LeafJ: תוסף ImageJ למדידת צורת עלה חצי אוטומטית
21 בינואר 2013
הדגמה של שיטות עיקריות למדידה עלתה תפוקה גבוהה. שיטות אלה יכולים לשמש כדי להאיץ phenotyping עלה כאשר לומדים הרבה מוטנטים צמחיים או אחר על ידי צמחי הקרנה פנוטיפ עלה.
מטרת הליך זה היא להפוך את מדידת צורת העלים לאוטומטית עבור ניסויים בתפוקה גבוהה. זה מושג על ידי ניתוח העלים והדמתם באמצעות סורק שטוח. השלב השני של ההליך הוא שימוש בתוסף עלה J כדי לזהות ולמדוד את העלים.
השלב השלישי הוא הכנת העלים למיקרוסקופיה וצילום באמצעות מיקרוסקופ מורכב. השלב האחרון הוא לעקוב אחר קווי המכירה בתמונות שנרכשו באמצעות טאבלט עם מסך מגע. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות הבדלים בצורת העלה, גודל התא ומספר התא באמצעות שילוב זה של ניתוח תמונה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא המהירות שלה. זה מהיר בערך פי שישה ממדידה ידנית. אנשים ידעו ששיטה זו עלולה להיאבק מכיוון שמיקום נכון של עלים הוא קריטי לניתוח במורד הזרם, ומכיוון שהרכבת עלים על מגלשות יכולה להיות מאתגרת מבחינה טכנית.
הרעיון לשיטה הזו עלה לי לראשונה כשהבנתי שיש לנו כ-15,000 עלים לנתח, ולעשות את זה ביד ייקח חודשים רבים ויהיה משעמם להפליא, מה שמדגים שטכניקת דיסקציה של צמחים תגרום לנוירו-זואה. מדען מחקר מהמעבדה שלי התחיל בהכנת יריעות שקיפות בגודל 8.5 על 11 אינץ'. יש לפצל כל גיליון למסגרות מלבניות, גדולות מספיק כדי להכיל את העלים מצמח אחד, לחדד את יריעת השקיפות השנייה לגיליון המודפס כדי לשמש ככיסוי למניעת התייבשות העלים.
תווית עם הצמח, הגנוטיפ ומצב הגידול. מנתחים את העלים של צמחי היום ה -26. סדרו את העלים על השקיפות בסדר טקטי מהצעיר למבוגר ביותר.
מקם את העלים אנכית בתוך המסגרת מבלי לגעת בגבול או לחפוף דפים אחרים. אחרת, יתעוררו בעיות במהלך הניתוח, חשוב עלים מזרחיים אנכית לא נוגעים, מסגרת, לא חופפים עם העלים מסודרים. כריך אותם עם דף השקיפות הריק השני ומתלה כדי לשמור על העלים שטוחים.
לאחר מכן, צרו תמונה באמצעות סורק שטוח עם רזולוציה של 600 נקודות לאינץ' לפחות. התחל בהתקנת התוסף. הורד את תמונה J וגרור את קובץ העלה jja לתיקיית התוספים של תמונה J.כאשר נעשה שימוש בתמונה J, התוסף עלה J יהיה זמין כעת.
המשך בפתיחת קובץ תמונת העלה בתמונה J.ודא שתמונה J היא גרסה 1.45 שניות ואילך. פצלו את התמונה לשלושה ערוצי צבע, אדום, ירוק וכחול בלחיצה על ערוצי פיצול צבע בתמונה. לאחר מכן, החל סף על התמונה בערוץ הכחול.
כעת בחר את כל העלים מצמח אחד באמצעות כלי הבחירה המלבני ולאחר מכן בחר את התוסף עלה J. התוסף יפתח כעת תיבה המאפשרת להגדיר את התנאים השונים של הניסוי, כגון קבוצת ניסוי וגנוטיפ. לפני שתמשיך, ערוך אפשרויות אלה, ולאחר מכן בחר את התנאים עבור העלים שנבחרו באזור העניין וספק שם תיאורי.
לחץ על המשך ועלה J יתאר אוטומטית כל עלה עם תמונת החזר השקעה ייחודית. שגרות J מתאימות לאליפסה ללהב ומחשבות את הצירים העיקריים והקטנים של אותה אליפסה במידת הצורך. ערוך את קווי המעקב באמצעות חלון מנהל ההחזר על ההשקעה.
טאבלט עם מסך מגע המחובר כצג חיצוני יכול להיות שימושי עבור הליך זה. כאשר הגבולות מוגדרים כהלכה, בצע את הניתוח על ידי לחיצה. אוקיי, עכשיו עלה J מוציא את אורך עלי הכותרת וגיאומטריות שונות של להב העלה.
בסופו של דבר, ייצא את תוצאות המדידה והמידע המשויך לגיליון אלקטרוני. לאחר סריקת הדפים, תקן אותם ב-F-A-A-F-A. ניתן לאחסן עלים קבועים בארבע מעלות צלזיוס עד שישה חודשים.
התקדמות שעה או שעתיים לפני הדמיית העלים מנקים את העלים על ידי החלפת קיבוע ה-FAA לתמיסת כלורו-הידרט. לאחר הניקוי, הרכיבו עלים על שקופיות עם טריכומות כלפי מעלה באמצעות הגדלה של פי 40 על תמונת מיקרוסקופ מורכבת, שכבת המסיל של מרכז כל עלה משני צידי הווריד הראשי, תוך הימנעות מתאים ליד טריכומות או ורידים. כדי למנוע קשיים בעיבוד תמונה, חשוב להסיר את כל בועות האוויר מהשקופיות בעת הרכבת עלים וגם לקבל תמונות ממוקדות בשלב הבא.
לאחר איסוף התמונות הרצויות, פתח אחת בתמונה J ועקוב אחר קווי המתאר של תאי העלה באמצעות כלי מנהל JROI של תמונה בעזרת טאבלט מסך מגע ועט. פעולה זו אינה משתמשת בתוסף LEAF J. לפני השימוש ב-LEAF J לניסויים, הדיוק והמהירות של התוסף הושוו לאלו של חוקר מנוסה. הכולל.
עלה J סיים 5.7 מהר יותר מהחישובים הידניים והשוואת הנתונים משתי השיטות הראתה שהתוצאות היו בקורלציה הדוקה עבור כל הפרמטרים שנמדדו מתוך 3,532 שהושוו. נקודות נתונים 172 היו חריגות. מבין החריגים הללו, 29 נגרמו על ידי תוסף LEAF J הרבה פחות מ-143 שנגרמו מטעות אנוש.
במהלך מדידה ידנית, עלה J עודכן מאז כדי להפחית עוד יותר את מספר השגיאות. תוך הסתמכות על מדידות LEAF J, הוא שימש לבדיקת הימנעות מצל באמצעות מודל אפקטים מעורבים. הטיפול ומספר העלים היו השפעות קבועות והשכפול היה כאפקט אקראי.
פרמטרים רבים הושפעו באופן משמעותי מטיפול בצל. לחלופין, חלק מהפרמטרים לא הושפעו באופן משמעותי מהצל. באמצעות ניתוח הדמיה בעזרת טבליה של פרמטרים של תאים, נבדקו 67 גנוטיפים של Arabidopsis ANA בסך הכל 8,629 תאים מ-877 עלים של 224 צמחים.
לאחר מכן קובצו הגנוטיפים לשש מחלקות. לרוב הגנוטיפים יש גודל ומספר תאים נורמליים. עם זאת, לכמה מהם היה גודל תא גדול יותר עם מספר תאים תקין.
בעוד שניסיון הליך זה חשוב להשתמש באקראיות ובתכנון ניסיוני בעת גידול הצמחים שלך, זכור שעבודה עם פורמלדהיד וכלורהידרט עלולה להיות מסוכנת ביותר. לכן יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ועבודה במכסה המנוע בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע סינון תפוקה גבוהה של פנוטיפים של עלים וצורת תא באמצעות תנאי הניסוי שלך בעקבות הליך זה.
ניתן להשתמש בשיטות נוספות כמו ריצוף RNA כדי לענות על שאלות כמו אילו גנים מעצבים ביעילות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים שיטות מרכזיות למדידות עלים בתפוקה גבוהה, במטרה להאיץ את הפנוטיפ של עלים במחקרי צמחים. ההליך כולל דימות של עלים חתוכים וניתוח שלהם כדי לחשוף הבדלים במבנה העלה ובמאפיינים תאיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פנוטיפיקה של צמחים
- ניתוח תמונות
- מחקר בוטני
רקע
- מדידת צורת העלה היא קריטית להבנת מוטציות בצמחים.
- שיטות בעלות תפוקה גבוהה יכולות לשפר את יעילות הסריקה.
- טכניקות אוטומטיות מפחיתות את העבודה הידנית ומגבירות את הדיוק.
- ניתוח תמונה מספק נתונים כמותיים על מורפולוגיית העלה.
מטרת המחקר
- לאוטומציה של מדידת צורת עלים עבור ניסויים בתפוקה גבוהה.
- להקל על חקר מוטציות בצמחים באמצעות פנוטיפינג יעיל.
- לשיפור הדיוק של מדידות עלים באמצעות טכניקות דימוי מתקדמות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ה disection של עלים ולאחריו דימות באמצעות סורק שולחני.
- שימוש בתוסף leaf J לצורך זיהוי ומדידה.
- הכנת עלים למיקרוסקופיה וצילום.
- שרטוט קווי זרימה על גבי תמונות באמצעות טאבלט עם מסך מגע.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של הבדלים בצורת העלה בקרב מוטציות שונות של צמחים.
- כימות גודל התאים ומספר התאים באמצעות ניתוח תמונות.
- מתן שיטה יעילה לפנוטיפיקה של עלים בתפוקה גבוהה.
- הצגת יעילותן של טכניקות אוטומטיות במחקר בוטני.
מסקנות
- שיטות בעלות תפוקה גבוהה משפרות משמעותית את הפנוטיפיקה של עלים.
- ניתוח תמונה אוטומטי הוא כלי בעל ערך למחקר צמחים.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטות אלו עבור יישומים רחבים יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
פנוטיפיקה בתוספת גבוהה (High-throughput phenotyping) מאיצה את מיפוי הקשר בין גן לתפקוד בביולוגיה של צמחים, ותומכת בתיקוף מטרות בביוטכנולוגיה חקלאית. מדידה אוטומטית של צורת העלה והעלטוף מאפשרת סריקה מהירה של מוטנטים תחת גירויים סביבתיים כגון הימנעות מצל (shade avoidance). גישה זו משפרת את הביטחון החזוי בקישור בין הגנוטיפ לתוצאות הפנוטיפיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי ראשוני ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ניתוח כמותי של מורפולוגיית העלה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי סטנדרטיזציה של מדידות אורך העוקץ ופרמטרי הלבלב.
- ערך ניבוי: משפר את מיון הפורטפוליו על ידי קורלציה בין תכונות העלה לבין מודיפיקציות גנטיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי סריקת תרכובות המשכיים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה של הבדיקה ושיחזוריות באמצעות ניתוח תמונות חצי-אוטומטי.
- ניתנות להרחבה: מאפשרת הערכה ברזולוציה גבוהה של פנוטיפים של עלים באוכלוסיות גדולות של מוטנטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תואם למערכות הרלוונטיות למחלה על ידי מדידה של תכונות המגיבות לסביבה, כגון התארכות עוקץ העלה המושרה על ידי הצללה.
- ערך תפעולי: מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות כימות עקבי של תכונות העלה.
- הפחתת סיכונים: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בסינון פנוטיפי.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת היפותזות באמצעות כימות אוטומטי של מורפולוגיית העלים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים על ידי קישור הפרעות גנטיות לשינויים מדידים במבנה העלה.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה ותוצרי מדידה כמותיים להערכה אמינה של תרכובות בסריקות פנוטיפיות.
- אנליטיקה: מייצרת תוצרי סטטיסטיקה על אורך הענקי, שטח הלוח ומורפולוגיית התא להשוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית על ידי מעקב אחר תכונות עלים המגיבות לסביבה על פני גנוטיפים שונים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר עבור פנוטיפיקה של עלים בקנה מידה רחב במגוון פרויקטים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה באמצעות מדידות עלים בעלות דיוק גבוה ושונות נמוכה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability), ומפחית את המאמץ הידני פי ~6 בהשוואה לשיטות ידניות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים הניתנים לשחזור עבור קמפיינים של סריקה גנטית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף גנוטיפים מותאם סיכונים, המבוסס על תגובות מכומתות של תכונות העלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח תמונות ובהכנת דגימות צמחים.
- תלוי בסורק שטוח (≥600 DPI) ובטאבלט עם מסך מגע לתיקון גבולות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי חיתוך העלה והצמדתו.
- כולל שיקולי התאמה לגדלי עלים שונים ולמערכות מודל מעבר ל-Arabidopsis.
- מוגבל בשל אתגרים טכניים במיקום העלה ובהצמדתו לשקופית, המשפיעים על איכות הניתוח בשלבים הבאים.
