Name: הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: חקור הדמיית סופר רזולוציה של חלבוני חלוקת תאים ב-E. coli באמצעות מיקרוסקופיית PALM. שיטה זו מאפשרת מיפוי מבני במדויק ננומטרי של טבעת FtsZ בחיידקים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

גרנט: 5RO1GM086447-02.

1. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תקשורת LB עם מושבה בודדה של זן JB281 [BW25113 / pJB042 (P אק: FtsZ-mEos2)]. לגדול בלילה שייקר על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את תרבות 1:1,000 לM9 + תקשורת מינימאליים [מלחי M9, גלוקוז 0.4%, 2 מ&quot;מ, 4 MgSO 0.1 המ&quot;מ CaCl 2, חומצות אמינו ויטמינים וממ] ותגדל לשלב יומן האמצע-(OD 600 = 0.2-0.3) בנוכחות chloramphenicol (150 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בטמפרטורת חדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לתרבות עם 20 מיקרומטר IPTG ל2 שעות (ראה הערת המס &#39;1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות גלולה בmicrocentrifuge (8,000 סל&quot;ד, דקות 1) וresuspend בנפח שווה של M9 +; חוזרת. לאחר resuspension השני, להמשיך את הצמיחה בRT עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התרבות מושרה עם paraformaldehyde 4% ב PBS (pH = 7.4) בRT עבור 40 דקות. תרבות גלולה וresuspend בנפח שווה של PBS; חוזר. אם תאים חיים הדמיה, דלג קיבעון, תרבות גלולה, וResuspend עם נפח שווהשל M9 - [מלחי M9, גלוקוז 0.4%, 2 המ&quot;מ 4 MgSO, 0.1 המ&quot;מ CaCl 2, חומצות אמינו ממ]; חוזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל חרוזי זהב 1:10 עם תרבות resuspended. החל מדגם לחדר הדמיה שהוכן (ראה שלב 2.4). </li></ol> הערה [1]: פרוטוקול האינדוקציה לעיל (1.1-1.3 צעדים) כבר מותאם למערכת הביטוי של זן JB281. תנאי אינדוקציה מפורטות עשויים להשתנות בהתאם למערכות אחרות ביטוי או חלבונים של עניין. 2. אסיפה של לשכת ההדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 3% (w / v) פתרון agarose בM9 -. ממס agarose על 70 מעלות צלזיוס בבלוק חום עליון ספסל עבור 40min. החנות נמסה agarose ב 50 מעלות צלזיוס למשך עד 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופית microaqueduct נקיה במחצית העליונה של חדר הדמיה עם אלקטרודות פונות מטה. יישר את האטם התחתון בשקופית microaqueduct כך שתכסה את ערוצי זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחול ~ 50 μl של agarose נמס למרכז הזכוכיתשקופית. מייד עליונת טיפת ג&#39;ל agarose עם coverslip נקי ויבש. אפשר ג&#39;ל לגיבושו RT למשך 30 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות coverslips: לארגן coverslips במכל קרמיקה וsonicate במשך 20 דקות בסיבוב אמבטיות של אצטון, אתנול ו1M KOH בצנצנות זכוכית. חזור על התרגיל שלוש פעמים במחזור, עבור סכום כולל של 9 sonications, ואחרי sonication יחיד בDH 2 O. אחסן את coverslips ניקה בד&quot;ה הטריה 2 O. לפני שימוש, לפוצץ coverslips היבש עם אוויר מסונן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את coverslip, עוזב כרית ג&#39;ל בשקופית microaqueduct. מייד להוסיף μl 1 מתוך מדגם תרבית תאים (ראה שלב 1.6) לראש כרית ג&#39;ל. חכה ~ 2 דקות, המאפשר פתרון לייקלט על ידי כרית ג&#39;ל. כרית ג&#39;ל למעלה עם coverslip חדש נקי ויבש. להרכיב את חדר ההדמיה השלמה בהתאם להוראות יצרן. </li></ol> 3. יבוא תמונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ, המצלמה ולייזרים. פתח MetaMorph רךהכלי (התקנים מולקולריים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מסנני עירור / פליטה מתאימים בדרך ההדמיה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סמכויות והגדרות ליזר רכישה בהתאם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 488-nm ליזר = 15 mW (ראה הערת המס &#39;2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 561-nm הליזר = 75 mW </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 405 ננומטר הליזר = 2 mW ± מסנן צפיפות ניטראלי (ראה הערת המס &#39;3) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נעילת תא הדמיה לבמה באמצעות מתאם השלב המשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעד אזור הדמיה מתאימה (100x100 פיקסלים), כי הוא האיר homogenously על ידי כל השלושה הלייזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את אזור מדגם המכיל שני תאים וסמני fiducial (חרוזי זהב) בסמיכות אך לא חופפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על פני השטח של תאים הקרובים ביותר לcoverslip. לרכוש תמונת brightfield עם זמנו 50 מילי אינטגרציה והעברת המוקד 0.5 מיקרומטר לתוך המדגם (איור 3Ai). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה פלואורסצנטי ירוקה הרכב עם עירור מ488-n<html> מ &#39;ליזר באמצעות זמן אינטגרצית ms 50 (איור 3Aii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש הזרמת וידאו במסלול אדום עם תאורה רציפה מ 405 ננומטר ולייזרים 561-nm. לתאים קבועים, שיעור 50 מילי מסגרת משמש עבור סכום כולל של 20,000 מסגרות (~ 17 דקות סך הכל) עם כוח הליזר 405 ננומטר ramped ידי ~ 10% כל 1,000 מסגרות (ראה הערת המס &#39;4). לתאים חיים, שיעור של 10 אלפיות מסגרת משמש עבור סכום כולל של 3,000 מסגרות (סה&quot;כ ~ 30 ים) בכוח ליזר מתמיד 405 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המיקוד בחזרה למשטח התחתון של התאים ולרכוש תמונה אחרת brightfield כמו בשלב 3.7. </li></ol> [2] הערה: העצמה המשולבת של הקרינה הירוקה של תא עומדת ביחס ישר למספר הכולל של mEos2 FtsZ מולקולות לידי ביטוי בתא. כוח העירור 488-ננומטר והגדרות רכישה פלואורסצנטי הרכב חייבים להישמר קבוע לכל התאים כך שיחסית FtsZ-mEos2 רמות ביטוי בתאים שונים ניתן להשוות. ontent &quot;&gt; [3] הערה:. תאים קבועים הם צלמו עם צפיפות הניטראלית (ND) המסנן (1 איור, רכיב אופטי # 5) במקום על מנת להשיג שיעור הפעלה איטי, כך שכל מולקולה בודדה ניתן לזהות במדויק מסנן ND מוסר כאשר הדמיה לחיות תאים להגביר את קצב ההפעלה, תוך שמירה על סבירות נמוכה של שתי מולקולות שהופעלה בו זמנית באזור עקיפה מוגבלת. הקצב המהיר להחיל הדמיה לחיות תאים נדרש כדי להקטין את זמן הרכישה הכולל, כך &quot;הקפאה&quot; Z-הטבעת בזמן ובכך מגביל את ההשפעה של ניזקי שמש לתא. [4] הערה: המספרים של מסגרות שנרכשו היו מותאמים למערכת שלנו ותלויים במבנה התאי המסוים, תיוג צפיפות, קצב הפעלה ואם למצות את כל המאגר של fluorophores חשובים לניתוח. בתאים חיים, חשוב לקבל מספר מספיק של מגויר בתקופה קצרה של TIככל האפשר כדי למנוע את הטשטוש של התמונה עקב תנועה של המבנה התאי. 4. בניית תמונת PALM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת מיקום של כל נקודה centroid זוהה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ערימת התמונה לתוך Matlab (MathWorks, Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את ערמת התמונה לאזור שסביב תא אחד שאינו כולל את כל חרוזי fiducial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סף עצמה לאיתור מקום שנמצא מעל רמת הרקע, אך מתחת לממוצע עוצמת המקום. אנו מהווים וריאציה ברמת רקע לאורך כל ניסוי על ידי החישוב הממוצע פועל עוצמתו המרבית באמצעות חלון מסגרת 150. סף העצמה לכל מסגרת ואז אינטרפולציה מהערכים הממוצעים הריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיסור הסף המתאים מכל מסגרת. כתמים פוטנציאליים מזוהים כשלושה פיקסלים סמוכים עם עוצמות מעל הסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת הקרינה של כל מקום פוטנציאלי לGaussia דו ממדיםפונקצית n [משוואת # 1] באמצעות אלגוריתם ריבועים לפחות קוי (איור 2). דיוק הלוקליזציה של כל נקודה מחושב לפי המספר הכולל של פוטונים שאותרו [המשוואה # 2]. כל נקודה גרועה כושר, עם דיוק לוקליזציה יותר מ 20 ננומטר (תאים קבועים) או 45 ננומטר (תאי חיים) נמחקה (ראה הערת המס &#39;5). כל נקודה בעצמה גדולה יותר מכפול מממוצע העצמה, אולי בשל emitters החופף, גם מושלכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים קבועים, להסיר תצפיות חוזרות ונשנות של אותה המולקולה על ידי התעלמות מכל נקודה שהיא בעמדת centroid 45 ננומטר מכל נקודה אחרת שקדמה לו על ידי 6 מסגרות או פחות. לתאי חיים, את כל הנקודות נשמרות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל להיסחף מדגם באמצעות תנועת הסמן fiducial. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזירת אזור פיקסל 10x10 סביב סמן fiducial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיסור הסף המתאים שנקבע ב4.1.3 מכל מסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתאים לפרופיל בכל העוצמתמסגרת באמצעות אלגוריתם מתאים לפחות בהנחה מרובע צורת גאוסי דו ממדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב תזוזה בין העמדות ביחס למסגרת 1 centroid. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את עמדת centroid של כל מולקולה ייחודית מזוהית עם 4.1 בסחף המדגם המתאים מחושב ב4.2. השווה את תמונות brightfield נרכשו ב3.7 ו 3.10. אם תאים הם נצפו לנוע זה ביחס לסמני fiducial, הנתונים נזרקים החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את כל עמדות centroid המתוקנות על תמונה אחת מורכבת מפיקסלים ננומטר 15X15. עלילה כל מולקולה ייחודית כיחידה באזור פרופיל, דו ממדי Gaussian המרוכז בעמדת centroid עם סטייה שווה לדיוק הלוקליזציה [המשוואה # 2] סטנדרטית. התוצאה היא מפת צפיפות הסתברות, שבו עוצמתו של פיקסל היא פרופורציונלית לסיכוי למצוא מולקולה שבפיקסל (איור 3Aiv). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השוואה בין תמונות PALM לתמונות הרכב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Replot centroתפקידים כאיד ב4.4, אבל במישור באמצעות 150X150 פיקסלים ננומטר וסטייה שווה ל 250 ננומטר סטנדרטית. זה יוצר תמונת PALM שמחקה תמונת התאבכות מוגבלת, אשר ניתן להשתמש כדי להשוות, תמונת ההרכב עקיף המוגבלת שנרכשה ב3.8 (האיור 3Aiii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר כי המולקולות שהתגלו הן נציג של כל האוכלוסייה, להשוות את תמונת ההרכב המשוחזרת (האיור 3Aiii, צעד 4.5.1) עם תמונת ההרכב הניסיונית פלואורסצנטי (איור 3Aii, צעד 3.8) כדי לאשר ששתי התמונות מראות מבנים של צורה דומה , התמצאות ועצמה יחסית. </li></ol></li></ol> [5] הערה: דיוק הלוקליזציה המינימאלית הנדרש נקבע באופן אמפירי לכל שיטת הדמיה ידי התוויית את precisions של כל המולקולות למדגם נתון ובחירת חיתוך מתאים. 5. ניתוח תמונת PALM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת Z-טבעת Widtח וקוטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב את תמונת PALM כדי להתמצא אנכי על ציר זמן של התא (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזירת האזור תאי המכיל את Z-הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את העצמה המצטברת באמצעות הקרנת פרופיל אינטנסיביות לאורך הציר הארוך של התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתאים לפרופיל העצמה להפצת גאוס. רוחב הטבעת מוגדר כמרבי מלאת רוחב המחצית (FWHM) של התפלגות גאוס המצוידת (איור 4 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרויקט פרופיל העצמה המצטברת של 5.1.2 לאורך הציר הקצר של התא. קוטר הטבעת מוגדר כאורך המלא של פרופיל העצמה (האיור 4C). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זומם צפיפות FtsZ (ראה הערה # 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Replot עמדות centroid כב( 4.4), אך ללא פרופיל כזה, כי כל מולקולה ייחודית ניתן ערך של 1 והוקצתה לפיקסל המתאים לעמדת centroid אחת גאוס. בדרך זו, את עוצמתו של כלפיקסל מייצג את המספר הכולל של מולקולות שהתגלו בפיקסל. תמונת PALM הצפיפות יכולה גם להיות דמיין כמו עלילת מתאר (האיור 5E). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת רזולוציה מרחבית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רזולוציה מרחבית תיאורטית-ברת השגה: ליצור נציג כוחות הביטחון פלסטיני לכל המדגם באמצעות דיוק הלוקליזציה הממוצעת הנחוש של כל המולקולות אותרו ולחשב FWHM (משוואת המס &#39;3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רזולוציה מרחבית הושגה-בניסוי: לחשב את התזוזה הממוצעת בין תצפיות חוזרות של אותה המולקולה. </li></ol></li></ol> [6] הערה: השתמשתי PALM השתקפות הפנימית המוחלט (TIR-PALM, איור 1 ו 5) כדי להגביל את ההפעלה והעירור לשכבה דקה (~ 200 ננומטר) מעל לממשק התא / זכוכית. כך שמולקולות FtsZ רק קשורים בקרום הקרוב ביותר לcoverslip תזוהינה.

<ol><li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li>
<li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li>
<li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+%28ftsZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li>
<li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li>
<li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings%2C+structural+homologs+of+tubulin+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li>
<li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+%28PALM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li>
<li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers%3A+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li>
<li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li>
<li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תמונות PALM מכילות מידע אודות ספירת מולקולה ועמדות בתוך תא, המאפשרים ניתוח מפורט של החלוקה והסידור של מולקולות חלבון המטרה שקשה להשיג באמצעים אחרים. להלן מתארים אמצעי זהירות שיש לנקוט כדי לחלץ מידע כמוני מדויק תוך שמירה על רלוונטיות הביולוגיות של תמונות PALM. אנחנו גם לחקור את המידע שניתן להשיג באמצעות תאי חיים טובים לעומת קבועים. לבסוף, אנו מציעים דרכים להשגת מידע רזולוצית סופר נוסף על מכונות חלוקת התא. השיטה שת...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 50 x MEM חומצות אמינו </td><td> סיגמא </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM ויטמינים </td><td> סיגמא </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td> אלקטרוני מדעי Micrsocopy </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG agarose </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 חרוזי זהב ננומטר </td><td> Microspheres-nanospheres </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 הדמיה קאמרית </td><td> BIOPTECHS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מתאם שלב </td><td> אסי </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ ההפוך </td><td> אולימפוס </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1.45 NA, מטרת 60x </td><td> אולימפוס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מצלמת iXon EMCCD </td><td> תידור טכנולוגיה </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm ספיר ליזר </td><td> קוהירנט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm ספיר ליזר </td><td> קוהירנט </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ליזר CUBE 405 ננומטר </td><td> קוהירנט </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

חלוקת תא חיידק דורשת הרכבה המתואמת של יותר מעשרה חלבונים חיוניים בmidcell 1,2. מרכזי לתהליך זה הוא ההיווצרות של suprastructure דמוי טבעת (Z-טבעת) על ידי חלבון FtsZ בתכנית חלוקת 3,4. Z-הטבעת מורכבת מprotofilaments FtsZ היחיד תקוע המרובים, וההבנה שההסדר של protofilaments בתוך Z-הטבעת תספק תובנה לתוך המנגנון של הרכבת Z-טבעת ותפקודו כמחולל כוח 5,6. מידע זה נותר חמקמק בשל מגבלות נוכחיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי במיקרוסקופ אלקטרונים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הקונבנציונלי אינו יכול לספק תמונה ברזולוציה גבוהה של Z-הטבעת בשל גבול השתברות אור (~ 200 ננומטר). אלקטרוני cryotomographic הדמיה זיהתה מפוזרת protofilaments FtsZ בג הקטן תאי crescentus 7, אבל קשה ליישם לתאים גדולים יותר כגוןחיידק או B. subtilis. כאן אנו מתארים את היישום של שיטת מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוצית סופר, מיקרוסקופי לוקליזציה Photoactivated (PALM), כדי לאפיין כמותית הארגון המבני של ה coli Z-טבעת 8. PALM הדמיה מציעה היא ברזולוציה מרחבית גבוהה (~ 35 ננומטר) וסימון ספציפי כדי לאפשר זיהוי חד משמעי של חלבוני היעד. אנחנו מתויגים FtsZ עם mEos2 photoactivatable ניאון החלבון, אשר עובר מהירוק פלואורסצנטי (עירור = 488 ננומטר) לאדום פלואורסצנטי (עירור = 561 ננומטר) עם הפעלה ב405 ננומטר 9. במהלך ניסוי PALM,-mEos2 FtsZ מולקולות בודדות מופעלות stochastically ועמדות centroid המקבילות המולקולות הבודדות נקבעות עם &lt;דיוק ננומטר 20. תמונה ברזולוצית סופר של Z-טבעת אז שוחזר על ידי superimposing את העמדות של כל centroid-mEos2 FtsZ המולקולות זוהו. &lt;כיתת p = &quot;jove_content&quot;&gt; שימוש בשיטה זו, מצאה כי Z-הטבעת יש רוחב קבוע של ~ 100 ננומטר והוא מורכב מצרור רופף של protofilaments FtsZ חופפים זה לזה בשלושה ממדים. נתונים אלה מספקים קרש קפיצה לחקירות נוספות של השינויים התלויים מחזור התא של Z-10 הטבעת ויכולים להיות מיושמים לחלבונים אחרים של עניין.

באיור 3Aiv הוא עיבוד דו ממדים, ברזולוצית הסופר של Z-הטבעת שנוצרה משיטת הדמית PALM שתוארה לעיל. להלן אבקש לסכם מידע איכותי וכמוני, שניתן להשיג אותם. איכותי, ראה שZ-הטבעת היא מבנה לא סדיר, המאמץ תצורות מרובות (להקה יחידה או קשת סליל) שאינן מובחנים בתמונות פלואורסצנציה קונבנציונליות (איור 3A-להשוות Dii וד). תצפיות כגון אלה יכולים לשמש כדי לקבוע אחוזים מאוכלוסיית התא שמציגה תצורה מבנ...

אנו מתארים רזולוצית סופר שיטת הדמיה כדי לבחון את המבנה הארגוני של FtsZ טבעת החיידקים, מנגנון חיוני לחלוקת תא. שיטה זו מבוססת על ניתוחים כמותיים של מיקרוסקופיה תמונות לוקליזציה photoactivated (PALM) ויכולה להיות מיושמת על חלבוני cytoskeletal חיידקים אחרים.

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג מידע מבני כמותי על חלבוני חלוקת תאי אי קולי בסביבתם הטבעית. זה מושג על ידי ביטוי חלבון היתוך פלואורסצנטי פוטו אקטיב בתאים חיים ושיתוק תאים אלה על כרית אקרו ג'ל. לאחר מכן התאים מצולמים באמצעות הזרמת וידאו.בעוד לייזרי עירור והפעלה מיושמים כדי להמחיש מיקומים של מולקולות בודדות, הסרטים המתקבלים מנותחים באופן חישובי כדי לחלץ את מיקומי המולקולות בדיוק ננומטרי ולהניח אותם כדי ליצור תמונה ברזולוציה סופר. לאחר מכן ניתן לנתח תמונה זו על ידי מגוון מדידות כמותיות המתארות את מבנה העניין, כולל מידותיו וצפיפות המולקולות. לוקליזציה המופעלת על ידי צילום, מיקרוסקופיה או כף יד היא טכניקת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה המיושמת בקלות.המכשור פשוט, אך נדרשת אופטימיזציה זהירה של רכישת נתונים וניתוח כדי לייצר תוצאות אמינות. שלב מכריע נוסף הוא מידת האפיון של חלבון ההיתוך ורמת הביטוי שלך כדי להבטיח שהתוצאות שלך רלוונטיות מבחינה ביולוגית. הפרוטוקול הבא עבר אופטימיזציה לחלבון FTSZ Muse Two ויש להתאים אותו לחלבון המעניין אותך.כדי להתחיל לחסן את ה-LB Media עם מושבה אחת של הזן המעניין המכילה חלבון דבוק פלואורסצנטי שהוכן כמתואר בפרוטוקול הכתוב. בליווי הסרטון הזה, גדלו לילה בשייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למחרת. יש לדלל את התרבית מ-1 עד 1000 ל-M תשע בתוספת מדיה מינימלית.גדל לשלב האמצע בנוכחות אנטיביוטיקה מתאימה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן גרם לתרבית לייצר חלבון עם 20 IPTG מיקרומולר למשך שעתיים. בינתיים, הרכיבו את תא ההדמיה על ידי יצירת תמיסה אגרו של 3% במדיה M תשע מינוס. ממיסים את האגרוס בחום של 70 מעלות צלזיוס בגוש חום ספסל למשך 40 דקות.אחסן את האגרוס המומס בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עד חמש שעות. הנח מגלשת מיקרו אמת מים נקייה בחצי העליון של תא ההדמיה כשהאלקטרודות פונות כלפי מטה. יישר את האטם התחתון על מגלשת המיקרו אמת המים כדי לכסות את תעלות הזילוף.מרחו כ -50 מיקרוליטר מהארוס המומס על מרכז הכוס. החלק מיד מעל טיפת הג'ל של Agros עם החלקת כיסוי נקייה ויבשה. הניחו לג'ל להתמצק בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות לאחר השראת החלבון.גלולה את התרבות במיקרו צנטריפוגה. החייאה. השעו את הגלולה בנפח שווה של M תשע בתוספת צנטריפוגה חוזרת ומתלה החייאה לאחר מתלה ההחייאה השני. המשך גידול בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.לאחר מכן, תקן את התרבית המושרית על ידי הוספת אלדהיד פרפורמי ב-PBS כדי להשיג ריכוז סופי של 4% אלדהיד פרפורם. אם הדמיית תאים חיים ראה את הפרוטוקול הכתוב הנלווה לסרטון זה לשינויים בהליך, אפשר לתרבית לדגור בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות. גלולה את התרבות והשהה בנפח שווה של PBS.לאחר מכן, יש לדלל חרוזי זהב של 50 ננומטר, אחד עד 10 עם תרבית מושעה. כדי למרוח את הדגימה על תא ההדמיה המוכן, הסר בזהירות את החלקת הכיסוי, והשאיר את כרית הג'ל על שקופית המיקרו אקוודוקט. הוסף מיד מיקרוליטר אחד של דגימת תרבית תאים לחלק העליון של כרית הג'ל.המתינו כשתי דקות עד שהתמיסה תיספג על ידי פד הג'ל ומעליו את פד הג'ל בכיסוי נקי ויבש חדש. המשך להרכיב את כל תא ההדמיה בהתאם להוראות היצרן לרכישת תמונה. הפעל את מצלמת המיקרוסקופ והלייזרים.תוכנת מטמורף פתוחה על ידי התקנים מולקולריים. הצב מסנני עירור ופליטה מתאימים בנתיב ההדמיה כפי שמוצג בסכימת המיקרוסקופ הזו, אותה ניתן למצוא בהליך הכתוב הנלווה לסרטון זה. הסט הבא של כוחות לייזר והגדרות רכישה.נעל כראוי את תא ההדמיה לתוך ה-stage באמצעות מתאם ה-stage המשלים. התמקדו במשטח התאים הקרובים ביותר לשפת החלקת הכיסוי. ייעד אזור הדמיה מתאים המואר באופן הומוגני על ידי כל שלושת הלייזרים.זהה אזור דגימה המכיל גם תאים וגם סמנים פידוציאליים, שהם חרוזי הזהב בסמיכות קרובה אך לא חופפים. רכוש תמונת שדה בהיר אחת עם זמן אינטגרציה של 50 אלפיות השנייה והעבר את המיקוד 0.5 מיקרומטר לתוך הדגימה. לאחר מכן רכוש תמונת פלואורסצנטיות ירוקה אנסמבל עם עירור מהלייזר של 488 ננומטר באמצעות זמן אינטגרציה של 50 אלפיות השנייה.לאחר מכן, רכשו וידאו זורם עם תאורה רציפה מלייזרים של 405 ננומטר ו-561 ננומטר. עבור תאים קבועים, קצב פריימים של 50 אלפיות השנייה משמש בסך הכל 20,000 פריימים. עם הספק הלייזר של 405 ננומטר שהוגדל בכ-10% לכל 1000 פריימים כאן, מוצגות 500 הפריימים הראשונים.שימו לב שמספר הפריימים שנרכשו מותאמים למערכת זו ותלויים במבנה התא המסוים. תיוג קצב הפעלת צפיפות והאם מיצוי כל מאגר רצפות הרצפה חשוב לניתוח לביצוע בניית תמונה. ראשית, זהה נקודות פוטנציאליות בזרם התמונה כשלושה פיקסלים סמוכים עם עוצמות מעל סף שנקבע אמפירית מתאימים לעוצמה של כל נקודה פוטנציאלית לפונקציה גאוס דו-ממדית.כדי לזהות את מיקום המולקולה ואת המספר הכולל של הפוטונים הנפלטים, חשב את מיקום הלוקליזציה של כל נקודה באמצעות המספר הכולל של פוטונים שזוהו. לאחר מכן, השליכו כתמים לא מתאימים על ידי החלת סף של דיוק הלוקליזציה והסירו תצפיות חוזרות של אותה מולקולה על ידי התעלמות מכל נקודה שנמצאת בטווח של 45 ננומטר ושש פריימים של כל נקודה מתקדמת הנכונה לסחיפה של הדגימה. על ידי הפחתת התזוזה התלויה במסגרת של חרוזי הזהב מכל מיקום מולקולה, הניחו את כל מיקומי המולקולות המתוקנים על תמונה אחת המורכבת מפיקסלים של 15 על 15 ננומטר, תוך התוויית כל מולקולה ייחודית כשטח יחידה, פרופיל גאוס דו מימדי עם סטיית תקן השווה לדיוק הלוקליזציה.התמונה המתקבלת היא מפת צפיפות הסתברות שבה עוצמת הפיקסל פרופורציונלית לסבירות למצוא מולקולה. בפיקסל הזה מאויר. הנה עיבוד דו-ממדי ברזולוציה גבוהה של ה-ZR שנוצר משיטת הדמיית כף היד.מבחינה איכותית, נצפה כי טבעת Z היא מבנה לא סדיר המאמץ תצורות מרובות, כגון רצועות בודדות או קשתות סליליות שאינן ניתנות להבחנה בתמונות פלואורסצנטיות קונבנציונליות. ניתן להשתמש בתצפיות כגון אלה כדי לקבוע את אחוז אוכלוסיית התאים המציגה תצורה מבנית מסוימת. ניתן למדוד את מידות ה- ZR גם מהחלקה הזו.רוחב הטבעת נקבע כ-113 ננומטר. ערך זה רחב יותר מהרוחב הצפוי של חוט פרוטו יחיד של FDSC, שהוא חמישה עד 10 ננומטר המבוסס על מיקרוסקופ אלקטרונים במבחנה. כאן, קוטר הטבעת נמדד כ-1050 ננומטר.ניתן להשתמש בקוטר זה כדי לתאר כמותית את מידת ההתכווצות במהלך חלוקת התא. גישה כמותית נוספת היא לחשב את צפיפות המולקולות על ידי ספירת מספר המולקולות הממוקמות באזור מוגדר. מכיוון שתמונות כף היד הן הקרנות דו-ממדיות של אובייקטים תלת מימדיים, יש להשתמש בהשתקפות פנימית כוללת או בכף יד TIR כדי להגביל את מישור הזיהוי לצד אחד של טבעת Z.מכיוון שהמולקולות המשורטטות מייצגות תת-קבוצה של אוכלוסיית ה-FDSC הכוללת, הצפיפות שנקבעה היא גבול תחתון של הצפיפות בפועל. הצפיפות המקסימלית שנצפתה בתמונות ה-TIR של טבעת Z מצביעה על כך שחלקים מסוימים מכילים חוטי פרוטו חופפים. בזמן השתתפות בהליך זה, חשוב לעקוב אחר מורפולוגיה וקצב גדילה של תאים כדי להבטיח שהביטוי של חלבון ההיתוך שלך אינו משפיע על כדאיות התא.לאחר שנקבע הליך זה עבור החלבון המעניין שלך, ניתן להשתמש בו כדי לבדוק שינויים מבניים הקשורים להתקדמות מחזור התא או להרחיב אותו להדמיה דו-צבעונית כדי להשוות את התפלגות הפנים של חלבונים מרובים.

super-resolution-imaging-of-the-bacterial-division-machinery

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור של אחד או יותר פלזמה ו/או חלבונים תאיים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע (GSD) בתאי יונקים. כאן, אנו נדון את היתרונות ואת השיקולים של שימוש בגישות כאלה עבור ויזואליזציה של כימות של החלבונים.

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

קולטן germinant אשכול חלבונים ב- 'germinosomes' בתוך הקרומית הפנימית של Bacillus subtilis נבגים. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר כתב פלורסנט חלבונים כדי להמחיש germinosomes. הפרוטוקול מזהה החולקות הממברנה הפנימית נבג מוכתמים מעדיפים לצבוע הממברנה FM4-64.

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

פרוטוקול זה מסביר כיצד להכין ולטעון דגימות חיידקיים עבור הדמיה תלת ממדית חיה וכיצד לשחזר את הצורה תלת ממדית של E. coli מתמונות אלה.

הדמיה תלת ממדית של תאים חיידקיים לייצוגים סלולריים מדויקים ולוקליזציה של חלבון מדויק

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יכולה לספק תובנה מפורטת על ארגון הרכיבים בתוך קומפלקס סינפטונמלי במיוזיס. כאן אנו מדגימים פרוטוקול לפתרון חלבונים בודדים של קומפלקס סינפטונמלי Caenorhabditis elegans .

מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד של קומפלקס סינפטונמלי בתוך נבט Caenorhabditis elegans

מאמר זה מספק פרוטוקול פשוט וברור לסימון אפקטורים המופרשים בסלמונלה באמצעות אתר הרחבת קוד גנטי (GCE) ספציפי ותמונה של לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM)...

הדמיה ברזולוציית על של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים באמצעות הרחבת קוד גנטי

במאמר זה אנו מתארים הליך המאפשר זיהוי כלל איברי של חיידקים פתוגניים במהלך ההדבקה וכימות של פעילות המדווח הפלואורסצנטי.

טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים

מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף עבור PmbExM, טכניקת מיקרוסקופיית הרחבה שתוכננה במיוחד עבור ביופילמים של Proteus mirabilis . PmbExM משתמש בטיפול אנזימטי מדורג בדגימות ביופילם כדי להשיג התרחבות איזוטרופית פי 4.3, המאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של הארגון המרחבי של מבנים תאיים ותת-תאיים בתוך קהילות מיקרוביאליות יושבות אלה.

הדמיה ברזולוציה גבוהה של ביופילם Proteus mirabilis על ידי מיקרוסקופ הרחבה

חקור הדמיית סופר רזולוציה של חלבוני חלוקת תאים ב-E. coli באמצעות מיקרוסקופיית PALM. שיטה זו מאפשרת מיפוי מבני במדויק ננומטרי של טבעת FtsZ בחיידקים חיים.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

גלה סרטונים נוספים