיף גם חומרי בדיקה בשלב זה, המוגדר כ-Day in vitro zero כדי לחקור את ההשפעה על תאי ברבור שכבר החלו לנדוד. ניתן לתת חומרי אקסונים בשלושה ימים במבחנה על ידי הסרת 180 מיקרוליטר מהחומר הקיים והחלפתם ב-200 מיקרוליטר של מדיה המכילה את החומר המעניין ו-NGF בריכוז כפול מהסופי, הדמיית זמן-lapse מתבצעת באמצעות מערך מיקרוסקופ הפוך שיאפשר דגירה מקבילה של תרבית תאים והדמיית זמן-lapse להשוואה בין חומרי בדיקה שונים. בניסוי אחד, הגדרה מרובת מיקומים מומלצת בנקודת הסיום של הניסוי.לאחר קיבוע האקספלנטים בתוך התרבית, החלקות עם 4% PFA למשך שלוש עד ארבע שעות ושטיפה עם PBS מבצעות את האימונוהיסטוכימיה כדי לאמת את צמח ה-X מכיוון שה-SCG חוסם את הרקמה עם PBS המכיל 10% סרום חמור רגיל ו-2% טריטון X 100 למשך שעתיים. לאחר מכן המשיכו עם דגירה ראשונית של נוגדנים בתמיסת חסימה למשך הלילה. למחרת לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים העבירו את האקספלן X המכיל ג'לים לצלחת של 24 בארות לאחר שטיפה עם PBS הדגרו עם נוגדנים משניים עם תווית פלואורסצנטית למשך שעתיים כשהם מוגנים מאור, ואז שטפו עם PBS ודגרו עם תמיסה מטושטשת למשך 10 דקות.לאחר שטיפה מספר פעמים, הניחו את ג'לי הקולגן המכילים את אקספלן X על מיקרוסקופ, החליקו, יבשו את השקופיות ולאחר מכן הרכיבו עם עגל. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל כדי לקבל תמונות לניתוח כמותי מאוחר יותר. זה מועיל אם תוכנת המיקרוסקופ מסוגלת להקליט מטא נתונים.ניתן לבצע ניתוח כמותי של תמונות שהתקבלו באמצעות תוכנת פיג'י או ImageJ, בה ניתן להשתמש ללא תשלום ליישומים מדעיים. צמיחה אקסונלית מ-SCGX EXPLAN סכמטי במשך ארבעה ימים במבחנה מודגמת בסרט זה. ניתן לבצע את האימונוהיסטוכימיה ביום הרביעי במבחנה כדי לזהות בבירור את הגנגליון המושתל בבורר.כגנגליון סימפתטי, ניתן לראות תאי שוואן נודדים לאורך האקסון, עוברים מהגנגליון הצווארי העליון לפריפריה. סרטון זה מציג את אותו דפוס נדידה כפי שנראה רק בהגדלה גבוהה יותר. ניתן למדוד בקלות את מרחקי הנדידה על דגימות נגד גרעינים עם DPI על ידי מדידת המרחק מהגרעינים של תאי השוואן המובילים לגבול ה-SCG המושתל במספר מיקומים כפי שמתואר בסכימה והתמונה של דגימה שטופלה ב-NGF עם התווית DPI בארבעה ימים במבחנה, סרט זה מציג נדידת תאי שוואן בגבול של הרחבת SCG.השילוב של שדה בהיר ופלואורסצנטי מאפשר הדמיה של תאי ברבור חיוביים S 100 GFP והאקסונים. לבסוף, הסרט הזה מראה נדידת תאי שוואן בגבול של גנגליון צוואר הרחם העליון ex explan. כאן מוצג רק ערוץ הקרינה המאפשר פירוש קל יותר של תאי שוואן חיוביים S 100 GFP.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניתוח כמותי נוסף כמו כימות של התפשטות תא אחד או כימות של אפופטוזיס של תא אחד. כמובן, יש לבצע את האימונוהיסטוכימיה המתאימה לניתוח נקודות קצה או להשתמש בבעלי החיים הטרנסגניים הספציפיים כדי להראות את ההשפעות בהקשר החי.

analyzing-murine-schwann-cell-development-along-growing-axons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתכוון לתאר באופן הדרגתי...

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

סרטון זה מדגים את מודל ההתרבות של צמח גנגליון שורש גבי ותאי Schwann. בתנאי קוטורטור, חומצה אסקורבית מקדמת התמיינות של תאי Schwann לצורות myelinating. תאי Myelinating Schwann עוטפים את האקסונים מספר פעמים כדי ליצור מעטפת מיאלין, החיונית לתפקוד העצבים.

גידול משותף של צמח גנגליון שורש גבי עם תאי Schwann למיאלינציה של נוירונים

אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי לגנוטיפ, צביעה והכנה של עכברים עובריים להדמיה של הקרנות אקסון נוציספטור היקפיות בבעל החיים כולו, כשיטה יעילה להערכת פנוטיפים של צמיחת אקסונים חושיים בפיתוח עכברים מהונדסים גנטית.

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של נוירונים של גנגליון שורש הגב (DRG) שבודדו מחולדות ואת התרבית של נוירוני DRG על מערכת תרבית תאים סטטית מתוחה מראש כדי לשפר את יישור האקסונים, עם תרבית משותפת של תאי שוואן (SCs) כדי לקדם מיאלינציה.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחשת הקרנה מוטור נוירון, האקסון arborization ב הטרנסגניים Hb9::GFP העכבר עוברי. לאחר immunostaining עבור מוטורי לגלוקוז, השתמשנו גיליון אור זריחה מיקרוסקופ כדי התמונה עוברי עבור ניתוח כמותי עוקבות. פרוטוקול זה חל תהליכים ניווט אחרים תא עצב במערכת העצבים המרכזית.

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

הvivo לשעבר פרוסה מאפשרת העצב outculמניע העצבים כדי להיות בתמונה בזמן אמת. פרוסות מופקים על ידי הטבעת e 10.5 איי. איי. או. עוברי העוברים ב-agarose, הפרוסות על הרטט, וגדלים בחממה בשלב העליון. התפקיד של מסלולים הדרכה אקסון מוערך על ידי הוספת מעכבי התקשורת התרבות.

לשעבר Vivo Oculomotor ניע את התרבות של מעובריים GFP-הביע עכברים עבור זמן הדמיה של מניע העצבי החיצוני

במערכת ההתרבות המשותפת של גרעיני השורש הגבי ותאי Schwann, ניתן ללמוד מיאלינציה של מערכת העצבים ההיקפית. מודל זה מספק הזדמנויות ניסיוניות לצפות ולכמת את המיאלינציה ההיקפית ולחקור את ההשפעות של תרכובות ריבית על מעטפת המיאלין.

מיאלינציה חוץ גופית של אקסונים היקפיים בתרבות משותפת של שורשי חולדה, גנגליון גבי, צמחים ותאי שוואן

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

חקור את התפתחות תאי שוואן לאורך האקסונים הגדלים באמצעות שתלים של גנגליון צווארי עליון מעכברים על מטריצות קולגן. שיטה זו מאפשרת צפייה בזמן אמת בהגירת תאי שוואן בסביבתם הטבעית לחקר מנגנוני החלמה עצבית.

ניתוח התפתחות תאי שוואן Murine לאורך האקסונים של גידול

גלה סרטונים נוספים