Name: חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב- דרוזופילה ביציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: למד הדמיה חיה של חלבוני GFP בביציות Drosophila באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת חלבונים בתאים חיים וחקר תהליכים תאיים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק GM096076 מתכנית AREA-NIH.

1. הכנת זבובים לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם זבובים בריאים של גנוטיפ הרצוי (לדוגמה, מבטא חלבון ה-GFP שכותרת-) שהם פחות משבוע ישן. בחר 10-15 נקבות גדולות עם בטן בצבע שמנת מעוגלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הזבובים הנבחרים וכמה (3-5) זכרים לבקבוקון המכיל מזון קל yeasted חדש ולאפשר את הזבובים להשמין במשך ימים ב 25 ° C. עיין וייל ואח&#39;. 6 לפרטים של הכנת דרוזופילה. פיטום הזבובים מבטיחים כי מגוון שלבים, במיוחד שלבים 8-12, יהיה זמין להדמיה. פטם גרוע או unfattened טס בדרך כלל מכיל רק שלבים מוקדמים מאוד (1-6) ו( שלב 14) ביציות בשלות. </li></ol> 2. הכנה של ביציות לדימות באמצעות מיקרוסקופ מתחם זקוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופית זכוכית רגילה ידי הדבקת 2 coverslips לשקופית, מלבד כ 1 סנטימטר, באמצעות greas סיליקוןדואר. השתמש רק בגריז מספיק כדי להבטיח איטום טוב בין coverslip והשקופיות. לחיצה כלפי מטה בחוזקה בכל coverslip תתפשט הגריז דק ואחיד. הוסף מעט שמן halocarbon 27 (Sigma) לצומת בין coverslips והשקופיות. הם ישמשו כמפרידים כדי למנוע פציעת ביציות מבודדות בשלבים הבאים. המספר 1.5 coverslips עובד היטב, עם עובי ממוצע (0.16-0.18 מ&quot;מ) שתואם לזה של ביציות בשלב מאוחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2-3 טיפין של שמן halocarbon 27 על פני השטח של 2 מ&quot;מ coverslip 22. כדי לקבל את הביציות הבריאות ביותר האפשריות, נשי פרטית יוסר מבקבוקון המזון באמצעות pipetting פה והונח בעדינות לתוך שמן halocarbon בלי ההרדמה ראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחי מנתחים חדים (כגון דומון # 5), להצמיד את הזבוב נגד coverslip ולמשוך את קצה הבטן. הסר את השחלות על ידי גרירתם על פני השטח של coverslip, תחת השמן. זו תקדם adhesion של הביציות לcoverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להקניט מלבד שחלות, מחפש ביציות כי הם לפחות 10B השלב oogenesis. ביציות בשלב זה ניתן לזהות על ידי מחפש תאי ביצה שבביצית מעסיקה לפחות 50-60% מהנפח הכולל של תא הביצה. בנקודה זו בoogenesis, את תאי הזקיק המונחים על הביצית הפכו עמודים, ומקיפים את הביצית מכל צדדיו, פרט לאזור קטן שבו חיבורים לתאי האחות יישארו. השתמש במלקחיים כדי להסיר ביציות בודדות מנדן ovariole. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך, באמצעות 1-3 נקבות, עד 5-8 ביציות שלא נפגעו היו מבודדות על coverslip. הסר את כל רקמת unuseable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות להפוך coverslip המכיל את הביציות לשקופית המוכנה מראש כדי שהביציות מוצבות בין שני מפרידים. אל תלחץ על coverslip ההפוך כמו שיפגע בביציות. במידת צורך, להוסיף כמות קטנה של שמן לhalocarbon tהוא הקצוות של &quot;הכריך&quot; כדי להבטיח את המקום מלאים. (אופציונלי:. בוא שקופית מנוחה לכמה דקות כדי לאפשר ליישוב של coverslip) השקופיות מוכנות כעת להדמיה. </li></ol> 3. הכנה של ביציות לדימות באמצעות מיקרוסקופ מתחם הפוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביציות הם נתחו למעשה כאמורים בסעיף 2, פרט לכך שצלחות פטרי הקטנות עם הוספת תחתית זכוכית (מאטק, 35 מ&quot;מ) משמשות במקום coverslips. מיותר כדי לכסות את הדגימה, ולאחר נתיחה, רקמה יכולה להיות צלמה ישירות בכלים, אבל יש להקפיד על מנת להבטיח את הביציות תישארנה מכוסית בשמן ואסור להתייבש. </li></ol> 4. חי הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא את הביצית אל מוקד באמצעות דסק&quot;ש או אופטיקה לעומת שלב ולבחון את הביצית לכל סימן של ניזק, כגון דליפה בציטופלסמה, או בולט של תאי זקיק. ביציות רק תמונה שמוצגות בריאים ולא ניזוקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streaמינג ניתן לפקח באופן ישיר, ללא צורך בתיוג GFP, מאז שלפוחית ​​חלמון בציטופלסמה היא autofluorescent 7. אות זה יכול להיות שנתפסה בטווח של FITC ההיקף אך סביר להניח כי צורך בהגדרות רווח גבוהות יותר מאלה המשמשים לחלבוני ה-GFP שכותרת-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את התמונות הטובות ביותר של הזרמה מתקבלות מחלקים אופטיים שמתחת לפני השטח של הביצית שמונחת על זכוכית זכוכית coverslip / פטרי. הנה הביצית היא שטוחה מעט, מה שהופך למטוס טוב יותר מפוקוס. תמונות יכולות להיות שנתפסו ב200X - 1000 X. באמצעות ההסדר שתואר כאן, מטרות אוויריות צריכות לשמש, מאחר coverslip יוצר מחסום בין הביצית והאובייקטיבית. זה אופטימלי כי זה מאוד מצמצם סחף ותנועה של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאזור של עניין הוא בפוקוס, כבה את אופטיקה brighfield ולעבור להדמית confocal. השימוש בפונקציית הסריקה / תצוגה מקדימה המהירה של התוכנה, להתאים להתמקד ולהשיגבמידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות עבור לכידה תשתנינה ממיקרוסקופ למיקרוסקופ, אבל פרמטרים כלליים הם כדלקמן: השתמשו באורך גל עירור של 488 ננומטר ~ וגל פליטה של ​​~ 515 ננומטר. הגדר את ציר Z-לכידה כך שציר Z-נשאר קבוע, בפיגור של 10 שניות בין מסגרות. לכידת רצף מבחן המסגרות 5-10 כדי להבטיח הביצית היא נייחת והמטוס של מוקד הוא מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף זמן פקיעה טיפוסי יהיה ללכוד בין 20-50 מסגרות, וניתן לסקור באופן מיידי לאחר השלים להעריך את איכות וידאו. התהליך ניתן לחזור לתאים אחרים בשקופית, או נקבות נוספות ניתן גזור לפי צורך. </li></ol> 5. פתרון בעיות ומשותפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיסחף - בעת שימוש במיקרוסקופ זקוף, תאים יכולים לעתים להיסחף בשל התפשטות של נפט. זו ניתן למזער באמצעות מספיק שמן רק כדי לכסות את השטח שמתחת לcoverslip. אם בעיות נמשכות, השתמש גרם סיליקון פחותrease למפרידים מדביקים על השקופית. </li></ol> הערה: חלק מחבילות תוכנת confocal לאפשר מעקב תא, אך באופן כללי, עדיף לזנוח את ההדמיה של ביציות נסחפו ובמקום להשתמש בפריט נוסף. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין סימנים של זרימה - אם ההזרמה לא ברורה, סביר להניח בשל אחת משתי סיבות: או שמישור המיקוד ללכידת תמונה הם לא נכונים (בדרך כלל עמוק מדי לתוך הפנים של הביצית) או הביצית פגומה. זמן ותרגול יכולים למזער שתי טעויות. </li></ol>

<ol><li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li>
<li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shining+light+on+Drosophila+oogenesis%3A+Live+imaging+of+egg+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Gen.+Dev%22%5BJournal%5D)">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li>
<li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+RC+%22Ovarian+development+Drosophila+melanogaster%22">Ovarian development Drosophila melanogaster</a>. , Academic Press. New York. (1970).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).</li>
<li>Serbus, L. R., Cha, B. -J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679(2012).</li>
<li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Röper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li>
<li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+the+ER+and+Exu%3A+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li>
<li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27s+Arch.%2C+Devl.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li>
<li>ImageJ [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html</a> (2013).</li>
</ol>

אין לי מה לחשוף.

ביציות תסיסנית הן מערכת מודל תכליתית לטיפול במגוון רחב של שאלות הקשורות לתפקיד ולארגון של תאים ורכיבי subcellular. הבנה מלאה של תפקוד חלבון דורשת ניטור של שני היבטי מרחב ובזמן של התנהגות חלבון. התקדמות בשתי מערכות הדמיה ואת הכלים העומדים לרשות Drosophilists הגנטיים מאפשר למעבדות קטנות אפילו לבצע ניסויי הדמיה באיכות גבוהה בביציות חיים. כאן אני מתאר פרוטוקול כדי לנתח את ההתנהגות של חלבונים ומבנים GFP מתויגים או autofluorescent במהלך אמצע ל- oogenesis מאוחר שיכול לשמש בשילוב עם מגוון רחב של רקע גנטי כדי לחקור תפקוד חלבון. בפרוטוקול זה אני מתאר את התהליך שבו ביציות מוכנות להדמיה ואת הגדרות confocal הבסיסיות שתאפשרנה רכישת זמן לשגות וידאו של חלבונים ומבני ניאון. detai נוסףls על הכנת ביצית מתוארים על ידי וייל ואח&#39;. 6 מגוון רחב של זני זבובים מבטאים חלבונים שתויגו endogenously דרך אקסון לוכדים זמינים 8, ואין ספור גרסות חלבון יכולות להיות מהונדסות והחזירו לזבובים. בעבודה עם רקמת חיה, בריאות מהדגימות היא בעלת חשיבות עליונה. תאי ביצית מ10B הבמה יכולים להשלים oogenesis באופנת מהות אוטונומית 11, מה שהופך אותם אידיאליים למחקרי הדמיה לטווח קצרים. יש להקפיד בכמה שלבים עיקריים כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה. במהלך נתיחה חשובה לתמרן שחלות וביציות קטנים ככל האפשר, וכדי למזער את כמות הזמן בין נתיחה וההשלמה של הדמיה. באופן אידיאלי, תחנת נתיחה קטנה צריכה להיות ממוקמת באותו החדר שבו שוכן היקף confocal, ורק כמה תאי ביצה בכל פעם צריכים להיות צלם. המספר מומלץ כאן (5-8) מבטיח שזמן הנתיחה ממוזער תוך מיקסום הסבירות לקבלת תמונות באיכות טובה. אני ממליץ לכידת סדרה קצרה של תמונות כדי להעריך את איכות תמונה ולאשר כי ללכוד הגדרות מותאמות, לפני צילום רצף זמן פקיעה ארוך יותר. רוב התוכנות מאפשרות מסגרות בודדות כדי להינצל, והתמונות הללו אז יכולות להיות מנותחות במגוון דרכים באמצעות 12 ImageJ או תוכנה אחרת.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שמן Halocarbon 27 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> H8773-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> # 5SF מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11252-00 </td><td></td></tr><tr><td> גריז הסיליקון </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> Z273554-1EA </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי עם תחתית מהזכוכית </td><td> מאטק </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr></tbody></table>

חי הדמיה של חלבוני ה-gfp שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

ביצית דרוזופילה הוקמה כמערכת תכליתית לחקירת שאלות בסיסיות כגון פונקצית cytoskeletal, ארגון תא, ומבנה אברון ותפקודו. הזמינות של חלבונים שונים GFP מתויג-אומרת שתהליכים תאיים רבים יכולים להיות במעקב בתאים חיים במשך דקות או שעות, ושימוש בטכניקה זו, תהליכים כגון RNP תחבורה, המורפוגנזה אפיתל, ושיפוץ רקמה כבר תארו בפירוט רב ב1,2 תסיסנית ביציות. היכולת לבצע הדמית וידאו בשילוב עם רפרטואר עשיר של מוטציות מאפשרת מגוון עצום של גנים ותהליכים שיש לבחון בפירוט מדהים. דוגמה אחת כזו היא התהליך של הזרמת ooplasmic, אשר יוזם ב3,4 אמצע oogenesis. תנועה נמרצת זו של שלפוחית ​​cytoplasmic היא microtubule ו5 kinesin תלוי ומספקת sys שימושיTEM לחקירת תפקוד cytoskeleton בשלבים האלה. כאן אני מציג את פרוטוקול לזמן לשגות הדמיה של ביציות חיים באמצעות כמעט כל התקנת מיקרוסקופיה confocal.

הדמיה של חלבוני ה-GFP שכותרת-תשתנה בהתאם לכמה חזק החלבון מתויג מתבטא. ביצית אמצע במה להביע reticulon דמוי 1 (Rtnl-1), אקסון מתויג עם GFP 8,9 מייצרת איתות חזקה. Rtnl-1 מופיע לשיתוף לוקליזציה עם microtubules הנוכח במהלך הזרמת ooplasmic 10 (איור 1 א &#39;) הארוך. Rtnl-1 הוא סמן טוב להתבוננות הזרמה, וגם חיווי של ארגון microtubule בביציות בשלב מאוחרות. הזרמת Ooplasmic בתא ביצת wildtype ניכרה כתנועה מורגשת של שלפוחית ​​החלמון autofluorescent בעת שימוש בשיעור לכידה של פריים אחד בכל 10 (תרשים 1B) שניות. היטל מקסימאלי של חמש מסגרות יכול להיות שנוצר כדי לסמן את הנתיב של שלפוחית ​​מרגשת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" /> איור 1. חי הדמיה של שניהם autofluorescent וGFP-tagged מבנים.) תמונת זמן לשגות אחת של 11 ביצית במה להביע Rtnl1-GFP ב400x. סיבי Rtnl1-GFP לנוע בתנועה גלית בביציות זרימה. B) 5 היטל מרבי מסגרת של תא ביצת 10B שלב שבו שלפוחית ​​החלמון autofluorescent הייתה צלם כל 10 שניות לסך 50 שניות, בהגדלה של 400x. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent באדם<em&gt; דרוזופילה</emביציות&gt; מתוארות.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

בפרוטוקול זה, תאים המבטאים חלבונים המסומנים ב-GFP מבודדים מנקבות דרוזופיליה ומצולמים כדי ללמוד על תנועת החלבון בתאים חיים. ראשית, הכינו תא צפייה על ידי הצמדת שתי זכוכית כיסוי לסמידה באמצעות גריז סיליקון ליצירת תעלה. דפנות התעלה מצופים בשמן הלוקארבון.בשלב הבא, נתחו את השחלאות מנקבה לתוך טיפה של halo carbon oil על זכוכית כיסוי. לאחר מכן, בודדו את התאים הבודדים והפכו את זכוכית הכיסוי מעל התעלה בפסייד המוכנה כדי ליצור תא צפייה. לאחר איתור התאים באמצעות אופטיקת שדה בהיר (brightfield) או DIC, צלמו תמונות דיגיטליות במרווחי זמן קבועים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנה נלווית.בסופו של דבר, ניתן להשתמש ברצף של תמונות בשיטת time-lapse כדי לעקוב אחר תנועת חלבונים או חלקיקים בתאים חיים לאורך זמן. שיטה זו יכולה לסייע בחקירת תחומים מרכזיים בביולוגיה של התא ובביולוגיה התפתחותית, כגון תעתוע של חלבונים ו-mRNA, וביסוס קוטביות של התא. ראשית, הרדימו זבובים בריאים בני פחות משבוע ובחרו 10 עד 15 נקבות גדולות עם בטנים עגולות בצבע קרם.העבירו את הזבובים שנבחרו ומספר זכרים למבחנה המכילה מזון חדש עם כמות קטנה של שמרים. לאחר מכן, דגרו את הזבובים למשך יומיים בטמפרטורה של 25 degrees Celsius כדי להשמין אותם. השמנת הזבובים מבטיחה שיהיו זמינים שלבים מגוונים, ובמיוחד שלבים 8 עד 12, לצורך דימוג; זבובים שאינם שמינים או שאינם שמינים מספיק מכילים בדרך כלל רק שלבים מוקדמים מאוד ותאים בוגרים. השתמשו בגריז סיליקון.הדביקו שתי זכוכית כיסוי במרחק של כסנטימטר אחת מהשנייה על גבי סרטית זכוכית סטנדרטית. השתמשו בכמות גריז מספיקה רק כדי להבטיח אטימה טובה בין זכוכית הכיסוי לסרטית. לחצו בחוזקה על כל זכוכית כיסוי כדי לפרוס את הגריז בשכבה דקה ואחידה.לאחר מכן, הוסיפו מעט שמן פחמן (carbon oil 27) לחיבור שבין כיסוי הזכוכית לפסנית כדי למנוע פגיעה בתאים המבודדים בשלבים הבאים. כעת, טפטפו שתי עד שלוש טיפות של שמן פחמן (carbon oil 27) על פניו של כיסוי זכוכית בגודל 22 מילימטרים רבועים. לאחר מכן, שאבו באמצעות פיפטה מהפה נקבה בודדת מבקבוקון המזון והניחו אותה בעדינות לתוך שמן הפחמן.בעזרת פינצטת דיסקציה חדה, קבעו את הזבוב אל הזזית (cover slip) ומשכו החוצה את קצה הבטן. הסירו את השחלה על ידי גרירתה לאורך פני השזזית תחת השמן כדי לעודד היצמדות של התאים (cytes) לשזזית. כעת, הפרדו בעדינות את השחלה תוך חיפוש תאים הנמצאים לפחות בשלב 10 B של תהליך הבשלת הביצית (Oogenesis).זהו את התאיביות בשלב זה על ידי חיפוש תאי ביצה שבהם התאיביה תופסת לפחות 50% עד 60% מהנפח הכולל של תא הביצה. בעזרת פינצטה, הוצאו תאיביות בודדות ממעטפת השחלה תוך שימוש באחת עד שלוש נקבות.המשיכו לבודד חמישה עד שמונה ציותים (oocytes) שאינם פגומים על לוכסן הכיסוי. לאחר מכן, הסירו כל רקמה שאינה ניתנת לשימוש. הפכו בזהירות את לוכסן הכיסוי המכיל את הציותים על השקופית שהוכנה מראש, כך שהציותים ימוקמו בין שני המרווחים (Spacers).וזכרו, אין ללחוץ על זכוכית הכיסוי שכן הדבר עלול לפגוע בתאים. במידת הצורך, הוסיפו כמות קטנה של שמן הלוקרובון לקצוות ה"סנדוויץ'" כדי להבטיח שהחלל מלא. שימו לב שבשלב זה של האובגנזה, תאי הזקיק המכסים את התא הביצית הפכו לקובייה ומקיפים את התא הביצית מכל הצדדים, למעט אזור קטן שבו נותרות חיבורים לתאי המטפלת. התמקדו בתא ביצית אחד באמצעות אופטיקת DIC או ניגודיות פאזה.בחנו את התבצית (oocyte) לאיתור סימני נזק, כגון דליפה של ציטופלזמה או בליטה של תאי הזקיק. צלמו רק את התבציות הנראות בריאות וללא נזק. כדי לנטר זרימה (streaming) באופן ישיר ללא סימון GFP.הגדירו לכידת תמונות בטווח ה-ZI של המיקרוסקופ עם הגדרות הגבר (gain) גבוהות יותר מאלו המשמשות עבור חלבונים המסומנים ב-GFP. השתמשו בעדשות אוויר כדי למזער משמעותית סחיפה ותנועה של הדגימה. השגיאו חתכים אופטיים ממש מתחת לפני השטח של התא ביצית (oocyte).ברגע שאתר העניין נמצא במיקוד, כבה את אופטיקת השדה המואר (brightfield) ועבור לדמיון קונפוקאלי באמצעות פונקציית תצוגה מקדימה של סריקה מהירה בתוכנה, וכוונן את המיקוד וההגבר (gain) לפי הצורך. כמו כן, הגדר את הפרמטרים עבור העירור, אורך הגל ואורך גל הפליטה. עבור לכידה בציר Z, בחר ציר Z קבוע עם השהייה של 10 seconds בין הפרמים.לאחר לכידה של רצף time lapse טיפוסי של בין 20 ל-50 פריימים, יש לבחון ולהעריך באופן מיידי את איכות הווידאו. תמונת time lapse בודדת זו מציגה ציטה (oocyte) בשלב 11. ציטה זו, המבטאת את החלבון R TNL one המסומן ב-GFP, יכולה להפיק אות חזק.נראה כי R TNL one נמצא במיקום משותף עם המיקרוטובוליים הארוכים הנוכחים במהלך זרימה ציטופלזמית של ה-op. בדרך כלל, זרימה ציטופלזמית של op בתא ביצה מסוג פראי ניכרת כתנועה מורגשת של שלפוחיות autofluorescent ylk, כפי שמוצג בהקרנה מקסימלית של חמישה פריימים של תא ביצה בשלב 10 B. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה כיצד לבודד תאי cytes נקביים בריאים המבטאים חלבונים מתויגים ב-GFP, כיצד להכין דגימות לדימיג חי (live imaging), וכיצד להקליט סרטוני time lapse של חלבונים וחלקיקים פלואורסצנטיים.

live-imaging-of-gfp-labeled-proteins-in-drosophila-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבחון את ההגירה של ותאי גלייה לתוך העין תסיסנית מתפתחות באמצעות ניתוח מיקרוסקופי לחיות יחד עם התאים GFP גליה מתויג.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

מקור: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון מדגים טכניקת הדמיה חיה לחקר דפוסי עיניים בגולם Drosophila melanogaster. סמנים מתויגים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מאפשרים הדמיה של ארגון התאים והתמיינות במהלך היווצרות מבנה העין המתפתח.

הדמיה חיה של עין הגולם של דרוזופילה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

כאן אנו מתארים שיטה יעילה ללימוד דינמיקה של פינוי תאים...

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca 2+ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית.

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

למד הדמיה חיה של חלבוני GFP בביציות Drosophila באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת חלבונים בתאים חיים וחקר תהליכים תאיים בביולוגיה התפתחותית.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-

גלה סרטונים נוספים