Name: הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית בחי שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: למד את שיטת CoTrAC להדמיית ייצור חלבונים בתאי E. coli חיים ברזולוציית מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. השיטה מאפשרת מעקב אחר דינמיקת גורמי שעתוק ללא הפרעה לתפקוד החלבון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PCG001 פלסמיד להביע Ubp1 סופק באדיבות על ידי רוהאן בייקר בג&#39;ון קרטין בית הספר למחקר רפואי. עבודה זו מומנה על ידי מצעד הפרוט מענק המחקר 1-FY2011, מרץ הפרס פרוט זיל אוקונור Starter Scholar Research # 5 FY20 ואות קריירה של NSF 0746796.

1. זרימת עבודת הנדסת מתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קידוד רצפים () רצף קרום לוקליזציה, (ב) חלבון מהיר התבגרות פלורסנט ו( ג) רצף הכרת פרוטאז N-מסוף ולמסגרת עם חלבון של עניין (גורם שעתוק לדוגמה). אנחנו השתמשנו הקרום הממוקד כתב TSR-2 ונוס והתמזגנו זה ברצף פרוטאז הכרת יוביקוויטין (UB) לספור את מספר המולקולות הביעו bacteriophage λ מדכאי CI חלבון. פרטים על אופן בו אנו נבנינו חלבון היתוך TSR-ונוס-UB-CI, החלפה פרועה סוג קידוד CI אזור ושילוב המבנה לE. כרומוזום חיידק באמצעות רקומבינציה λ האדום 3, מתואר בפירוט בנ&quot;צ. 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמת את כל השינויים ברצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך קידוד פלסמיד פרוטאז ספציפי לרצף ההכרה בשימוש מעל לתוך זן מבטא את הכתב והחלבון פלואורסצנטי של ענייןבהיתוך translational. אנחנו השתמשנו פרוטאז Ubp1, שחותך מייד לאחר שאריות יוביקוויטין C-מסוף 4. </li></ol> 2. תאי תרבות ולהתכונן לדוגמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אחד E. מושבת coli ריבית מצלחת אגרה טרי מפוספסת למיליליטר M9 מדיה 1 מינימאלית 5 בתוספת חומצות אמינו 1X ממ ואנטיביוטיקה מתאימה. דגירה בייקרה בטמפרטורה רצויה מספיק זמן כדי להגיע OD 600&gt; 1.0 (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את התרבות למדיום M9 טרי 1 מ&quot;ל באנטיביוטיקה מתאימה לOD 600 = 0.02. דגירה בייקרה בטמפרטורה המתאימה. צפיפות תאית ראשונית ניתן להגדיל במידת צורך לצמיחה בטמפרטורה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר OD 600 = 0.2-0.3 (ב 37 ° C עם תרבית תאים ראשונית בOD 600 = 0.02, זה ייקח שעתי 3-4), להתחיל להכין את agarose ג&#39;ל הכרית (שלב 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מוכנים להדמיה כאשר OD <sub&gt; 600 = 0.3-0.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התרבות דגרה 1 מ&quot;ל לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge, צנטריפוגה ב -10,000 XG לדקות 1 בmicrocentrifuge benchtop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולהוסיף בינוניים M9 מ&quot;ל טרי 1 וresuspend הגלולה בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב -10,000 XG לדקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב 1.6 ו 1.7. השלך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend עדינות במיליליטר M9 מדיה 1. תאים יכולים לשמש ישירות להדמית מיקרוסקופ או 10 מדוללים - ל100-קיפול על מנת להבטיח צפיפות נמוכה של תאים להדמית timelapse. שים לב שהצפיפות נמוכה של תאים חשובות להדמית timelapse מורחבת. חדר ההדמיה (שלב 4) הוא חתום במהלך הניסוי. בשל גידול המעריכי של תאים, תאי ריכוזים ראשוניים גבוהים באופן משמעותי יכולים לרוקן חמצן בתוך התא לאחר צמיחה ממושכת בכרית ג&#39;ל, הפחתת הבשלת החלבון פלואורסצנטי ומשפיע על גדילת תאים. </li></ol> 3. הכן את פתרון agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 10-20 מ&quot;גהיתוך בטמפרטורה הנמוכה agarose לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיום המתאים M9 נפח מינימאלי ללא אנטיביוטיקה לעשות 3% פתרון agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את פתרון agarose למשך 30 דקות ב 70 מעלות צלזיוס כדי להמס, היפוך הצינור כדי להבטיח שהפתרון הוא לגמרי נמס והומוגנית. כרית ג&#39;ל אפשר לשפוך בשלב זה (שלב 4) או הטמפרטורה יכולה להיות ירידה ל 50 מעלות צלזיוס והחזיקה למשך מספר שעות לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 4. הכן Pad ג&#39;ל בלשכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אודות 50 דקות לפני ההדמיה, לשטוף שקופית Microaqueduct עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 1 ניקה מכסה זכוכית (באמצעות שיטת ניקוי מחמירה כמו זו המתוארת ב6) וMicroaqueduct שקופית עם מים סטריליים ויבשים על ידי נשיפה עם אוויר דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את אטם הגומי בשקופית Microaqueduct כך שהוא מכסה את פתחי כניסה ושקעים בצד כוס שקופית Microaqueduct (זה יכול להיות שונה עבור יישומיםשתקשורת היא perfused באמצעות המדגם). החל פתרון 50 μl agarose (שלב 3) למרכז שקופית Microaqueduct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעלה פתרון agarose עם ניקה זכוכית, היבשה הכיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו פתרון agarose לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכין מדגם תא (שלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לקלף את מכסה הזכוכית מהחלק העליון של כרית ג&#39;ל. הוסף תרבית תאים שטופה μl 1.0 לחלק העליון של כרית ג&#39;ל. חכה ~ 2 דקות לתרבות להיספג על ידי כרית ג&#39;ל. חשוב לא לחכות זמן רב כל כך שoverdries הכרית ג&#39;ל, אבל ארוך מספיק כדי שתאים מודבקים היטב למשטח ג&#39;ל. זמן ההמתנה האידיאלי ישתנה בהתאם לטמפרטורה ולחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן המתנה, לייבש מכסה זכוכית precleaned אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את המדגם עם מכסה הזכוכית החדשה להבטיח כי מכסה הזכוכית ושקופית Microaqueduct מיושרות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את חדר צמיחה בטמפרטורה המבוקרת בהתאם להוראות היצרן.עכשיו זה יכול לשמש להדמיה במיקרוסקופ (שלב 5). </li></ol> 5. הדמיה ורכישת סרטי timelapse <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הליזר ומיקרוסקופ בעקבות הוראות היצרן (למשל הליזר ייתכן שיצטרך התחמם במשך ~ 0.5 שעות לפני הניסוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעל את החדר כנס להוספת השלב במיקרוסקופ. הגדר את הטמפרטורה של חדר הצמיחה והתנור בטמפרטורה האובייקטיבי צמיחה רצויה אחרת 37 ° C או. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה מעל טמפרטורת חדר, המיקוד או כרית ג&#39;ל בדרך כלל נסחף באופן משמעותי ל~ 15 דקות אחרי שינוי הטמפרטורה ההתחלתית. בפועל, להשתמש בזמן הזה כדי למצוא אזורים של עניין ולשנות תסריטי הדמיה לפי צורך לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את התאים במיקרוסקופ ולאחסן את המיקום של כל תא לאחר שמרכזו בתוך אזור מוגדר מראש הדמיה ומיושרת. יותר מתא אחד יכול להיות צלם בכל חלון זמן רכישת תמונה. לtimelapse הדמיה מעל מ &#39;דורות כלשהם, ודאו כי תאי הדמיה מופרדים בתחילה מתאים אחרים בלפחות כמה מאה מיקרומטר כך שמושבות אחרות לא להיכנס לאזור ההדמיה במהלך צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם עוצמת עירור ליזר, כך שכמעט כל photobleach ניאון המולקולות בתוך 6 חשיפות (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הסקריפט אוטומטי הדמיה / יומן, איסוף נתוני timelapse שימוש באלגוריתם שתואר בעבודה הניסיונית באיור 3. </li></ol>

<ol><li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells%2C+One+Protein+Molecule+at+a+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).</li>
<li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXiao%2C+J+%22Single+Molecules%3A+a+laboratory+manual%22">Single Molecules: a laboratory manual</a>. , 149-169 (2007).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li>
<li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li>
</ol>

אין לנו שום גילויים.

שיטת CoTrAC ניתן להכליל למדוד את הייצור של חלבונים אחרים כאשר N-או קונבנציונלי fusions החלבון פלואורסצנטי C-מסוף עלול לשבש את פעילות חלבון. אסטרטגית CoTrAC יש שלושה יתרונות ייחודיים על פני שיטות קיימות. ראשית, ההיתוך משותף translational מבטיח שמולקולה אחת של כתב הניאון מיוצרת עבור כל מולקולה של החלבון של עניין, המאפשרת ספירה מדויקת של ייצור חלבון בזמן אמת. שנית, כתב קרום הממוקד TSR-ונוס מאפשר זיהוי מולקולה הבודדה של כתבי ניאון, המאפשר זיהוי של חלבונים מתבטאים ברמות נמוכות מאוד. של...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Agarose (טמפרטורת התכה נמוכה) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> מילי-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × מלחי M9 </td><td></td><td></td><td> המתכון הבא מתואר ב9 </td></tr><tr><td> 20% גלוקוז </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 × פתרון חומצת אמין MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> צמיחת טמפרטורה מבוקרתלשכה מתאם שלב </td><td> BIOPTECHS </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> מחמם אובייקטיבי </td><td> BIOPTECHS </td><td> מודל תלוי במטרת מיקרוסקופ </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct שקופיות </td><td> BIOPTECHS </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> משקפים לכסות Micro </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> יכול להיות קשה למקור; זמין גם BIOPTECHS </td></tr><tr><td> כיסוי זכוכית / אטם שקופית </td><td> BIOPTECHS </td><td> 0.75 מ&quot;מ FCS2 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ פלואורסצנטי </td><td> שונה </td><td> הגדרת דוגמה: קוהירנט Innova 308C ארגון יון הליזר, אולימפוס מיקרוסקופ IX-81, 1.45 אובייקטיבי אולימפוס PlanApo 100X NA, Metamorph תוכנה </td><td> חייב להיות עירור ליזר, שלב xyz אוטומטי, תוכנת אוטומציה מסוגלת הדמיה ופוקוס אוטומטי תסריט, אופטיקה מסוגלים Resolvinחלבוני ניאון בודדים גרם </td></tr><tr><td> מצלמת EM-CCD </td><td> שונה </td><td> הגדרת דוגמה: תידור iXon DU-898 </td><td> חייב להיות רעש נמוך מספיק כדי לזהות חלבוני ניאון בודדים מעל הרקע </td></tr></tbody></table>

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת cotranslational ידי מחשוף (cotrac)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC) לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו מאפשרת לספור את המספרים של מולקולות חלבון היוצר בתא אחד בחלונות זמן רציפים של חמש דקות. זה דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם צפיפות הספק עירור ליזר של ~ 0.5-1 קילוואט / 2 סנטימטר, שהוא רגיש מספיק כדי לזהות מולקולות חלבון ניאון בודדות בתאים חיים. כתב הניאון בשימוש בשיטה זו מורכב משלושה חלקים: רצף קרום מיקוד, מהר התבגרות חלבון, צהוב ניאון ורצף הכרת פרוטאז. הכתב הוא התמזג translationally לN-הסופי של חלבון של עניין. תאים גדלים על במת מיקרוסקופ טמפרטורה מבוקרת. כל חמש דקות, מולקולות ניאון בתוך תאים הם צלמו (ומאוחר יותר שיתוףunted על ידי ניתוח תמונות פלואורסצנציה) ולאחר מכן photobleached כך שחלבונים שתורגמו רק לאחרונה נספרים במדידה הבאה. תמונות פלואורסצנציה נובעות משיטה זו ניתן לנתח על ידי איתור נקודתי ניאון בכל תמונה, הקצאתם לתאים בודדים ולאחר מכן הקצאת תאים לשושלות תאים. מספר חלבונים המיוצרים בתוך חלון זמן בתא נתון מחושב על ידי חלוקת עוצמת הקרינה המשולבת של כתמים מהעוצמת הממוצעת של מולקולות ניאון בודדות. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי למדוד את רמות ביטוי בטווח של 0-45 מולקולות ב 5 חלונות זמן דקות בודדות. שיטה זו אפשרה לנו למדוד את הרעש בביטוי של λ repressor CI, ויש יישומים פוטנציאליים רבים אחרים בביולוגית מערכות.

תוצאות אופייניות מניסוי CoTrAC מעקב הייצור של λ repressor CI מוצגות באיורי 4, 5. בניסוי זה, 12 מושבות צלמו במרווחי 5 דקות. בכל נקודת זמן, מושבת autofocused הראשון ורכזה בתוך אזור ההדמיה. בשלב הבא, העמדה במרכז / ממוקד הייתה מאוחסנת ותמונת brightfield נרכשה. אז הבמה הייתה translocated ידי ~ 0.5 מיקרומטר לאורך ציר Z-לעבור ממישור המוקד של brightfield למטוס ומפריד בין התאים (ללא שלב ניגוד או לעומת פער התערבות (DIC) אופטיקה, חפצים שקופים למחצה ניתן הדמיה במעט מטוסים מחו...

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה הפעלת פלואורסצנטי, Co-Translational ידי מחשוף (CoTrAC), לתמונת הייצור של מולקולות חלבון בתאים חיים עם דיוק מולקולה בודדה ללא perturbing הפונקציונלי של החלבון. שיטה זו נמצאת בשימוש אחרי דינמיקת הביטוי האקראית של גורם שעתוק, λ repressor CI<sup&gt; 1</sup&gt;.

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

מטרת הליך זה היא לרכוש תמונות פלואורסצנטיות בזמן-lapse של מושבות אי קולי גדלות, המבטאות מבני מסלול משותף כדי לזהות את מספר מולקולות החלבון החדשות שיוצרו . זה מושג על ידי הכנת דגימה של תאים, קוקס המבטא חלבון מעניין המותך למדווח קורה פלואורסצנטי, ופרוטאז שמתפצל באופן ספציפי בין מדווח קורה לחלבון המבוקש. השלב השני הוא הכנת ג'ל של אריס בטמפרטורת התכה נמוכה העשוי ממדיה מינימלית M nine.לאחר מכן, מכינים כרית ג'ל AROS לשימוש עם תא דגימה מבוקר טמפרטורה. תאי האי קולי מונחים על הג'ל והתא מורכב. השלב האחרון הוא למקם את החדר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולצלם מספר מושבות תאים גדלות במרווחי זמן קבועים לאורך מספר דורות.פוטו-הלבנה חדשה של מולקולות דיווח TRE בכל מרווח של כל re בסופו של דבר משמשת לרכישת עקבות זמן של ייצור חלבון בתאי חיים עם מולקולה בודדת ורזולוציה של תא בודד. היתרון של טכניקה זו על פני מדדי תא בודד לשעבר באמצעות היתוך חלבון פלואורסצנטי הוא שניתן לעקוב אחר ייצור כל סרטן של מולקולות חלבון בהליך המולקולה הבודדת והתוצאה המשפיעה על תפקוד המולקולות. כדי להנדס את רצפי הכנסת המתח, קידוד רצף לוקליזציה של ממברנה, חלבון פלואורסצנטי המתבגר במהירות, ורצף זיהוי פרוטאז ומסוף למסגרת ובתוך מסגרת עם חלבון מעניין במקרה הספציפי הזה, גורם שעתוק או tf.בהליך זה נעשה שימוש במדווח ורידי TSR ממוקד הממברנה. הכתב

single-molecule-imaging-gene-regulation-vivo-using-cotranslational

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

RNA פולימראז II קינטיקה תעתיק נמדדים על גנים ספציפיים בתאים חיים. mRNAs עיבד מן הגן של עניין מתויגים fluorescently באמצעות שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) ב קינטיקה vivo של התארכות תעתיק מתקבלים.

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה optogenetic כדי לווסת מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK) פעילות במהלך התמיינות תאים והתפתחות עובריים Xenopus . שיטה זו מאפשרת הפעלה הפיכה של המסלול איתות MAPK בתרבית תאים יונקים ועל אורגניזמים חיים תאיים, כמו עוברי Xenopus , עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

כאן נתאר הפרוטוקול הסטנדרטי איתור פעילות β-galactosidase מוקדם העכבר כל העוברים ואת שיטת העבודה פרפין חלוקתה ולא counterstaining. . זה הליך קלה ומהירה כדי לפקח על ביטוי גנים במהלך פיתוח שניתן להחילם גם על מקטעים של רקמות, איברים או תאים בתרבית.

עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים

רגולציה של הסביבה כרומטין הוא תהליך חיוני הדרוש עבור ביטוי נאות גנים. כאן, אנו מתארים שיטה לפיקוח על ביטוי גנים דרך הגיוס של שינוי כרומטין מכונות באופן ספציפי ג'ין הפיך.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי ליצור מערכת מודל שבו שעתוק של גנים אנדוגני עניין יכול להיות מותנה נשלט בעלי חיים או תאים באמצעות מדכא. שבולם משופרת lac ו/או מערכות activator ט .

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

כרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה להבנת המנגנונים המולקולריים של רגולציה גנטית. עם זאת, השיטה כרוכה בקשיים בהשגת פיצול כרומטין באמצעות הטיה מכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול משופר לצורך שיטת שבבים באמצעות עיכול אנזימטי.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

מעקב אחר אירועי תרגום בודדים מאפשר מחקרים קינטיים ברזולוציה גבוהה של מנגנוני תרגום תלויי כובע. כאן אנו מדגימים מבחנה במבחנה של מולקולה אחת המבוססת על אינטראקציות הדמיה בין נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לפפטידים המתהווים המתויגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולה אחת של קינטיקה של חניכה והתארכות פפטיד במהלך תרגום פעיל תלוי כובע במבחנה.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

מחקר זה מתאר שיטה לניסויים בתפוקה גבוהה באמצעות מערך LED מודפס בתלת מימד כדי לייעל את ביטוי הגנים המושרה באור בתאי HEK293T.

אופטימיזציה מהירה של מערכת השראת אור לשליטה בביטוי גנים של יונקים

למד את שיטת CoTrAC להדמיית ייצור חלבונים בתאי E. coli חיים ברזולוציית מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. השיטה מאפשרת מעקב אחר דינמיקת גורמי שעתוק ללא הפרעה לתפקוד החלבון.

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית

גלה סרטונים נוספים