הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית בחי שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

מטרת הליך זה היא לרכוש תמונות פלואורסצנטיות בזמן-lapse של מושבות אי קולי גדלות, המבטאות מבני מסלול משותף כדי לזהות את מספר מולקולות החלבון החדשות שיוצרו . זה מושג על ידי הכנת דגימה של תאים, קוקס המבטא חלבון מעניין המותך למדווח קורה פלואורסצנטי, ופרוטאז שמתפצל באופן ספציפי בין מדווח קורה לחלבון המבוקש. השלב השני הוא הכנת ג'ל של אריס בטמפרטורת התכה נמוכה העשוי ממדיה מינימלית M nine.

לאחר מכן, מכינים כרית ג'ל AROS לשימוש עם תא דגימה מבוקר טמפרטורה. תאי האי קולי מונחים על הג'ל והתא מורכב. השלב האחרון הוא למקם את החדר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולצלם מספר מושבות תאים גדלות במרווחי זמן קבועים לאורך מספר דורות.

פוטו-הלבנה חדשה של מולקולות דיווח TRE בכל מרווח של כל re בסופו של דבר משמשת לרכישת עקבות זמן של ייצור חלבון בתאי חיים עם מולקולה בודדת ורזולוציה של תא בודד. היתרון של טכניקה זו על פני מדדי תא בודד לשעבר באמצעות היתוך חלבון פלואורסצנטי הוא שניתן לעקוב אחר ייצור כל סרטן של מולקולות חלבון בהליך המולקולה הבודדת והתוצאה המשפיעה על תפקוד המולקולות. כדי להנדס את רצפי הכנסת המתח, קידוד רצף לוקליזציה של ממברנה, חלבון פלואורסצנטי המתבגר במהירות, ורצף זיהוי פרוטאז ומסוף למסגרת ובתוך מסגרת עם חלבון מעניין במקרה הספציפי הזה, גורם שעתוק או tf.

בהליך זה נעשה שימוש במדווח ורידי TSR ממוקד הממברנה. הכתב התמזג לרצף זיהוי הפרוטאז יוביקוויטין כדי לספור את מספר החיידקים המבוטאים פאג' למבדה מדכא, מולקולות חלבון C one. לאחר שילוב המבנה בכרומוזום אי קולי, קידוד הפלסמיד של פרוטאז ספציפי לרצף הזיהוי הופך לזן המבטא את המדווח הפלואורסצנטי והחלבון המעניין בהיתוך תרגומי.

בפרוטוקול זה, הפרוטאז יוביקוויטין קרבוקסי הידרו אחד, שנבקע מיד לאחר השימוש בשאריות היוביקוויטין הסופיות C. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, בחר מושבת אי קולי אחת מצלחת אגר מפוספסת טרייה למיליליטר M 9 אחד, מדיום מינימלי בתוספת חומצות אמינו בינוניות חיוניות מינימליות ואנטיביוטיקה מתאימה. דגירה של שייקר בטמפרטורה הרצויה מספיק זמן כדי להגיע לצפיפות אופטית של 600 ננומטר או OD 600 גדול מ-1.0.

לאחר מכן יש לדלל את התרבית למיליליטר אחד של מדיום M 9 טרי עם אנטיביוטיקה מתאימה ל-OD 600 של 0.02. דגירה של שייקר בטמפרטורה המתאימה, ניתן להגדיל את צפיפות התאים הראשונית במידת הצורך לצמיחה בטמפרטורה נמוכה. כאשר ה-OD 600 שווה ל-0.2 עד 0.3, התחל להכין את כרית הג'ל של ARO על ידי שקילת 10 עד 20 מיליגרם של ארוס בטמפרטורת התכה נמוכה לתוך צינור מיקרו של 1.5 מיליליטר.

הוסף את הנפח המתאים M תשע, מדיום מינימלי ללא אנטיביוטיקה כדי ליצור תמיסה של 3%. לאחר מכן מחממים את התמיסה שנוצרה למשך 30 דקות בחום של 70 מעלות צלזיוס להמסה. הפוך את הצינור כדי להבטיח שהתמיסה נמסה לחלוטין והומוגנית.

להרכבת כרית ג'ל, יש לשטוף כיסוי אחת מנוקה מראש ומיקרו אמת מים אחת להחליק במים סטריליים. יבש את זכוכית הכיסוי והחלק על ידי נשיפה באוויר דחוס. הנח את אטם הגומי על מגלשת המיקרו אמת המים כך שתכסה את הכניסות והיציאות.

בצד הזכוכית של השקופית, מרחו 50 מיקרוליטר של תמיסת ARO על מרכז אמת המיקרו. החלק למעלה את תמיסת ה-ARO עם זכוכית הכיסוי היבש המנקה. תן לתמיסת האגרו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

כאשר התאים מגיעים ל-OD 600 של 0.3 עד 0.4, הם מוכנים להדמיה. העבירו מיליליטר אחד של תרבית מודגרת לצנטריפוגה של צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ב-10,000 פעמים G למשך דקה אחת במיקרו צנטריפוגה שולחנית. לאחר השלכת חומר הסאפ, הוסף מיליליטר אחד של מדיום M תשע טרי והחייאה.

השעו את הגלולה צנטריפוגה בעדינות את המתלה שוב ב-10,000 פעמים G למשך דקה אחת. לאחר מכן חזור על שלב הצנטריפוגה של הרסוס פעם נוספת, השהה בעדינות את הגלולה במיליליטר אחד של M תשע מדיום. בשלב זה, ניתן להשתמש בתאים להדמיית מיקרוסקופ או לדלל פי 10 עד 100 כדי להבטיח צפיפות תאים נמוכה להדמיית זמן-lapse.

להכנת דגימה להדמיה, קלף בזהירות את הכיסוי מהחלק העליון של כרית הג'ל. הוסף מיקרוליטר אחד של תרבית תאים שטופים לחלק העליון של כרית הג'ל. המתן כשתי דקות עד שהתרבית תיספג על ידי כרית הג'ל.

חשוב לא לחכות כל כך הרבה זמן עד שכרית הג'ל תתייבש. הזמן האידיאלי ישתנה בהתאם לטמפרטורה וללחות בזמן ההמתנה לייבוש. כיסוי נוספת שנוקה מראש.

לאחר ייבוש הדגימה, כסו את הדגימה בזכוכית הכיסוי החדשה וודא שזכוכית הכיסוי ושקופית המיקרו אמת המים מיושרות היטב. הרכיבו את תא הגידול מבוקר הטמפרטורה בהתאם להוראות היצרן. כעת ניתן להשתמש בו להדמיה במיקרוסקופ.

כדי להתחיל בהדמיה, הפעל את הלייזר והמיקרוסקופ בהתאם להוראות היצרן. נעל את החדר המורכב לתוספת הבמה במיקרוסקופ. הגדר את הטמפרטורה של תא הגידול ותנור המטרה על 37 מעלות צלזיוס או טמפרטורת גידול רצויה אחרת.

אם הדמיה מעל טמפרטורת החדר, המיקוד או ריפוד הג'ל בדרך כלל ייסחפו באופן משמעותי במשך כ-15 דקות לאחר שינוי הטמפרטורה הראשוני. בפועל. השתמש בזמן זה כדי למצוא אזורי עניין ולשנות קבצי Script של הדמיה לפי הצורך.

לניסוי. התאם את עוצמת עירור הלייזר כך שכמעט כל המולקולות הפלואורסצנטיות יעברו אקונומיקה בתוך שש חשיפות. מצא תאים במיקרוסקופ ורכז אותם באזור הדמיה מוגדר ומיושר מראש.

לאחר מכן אחסן את המיקום של כל תא ניתן לדמות יותר מתא אחד בכל תמונה. חלון זמן לרכישה להדמיית זמן-lapse לאורך דורות רבים מבטיח שתאי תמונה מופרדים בתחילה מתאים אחרים, אך לפחות כמה מאות מיקרונים כך שמושבות אחרות לא ייכנסו לאזור ההדמיה במהלך הגדילה. באמצעות סקריפט הדמיה אוטומטי רכוש נתוני זמן-lapse באמצעות האלגוריתם המתואר בזרימת עבודה ניסיונית זו, שניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט הנלווה לסרטון זה.

תמונות אלה מציגות נתוני זמן-lapse טיפוסיים מניסוי מסלול קוד. תמונות ממושבה בודדת מוצגות במרווחים של 25 דקות. בניסוי זה, נתונים נרכשו כל חמש דקות מ-12 מושבות שונות.

תמונות אלה מייצגות תמונות שדה בהיר ותמונות פלואורסצנטיות של נוגה YFP עם הרקע הממוצע מופחת כדי לקחת בחשבון את השינוי ברקע של שדה ההדמיה כולו. עם הזמן, כאשר התמונות מונחות על גביהן, הן חושפות את לוקליזציה של מולקולות מדווחות UB ורידיות TSR ואת ההטרוגניות במספר המולקולות המיוצרות בחלונות זמן של חמש דקות בתאים שונים. מוצגים כאן נתונים טיפוסיים מנקודת זמן אחת בניסוי מסלול קוד, מוצגות תמונות פלואורסצנטיות ורידיות של שש חשיפות של 100 אלפיות השנייה שנרכשו בתחילת כל מרווח זמן של חמש דקות.

כל אחת משש החשיפות הופרדה ב-900 אלפיות השנייה כדי לאפשר זמן למולקולות ורידיות כהות חולפות שמצמצו להפוך לפלואורסצנטיות לניתוח. תמונה שש מופחתת מהתמונה הראשונה כדי לתקן מולקולות לא מולבנות ואוטופלואורסצנטיות. כתמי הרקע בתמונה זו ממוקמים לשושלות תאים ספציפיות ומכומתים על ידי עוצמת הקרינה המשולבת שלהם.

הקרינה המשולבת הממוצעת של המושבה משורטטת על פני שש תמונות המתאימות לקו זה לדעיכה מעריכית. בנוסף, היסט קבוע נותן מחצית דעיכה של שנייה אחת בערך. בניסוי זה, מולקולות ורידיות עוברות פוטו-אקונומיקה הרבה יותר מהר מאשר אוטו-פלואורסצנטיות תאית.

לכן, כמחצית מהמספר הכולל של מולקולות ורידיות מולבנות בפוטו בכל פריים. עבור הליך זה, ניתן לבצע ניתוח הדמיית מוליכות בדרכים אחרות כדי ליצור טריקים של מספר מולקולות החלבון המיוצרות בתאים בודדים.