Name: נוהל Decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: למדו שיטת דה-סלולריזציה מהירה ללב חזירי באמצעות זלוף כלילית מדרדרת ליצירת שכבת עמודה חוץ-תאית ספציפית לאתר. שיטה זו מאפשרת הכנת פיגומים לרפואה רגנרטיבית ולהנדסת רקמות לבביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות רוגן אורח, מישל וויבר, וקריסטן יפרט. מימון למחקר זה מסופק על ידי NIH גרנט R03EB009237, כמו גם מענקי NIH הדרכת T32EB001026-06 ממכון הלאומי לדימות וBioengineering ביו T32HL076124-05.

1. הכנת רקמה והתקנת ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איבר חזירי קציר מייד לאחר המתת חסד ממתקן משחטה או מחקר ולשטוף את הדם עודף. חתוך את הלב של שומן ורקמה עודפים, שמירת הפרוזדורים ואב העורקים בשלמותה. לחתוך שומן להפריד מעורק הריאה לאב העורקים. אם יש קיצוצים כלשהם ברקמה, להשליך כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוטף כל אחד בנפרד בנייר לב מקפיא ולאחסן את כל הרקמות במקפיא ° C -80 לפחות 24 שעות כדי להבטיח הקפאה מוחלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשמוכן לשימוש (בדרך כלל פחות מ 3 חודשים), לב הפשרה 1 שלם קפוא חזירי במים מסוג 1 מתחת למים למשך הלילה בכוס 4 ליטר ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הלב מופשר לחלוטין, ללטף את הלב יבש, לשקול את הלב, ולהקליט במשקל. לבו של חזיר במשקל שוק צריך לשקול כ 375-450 גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורות גודל 18 Masterflex לסוף ¼ &quot;של מפחית תיל. הכנס מפחית התיל וצינורות בתוך אב העורקים. 2 תפסי מקום צינור או קשרי zip מאובטחים ברחבי אב העורקים, ממש מתחת לתא מטען brachiocephalic. המפחית והצנרת חייב להישאר מעל לשסתום אב העורקים, ולכן העורקים הכליליים ניתן perfused (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 30 או 60 מ&quot;ל כדי למלא את הצינור במי סוג I. הכנס את הצינורות בתוך המחסנית של משאבת גלגלת Masterflex באמצע המשוער שלו. הצף את סוף היבוא של הצינורות בחלק התחתון של 4 כוס ליטר מלאה עם 2.5 ליטר מים ולאבטח את הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הלב בכוס מלאה במים, וראש המשאבה כדי להסיר בועות אוויר. אם בועות הם נצפו מגיעים מאב העורקים שבו הצינור מוכנס, אב העורקים ייתכן שיהיה הצורך לשנות את מיקום או מאובטח עם קשרים נוספים. חותם אטום הוא חשוב כדי לשמור על לחץ מתאים במשך תהליך decellularization (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את 4 כוס הליטר המכיל 3 ליטר של 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 פתרון בצלחת מערבבים ומחמם אותו עד 37 מעלות צלזיוס בהכנת תהליך decellularization. </li></ol> 2. רקמת שטיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המשאבה לקצב זרימה של 400 מ&quot;ל / דקה, להבטיח כי את גודל הצינורות נכון נבחר. שטוף את הלב עם סוג מים שעבור 15-25 דקות. כמשאבה התחילה, לב צריך להתנפח וeffuse דם מחדרי הלב. פתרון טרי צריך להחליף כל 5-10 דקות, או לפי צורך על בסיס כמות הדם הוסרה מהלב. אם דם לא effused מהלב, להתאים את הצינורות ותפסים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה ולהעביר את הלב לכוס נפרדת מלאה בפוספט 2X נאגר מלוח (PBS). אחרי הצינורות הם שקועים בפתרון, מפעיל את המשאבה ולהגביר את קצב הזרימה של 700 מ&quot;ל / דקה. הלב צריך להישאר בתמיסה למשך 15 דקות, שינוי הפתרון כל 5 דקות. כל שינוי דורש פתרון המשאבה צריך לעצור באופן זמני תוך הרקמות והצינורות מועברותלכוס החדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב לסוג מים שעבור 10 דקות ולהגביר את קצב הזרימה ל750 מ&quot;ל / דקה. </li></ol> 3. זלוף Decellularization והפתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב לכוס המכילה 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% 3 NaN ב 37 ° C. הגדל את מהירות משאבת 1200 מ&quot;ל / דקה ומפעיל את המשאבה. השתמש במוט מערבבים הונח בתחתית הכוס לזרום פתרון במבחנה. הלב צריך להישאר בEDTA/0.05% 3 פתרון 0.2% Trypsin/0.05% NaN על 37 מעלות צלזיוס עבור סכום כולל של שלוש שעות. לאחר השעה 1, להגדיל את מהירות המשאבה ל -1,500 מ&quot;ל / דקה. לאחר שעה נוספת, להגדיל את מהירות המשאבה ל -1,800 מ&quot;ל / דקה. הרקמה היא נתונה באיטיות למהירות מוגברת זלוף למצב הרקמות ולמנוע קרע של כלי הדם. הלב יתפח וכמעט כפול בגודלו במהלך שלב זה של הפרוטוקול. הרקמות תאבדנה את צבעו הטבעי, ומתקדם מהאטרייה לשיא בכל רחבי הדואר הפרוטוקול (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל זלוף פתרון, 2 שלב שטיפה מתבצע על מנת להסיר שאריות סלולריות, שאריות כימיקלים, ותמוגה תא סיוע. כל השטיפה מורכבת מ10 דקות לשטוף במי סוג I ואחרי 10 דקות לשטוף עם פתרון 2X PBS בטמפרטורת חדר. כל שטיפה מורכבת מהסרת הפתרון מהכוס המקורית, והוסיף לשטוף פתרונות, ומחזור perfusate בתוך הכוס המכילה את הלב מתחת למים. לאחר 3 פתרון NaN 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% מים, ינקבו ב1900 מ&quot;ל / דקה ואז ינקבו 2X PBS ב 1950 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב לפתרון של 3% X-100/0.05% טריטון EDTA/0.05% 3 NaN בטמפרטורת חדר. הגדל את מהירות המשאבה עד 2,000 מ&quot;ל / פתרון ינקב דקות ובמשך שעה אחת. הסר את התמיסה מהמבחנה ולהחליף עם פתרון חדש, להגדיל את מהירות המשאבה עד 2100 מ&quot;ל / דקה, ותנקב את הפתרון הטרי לשעה נוספת וחצי, מביא את הסך כל זמן ב3% טריטון X-100/0.05% EDTA/0.05% 3 NaN ל -2.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה במי סוג I ב2150 מ&quot;ל / דקה ו2X PBS ב 2180 מ&quot;ל / דקה למשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב ל4% פתרון Deoxycholate נתרן בטמפרטורת חדר. הגדל את מהירות משאבת 2200 מ&quot;ל / דקה ופתרון ינקב עבור 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה במי סוג I וב2X PBS ב 2200 מ&quot;ל / דקה במשך 15 דקות כל אחד, משנות את הפתרונים לאחר דקות 5-10 לכל פתרון. ניתן לפצל את צעדי זלוף תואר על ימים מרובים על ידי ביצוע הצעד לשטוף פעמים ואחסון הלב עם צינורות מחוברים בין הלילה ב 4 ° C ושקוע במי סוג I. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בצעו 5 דקות לשטוף עם מי סוג I ב 750 מ&quot;ל / דקה, ואחרי 5 דקות לשטוף ב1X PBS ב 1500 מ&quot;ל / דקה. הפרוטוקול ואז ניתן להמשיך בקצב הזרימה המתוארת בפתרון הראוי. </li></ol> 4. חיטוי ועיבוד סופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב לperac 0.1%פתרון ינקב עבור 1.5 שעתי פתרון אתנול 4% וב2200 מ&quot;ל / דקת חומצת etic /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את השטיפות הסופיות לרקמות שבוצעו בכל 2200 מ&quot;ל / דקה. תנקב את הרקמה עם 1X PBS במשך 15 דקות, ואחרי 2 דקות 5 שטיפות במי סוג I. זו סדרה של שטיפות חוזרת על עצמו פעם נוספת על מנת להשלים את הליך זלוף פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה וניתק את הלב מפתרון לניקוז הלב. חותך את הקשרים מאב העורקים, להסיר את כל הצנרת, ולמקם את הלב בגביע ריק לניקוז לשעה 1. עודף נוזלים יהיו צורך לנקז אותו מדי. הנח את הלב על משטח סופג כדי לנקז את הלב (איור 4) באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שרוב המים מוסרים, להקליט את המשקל של מטריקס הלב (C-ECM). הלב יכול להיות צפוי לאבד כ 20-25% מהמשקל ההתחלתי שלה במהלך תהליך decellularization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את חדרי לב הימניים ושמאליים, וכן מחצו חדרית לדנ&quot;א quantificatiובעיבוד היסטולוגית כדי לאשר decellularization המלא של הרקמה (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפא C-ECM ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 2 שעות לפני lyophilization. </li></ol>

<ol><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. , (2008).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. , (2010).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. , (2012).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Akhyari, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quest+for+an+optimized+protocol+for+whole-heart+decellularization%3A+a+comparison+of+three+popular+and+a+novel+decellularization+technique+and+their+diverse+effects+on+crucial+extracellular+matrix+qualities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).</li>
<li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+perfusion+decellularization+porcine+heart+model--generation+of+3-dimensional+myocardial+neoscaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+journal+%3A+official+journal+of+the+Japanese+Circulation+Society%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model--generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds.</a> Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).</li>
<li>Remlinger, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrated+xenogeneic+decellularized+tracheal+matrix+as+a+scaffold+for+tracheal+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction.</a> Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).</li>
<li>Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+hepatic+sinusoidal+endothelial+cell+phenotype+in+vitro+using+organ-specific+extracellular+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds.</a> Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).</li>
<li>Wainwright, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Right+ventricular+outflow+tract+repair+with+a+cardiac+biologic+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+tissues%2C+organs%22%5BJournal%5D)">Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold.</a> Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).</li>
</ol>

ד&quot;ר גילברט היה בוועדה המדעית המייעצת בACell, Inc בעוד שהמחקר שנעשה, והפך לאחרונה לסגן הנשיא למחקר ופיתוח. ACell, Inc מוכר מטריצת שלפוחית ​​שתן ואין לו עניין מסחרי במחקר הנוכחי.

המחקר הנוכחי תאר מתודולוגיה לdecellularization עקבי והיעיל של לב חזירי. הפרוטוקול היה שינוי ל1 דו&quot;ח שפורסם בעבר, וכלל חשיפה ארוכה יותר לזרימה ולחץ מוגבר, אשר ספקה תוצאות דיר יותר. רקמת decellularized התקבלה עמדה בכל הקריטריונים שפורסמו לdecellularization המוצלח של רקמה 2. שינויים תכופים פתרון בוצעו על מנת להגביל את החידוש של חומר תאי לרקמה, ומשך חשיפה לכל סוכן decellularization היה ממוזער להפחתת השפעות שליליות על ECM. במהלך השלבים הראשונים של הפרוטוקול, ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> Gibco </td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> דיג </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> 3 NaN </td><td> סיגמא </td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא </td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> דיג </td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td> Deoxycholate נתרן </td><td> סיגמא </td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td> חומצת Peracetic </td><td> Pfaltz ובאואר </td><td> P05020 </td><td> 35% CAS # 79-21-0 </td></tr><tr><td> אתנול </td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></tד&gt; </tr><tr><td> כונן המשאבה Masterflex </td><td> הקול בן זוגו </td><td> Si-07524-50 </td><td></td></tr><tr><td> אבובי Masterflex </td><td> הקול בן זוגו </td><td> 96400-18 </td><td> גודל 18 </td></tr><tr><td> Reducer תיל </td><td> הקול בן זוגו </td><td> EW-30612-20 </td><td></td></tr><tr><td> כוס 4L </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

נוהל decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

כל decellularization האיבר זלוף המבוסס צבר לאחרונה עניין בתחום הנדסת רקמות כאמצעי ליצור פיגומים תאיים מטריקס ספציפיים לאתר, תוך שמירה על מידה רבה את הארכיטקטורה המקורית של הפיגום. עד כה, גישה זו נוצלה במגוון רחב של מערכות איברים, כוללת לב, ריאות, הכבד ו1-5. שיטות decellularization קודמות לרקמות ללא רשת כלי דם נגישה הסתמכו על חשיפה ממושכת של רקמות לפתרונות של חומרי ניקוי, חומצות, או טיפולים אנזימטיים כאמצעי כדי להסיר את הרכיבים הסלולריים וגרעיניים מהסביבה התאית 6-8. עם זאת, היעילות של שיטות אלה תלויים על יכולתו של את הפתרונים לחלחל רקמות באמצעות דיפוזיה. לעומת זאת, טפטוף של איברים דרך מערכת כלי הדם הטבעית ביעילות מצמצם את מרחק דיפוזיה ותחבורת הנחייתם של decellularizatiעל סוכנים לרקמה והמרכיבים תאיים מהרקמות. בזאת, אנו מתארים שיטה לdecellularize לב חזירי שלם מלא דרך זלוף המדרדר כלילית. הפרוטוקול הניב decellularized מלוא לב תאי מטריצה ​​(c-ECM) פיגום עם המבנה תלת הממדים של הלב השלם. השיטה שלנו השתמשה בסדרה של אנזימים, חומרי ניקוי, וחומצות בשילוב עם שטיפות hypertonic וhypotonic לסייע בתמוגה וההסרה של תאים. הפרוטוקול המשמש פתרון טריפסין לנתק את התאים מהמטריצה ​​אחרי Triton פתרוני X-100 ונתרן deoxycholate כדי לסייע בהסרה של חומר תאי. הפרוטוקול המתואר משתמש גם במהירויות של יותר מ זלוף 2 ליטר / דקה לפרקי זמן ארוכים. קצב הזרימה הגבוהה, בשילוב עם שינויי פתרון נתן הובלה של סוכנים לרקמות ללא זיהום של פסולת תאית והבטיח יעיל שטיפה של הרקמות. השיטה המתוארת הסירה את כל החומר גרעיני מנתיve רקמת לב חזירית, יצירת לב ECM פיגום באתר ספציפי שיכול לשמש למגוון רחב של יישומים.

ההשפעה של decellularization על לב חזירי שלם באופן טבעי משתנית בהתאם להבדלים בגודל, לחצים, וסידור כלי. לכן, את ההרכב המדויק של הפיגומים התאיים מטריקס הנגזרים לא יהיה אותו הדבר מלב אל לב. השלמת הפרוטוקול המתואר תניב לב שמופיע לבן או שקוף, המציין את האובדן של חומר תאי. עם זאת, מקובל כי רקמה יכולה להיחשב &quot;decellularized&quot;, המבוסס על שילוב של מספר פרמטרים כמותיים יותר 8. פרוטוקול decellularization מוצלח יהיה לייצר מטריצה ​​עם פחות מ 50 ng של גדילי הדנ&quot;א כפול למ...

שיטת מהירות לחלוטין להסיר רכיבים סלולריים מלב חזירי שלם באמצעות זלוף המדרדר מתוארת. שיטה זו מניבה מטריצת אתר פיגום תאי לבבי ספציפי שבו יש פוטנציאל לשימוש ביישומים קליניים מרובים.

נוהל Decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להסיר במהירות ובאופן מלא רכיבים תאיים מלב חזירי שלם באמצעות שפע לאחור כדי להניב פיגום מטריצה חוץ-תאי לב ספציפי לאתר. זה מושג על ידי קנולציה ראשונה, אבי העורקים של לב חזירי שלם. הצינור הבא מחובר למשאבה פריסטלטית, והרקמה נשטפת בתמיסות מים ומלח בקצבי זרימה נמוכים.לאחר מכן מחדירים את הלב לסדרה של חומרי ניקוי ותמיסות אנזימטיות בקצב זרימה הולך וגדל בהדרגה כדי להסיר רכיבים תאיים. השלב האחרון הוא החדרת תמיסת חיטוי. הסר את הצינור וחתך את דפנות החדרים לעיבוד.בסופו של דבר, הלב מנותח כדי לאשר הסרה מוחלטת של חומר תאי וגרעיני מהרקמה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הקנולציה והשפע הראשוניים מכיוון שהמיקום המדויק של הצינור הוא המפתח להצלחת הניסוי. איבר החזיר מתקבל מבית מטבחיים או ממתקן מחקר מיד לאחר המתת חסד.התחל בשטיפה של עודפי דם. לאחר מכן, חתוך את הלב מעודפי שומן ורקמות, תוך שמירה על הפרוזדורים ואבי העורקים שלמים. הפרד את עורק הריאה מאבי העורקים על ידי קיצוץ שומן נוסף.לאחר החיתוך, עטפו כל לב בנפרד בנייר מקפיא ואחסנו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות כדי להבטיח הקפאה מוחלטת. כשהוא מוכן לשימוש, יש להפשיר את הלב על ידי טבילתו בכוס של ארבעה ליטר מלאה במים מסוג 1 ולהשאיר אותו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר שהלב מופשר לחלוטין, יש לרפד אותו יבש ולרשום את משקלו.ליבו של חזיר במשקל שוק צריך לשקול כ-375 עד 450 גרם. לאחר שהלב מוכן, חבר צינורות גמישים בגודל 18 מאסטר לקצה של רבע סנטימטר של מפחית דוקרני. לאחר מכן, הכנס את מפחית הדוקרנים והצינור בתוך אבי העורקים.הנח שני צינורות clamps או קשרי רוכסן מאובטחים סביב אבי העורקים ממש מתחת לתא המטען הברכיוצפלי. המפחית והצינור חייבים להישאר מעל המסתם האאורטלי כדי שניתן יהיה לחלחל את העורקים הכליליים. לאחר מכן, השתמש במזרק כדי למלא את הצינור במים מסוג אחד והכנס אותו למחסנית של משאבת רולר גמישה מאסטר בנקודת האמצע המשוערת שלה.לאחר מכן, טבלו את קצה הזרימה של הצינור, יחד עם הלב בתחתית מלאה ב -2.5 ליטר מים ואבטחו. ההיבטים הקשים ביותר בהליך זה הם קנולציה נכונה של הלב ושמירה על מהירויות משאבה נאותות לאורך כל ההליך. אנו מבטיחים הצלחה בניסוי שלנו על ידי בדיקה ויזואלית של הרקמה לאיתור בועות אוויר לאורך כל ההליך, כמו גם שמירה על תפליט תקין מהחדרים לאורך כל ההליך.הפעל את המשאבה כדי להסיר בועות אוויר מהצינור, מקם מחדש או אבטח קשרים נוספים סביב אבי העורקים והצינורות אם נצפות בועות אוויר. איטום אטום חשוב לשמירה על לחץ נאות במהלך תהליך הדה-סלולריזציה. בשלב זה יש לחמם של ארבעה ליטר המכילה שלושה ליטר מלח תמיסת טריפסין מאוזנת לקראת תהליך הדה-סלולריזציה.ראשית, הגדר את המשאבה לקצב זרימה של 400 מיליליטר לדקה וודא שנבחר גודל הצינור הנכון. הפעל את המשאבה ושטוף את הלב במים מסוג 1 למשך 15 עד 25 דקות, הלב צריך להתנפח ולהתפזר דם מהחדרים, יש להחליף תמיסה טרייה כל חמש עד 10 דקות או לפי הצורך. לאחר הוצאת הדם, עצור את המשאבה והעביר את הלב לכוס נפרדת מלאה בשני XPBS.טבלו את הצינור. הגדל את קצב הזרימה ל-700 מיליליטר לדקה והפעל את המשאבה. השאירו את הלב בתמיסה למשך 15 דקות, והחליפו את התמיסה כל חמש דקות.כשהוא מוכן, העבירו את הלב למים מסוג אחד למשך 10 דקות והגדילו את קצב הזרימה ל -750 מיליליטר לדקה. כדי להתחיל בתהליך הדה-סלולריזציה, העבירו את הלב לכוס המכילה תמיסת איזון מלח חמה. הגדל את המהירות ל -1200 מיליליטר לדקה והפעל את המשאבה.הניחו מוט ערבוב בתחתית הכוס למחזור והשאירו את הלב בתמיסה זו למשך שלוש שעות. מהירויות הזלוף מוגברות לאט כדי לרכך את הרקמה ולמנוע קרע בכלי הדם. לאחר שעה, הגדל את מהירות המשאבה ל -1500 מיליליטר לדקה.לאחר שעה נוספת, מהירות המשאבה מוגברת ל -1800 מיליליטר לדקה. הלב צריך להתנפח וכמעט להכפיל את גודלו. הרקמה אמורה לאבד את צבעה הטבעי בהתקדמות מהפרוזדורים לקודקוד.לאחר כל זלוף תמיסה, מבוצעת שטיפה דו-שלבית להסרת פסולת תאית, שאריות כימיות וסיוע לליזה של תאים לאחר המלח המאוזן נסיעות ותמיסה, יש להחדיר מים ב-1900 מיליליטר לדקה ולאחר מכן שני XPBS ב-1950 מיליליטר לדקה למשך 10 דקות כל אחד. לאחר מכן, העבירו את הלב לתמיסת איזון מלח בטמפרטורת החדר של Triton X 100. הגדל את מהירות המשאבה ל-2000 מיליליטר לדקה והחדיר למשך שעה.לאחר מילוי בתמיסה טרייה, הגדל את מהירות המשאבה ל -2100 מיליליטר לדקה והחד למשך שעה וחצי נוספות. לאחר מכן, שטפו את הטישו כפי שהודגם קודם, אך במהירויות משאבה מוגברות. הזלוף הבא הוא עם טמפרטורת החדר 4% נתרן דאוקסי קואט.הגדל את מהירות המשאבה ל-2200 מיליליטר לדקה והזרם למשך שלוש שעות. לאחר שלוש שעות, חזור על שלבי השטיפה, והחלף את התמיסות לאחר חמש עד 10 דקות לכל תמיסה. לאחר הזלוף הסופי, העבירו את הלב לחומצה פראצטית של 0.1%, תמיסת אתנול 4% והחליפו למשך 1.5 שעות במהירות של 2200 מיליליטר לדקה באותה מהירות משאבה, חדרו את הרקמה עם XPBS אחד למשך 15 דקות, ולאחר מכן שתי שטיפות של חמש דקות במים מסוג 1.חזור על הפעולה פעם נוספת כדי להשלים את הליך זלוף התמיסה, כבה את המשאבה והסר את הלב מהתמיסה. חותכים את הקשרים מאבי העורקים. הסר את כל הצינורות והנח את הלב בכוס ריקה לניקוז למשך שעה.הסר עודפי נוזלים מעת לעת לאחר שעה. הניחו את הלב על כרית סופגת כדי לנקז עוד יותר. לאחר הסרת רוב המים, רשום את המשקל הסופי של הלב.הלב יכול לאבד כ-20 עד 25% ממשקלו ההתחלתי במהלך תהליך הדה-סלולריזציה. בסוף תהליך זה, הלב אמור להיראות לבן או שקוף המעיד על אובדן חומר תאי. לאחר מכן, מחיצת החדר והחדר הימני והשמאלי מופרדים ושמורים ל- DNA.כימות ועיבוד היסטולוגי מקפיאים את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות לפני הליופיליזציה. דה-סלולריזציה מוצלחת מודגמת כאן על ידי הירידה המשמעותית בתכולת ה-DNA בהשוואה לחדרים מקומיים. ג'ל זה מראה שנותר מעט DNA שיורי בחדרים נטולי תאים בהשוואה למטריצת שלפוחית השתן או UBM.בדוגמה זו, צביעת המאט טואין ואאוזין מראה הסרה מוחלטת של חומר גרעיני מהחדרים. הצביעה של מאסון מאשרת עוד יותר את אובדן צרורות שרירי הלב ושימור רשתות הקולגן בזמן ניסיון הליך זה. חשוב לבדוק ויזואלית את הרקמה ואת הכליליים לעתים קרובות.

procedure-for-decellularization-porcine-heart-retrograde-coronary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון זה אנו מבצעים זילוח מדרדר לנגנדורף של לב עכבר מבודד. במהלך ההליך, הפעילות הלבבית של הלב נשמרת על ידי ניקוב אותו לאחור עם פתרון זילוח דרך העורקים הכליליים באמצעות צינורית המוחדרת לתוך אבי העורקים העולה. המודל משמש לחקר הפתופיזיולוגיה הלבבית של הלב.

זילוח לב מדרדר לנגנדורף: טכניקת Ex Vivo לניקוב לב עכבר מבודד

בסרטון זה, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לחילוץ הלב ממודל חזירי להשתלת לב.

כריתת לב חזירית: פרוטוקול לחילוץ לב חזירי להשתלת לב

סרטון זה מתאר טכניקה אקס-סיטו לשימור לב חזירי מבודד על ידי ניקובו בתמיסת פרפוזט עשירה בחומרים מזינים מחומצנים. הטכניקה מאפשרת הערכה מקיפה של ביצועי הלב בתנאים פיזיולוגיים.

זילוח לב Ex Situ: טכניקה לשימור תפקוד לב חזירי מבודד

שיטה זו מאפשרת decellularization של איבר מוצק מורכבים באמצעות פרוטוקול פשוט המבוסס על שוק אוסמוטי זלוף של יונית סבון עם הפרעה מטריצות איבר מינימלי. היא כוללת טכניקה decellularization הרומן מלב אנוש בתוך נרתיק מווסת עם ניטור בזמן אמת זרימה dynamics וסלולר יצוא פסולת.

Decellularization של הלב האנושי כולו בתוך נרתיק מווסת בכיוון הפוך

זלוף הלב באתרו לשעבר normothermic (ESHP), שומר על הלב במצב הכאה, הפיזיולוגיות למחצה. כאשר מבוצעת במצב עבודה, ESHP מספק ההזדמנות כדי לבצע הערכות מתוחכמות של התורם הכדאיות איברים ותפקוד הלב. כאן, אנו מתארים את השיטה שלנו עבור הערכת ביצועים שריר הלב במהלך ESHP.

Normothermic לשעבר זלוף באתרו הלב בעבודה מצב: הערכה של תפקוד הלב ואת חילוף החומרים

כאן, אנו מתארים טרום קלינית בעלי חיים גדולים (porcine) מודל של השתלת לב אורתוגרפית כי כבר הוקמה בחוזקה ומנוצל לחקור אסטרטגיות קרדיוקטיבי הרומן.

מודל הפרה-קליני של השתלת לב אורתוטופית

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במערכת זלוף סנגווינית נורמותרמית ex vivo להעברת טיפולים לאלוגרפט לב שלם במודל השתלת לב הטרוטופית חזירית.

פרוטוקול השתלת לב הטרוטופית חזירית להעברת טיפולים לאלוגרפט לבבי

הפרוטוקול מתאר את הרכש הכירורגי ולאחר מכן דה-סלוליזציה של דשי חזיר וסקולריים על ידי זלוף של דטרגנט נתרן דודציל סולפט דרך כלי הדם של הדש בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית.

רכש ופרפוזיה-דה-סלוליזציה של דשים וסקולריים חזיריים בביוריאקטור פרפוזיה מותאם אישית

בדיקות סקר למחלת עורקים כליליים עשויות להגדיל את רכישת הלבבות התורמים עם קריטריונים מורחבים. פרוטוקול לביצוע אנגיוגרפיה כלילית הניתנת לשחזור במהלך זילוח לב ex-situ מתואר כאן במודל חזירי.

אנגיוגרפיה כלילית במהלך זילוח לב לשעבר במודל חזירי

הפרוטוקול כאן מתאר מודל חזירי בנאמנות גבוהה של השתלת לב לאחר תרומה לאחר מוות במחזור הדם תוך שימוש בזלוף ex vivo של האלוגרפט.

מודל חזירי בנאמנות גבוהה של השתלת לב אורתוטופית לאחר תרומה לאחר מוות במחזור הדם

למדו שיטת דה-סלולריזציה מהירה ללב חזירי באמצעות זלוף כלילית מדרדרת ליצירת שכבת עמודה חוץ-תאית ספציפית לאתר. שיטה זו מאפשרת הכנת פיגומים לרפואה רגנרטיבית ולהנדסת רקמות לבביות.

נוהל Decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר

גלה סרטונים נוספים