Name: ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: למד שיטה לויזואליזציה של mRNAs המקומצים ברטיקולום האנדופלזמי בתאי יונקים באמצעות היברידיזציה in situ פלואורסצנטית. טכניקה זו מאפשרת הבחנה בין mRNA ציטופלזמי ל-ER-bound וכימות פלואורסצנציה לחקר דינמיקת mRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהלאומיים למדע והנדסת מועצת המחקר של קנדה לXAC וAFP

1. הכנת חומרים להפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע רקמות תרבות על coverslips חומצה טופלה ללפחות יום אחד לפני הניסוי. אנו משתמשים COS-7 או U2OS, כשתי שורות תאים אלה מפגינים ייצור חזק של חלבון מופרש ויש ER מוגדר היטב. שים לב שעל מנת להשיג יעילות שאיבה גבוהה, תאים לא יעלו על 80% confluency על coverslip ביום של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם mRNA אקסוגני מסוים נחקר, תאים transfected יום אחד לאחר זריעה עם פלסמידים המכילים את הגן של עניין תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים transfection. התאים אז מותר להביע mRNA ללפחות 18 שעות לפני השאיבה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בתאים עם מעכבי תרגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את ההשפעה של ריבוזומים שלמים על התחזוקה של mRNAs קשר עם חדר המיון, תאים יכולים להיות מטופלים עם מעכבי תרגום שמשבשים את הקשרשל הריבוזומים עם mRNA 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכבים של ייזום תרגום, כגון homoharringtonin (HHT), pactamycin, או 2 - (4-methyl-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (mdmp), למנוע הריבוזומים חדשים מלהתרועע עם התמליל ובמקביל מאפשרים הריבוזומים מאורסת להשלים תרגום 12-14. הואיל ושיעור התרגום עבור רוב החלבונים בתאי יונקים הם 5 חומצות אמינו לשנייה, ללא קשר לשימוש או קודון אורך mRNA 15, טיפול של 30 דקות צריך לנקות את הריבוזומים של הודעות עם מסגרות קריאה פתוחות כל עוד 27,000 נוקלאוטידים (קידוד לחלבונים כל עוד 9000 חומצות אמינו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכבים כגון puromycin לקדם את הפליטה המוקדמת של הרשת המתהווה וכך לשבש את 12 polysomes. עם זאת כדי לשבש את הקשר של הריבוזומים puromycin טופלו-עם mRNA לחלוטין, chelators מגנזיום כגון EDTA יש להוסיף למאגר חילוץ digitonin 11. </li> &lt;li&gt; בניסוי זה, תאים שטופלו בpuromycin 200 מיקרומטר, HHT 5 מיקרומטר, או בינוני שליטה למשך 30 דקות לפני החילוץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מאגר החילוץ Digitonin. כדי להמחיש mRNAs ER-מקומי ללא ההתערבות של תמלילים חופשיים (כלומר, שאינם cytoplasmic ER-קשורים), אנו סלקטיבי permeabilize תא עם digitonin, glycoside סטרואידים כי אינטראקציה מועדפת עם 3β-hydroxysterols. בריכוזים נמוכים, digitonin סלקטיבי permeabilizes חלקים של קרום הפלזמה, גורם &quot;דליפות&quot; 16. לעומת זאת, קרום ER ומעטפת גרעין, שהם עניים בכולסטרול, נותרים ללא פגע 16,17. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבקת Digitonin (סיגמה אולדריץ) מומסת במים מזוקקים במשקל 5% / נפח ופתרון שהמנייה הזאת aliquoted לנפחים קטנים ומאוחסנת ב-20 ° C. מניסיוננו, מחזורים רבים בהקפאת הפשרה מקטינים את היעילות של digitonin המומס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון של מנייהחיץ CHO 10x (1x ריכוז עובד פתרון: 115 המ&quot;מ כץ, 25 מ&quot;מ HEPES pH 7.4, 2.5 המ&quot;מ MgCl 2, 2 המ&quot;מ EGTA וסוכרוז mM 150) מוכן עם חומרים כימיים RNase-חופשי ומאוחסן ב -20 ° C. פתרון עובד (1x CHO חיץ) הוא הוכן על ידי דילול פתרון המניות עם מי RNase חינם וניתן לאחסן ב 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. הפקת Digitonin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרוני חילוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק חימום עם משטח שטוח הוא שחומם מראש ל 40 מעלות צלזיוס, ונשמר בטמפרטורה זו במהלך לחילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור משטח עבודה שטוח שהוא RNase חופשי, בלוק החימום טבול במעט מים ומצופים בחתיכה טרייה של parafilm M (חברת Bemis, Inc). בועות אוויר בין גיליון parafilm ובלוק חימום הנן החליקה החוצה באמצעות כפפות RNase-חופשיות וkimwipes (VWR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x CHO החיץ מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ידי דוגר באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות 6-גם משמשות כדי לשטוףולתקן תאים. כל שורה של 3 בארות משמשת לכיסוי 1 להחליק. לשתי הבארות הראשונות בשורה, 2 מ&quot;ל של חיץ CHO התחמם הוא הוסיף. כדי גם האחרון, 2 מ&quot;ל של תמיסת הקיבוע (PBS paraformaldehyde + 4% (מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים)) הוא הוסיף. מגש זה יכול להיות מאוחסן ב37 המעלות צלזיוס החממה עד שהתאים מוכנים להפקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון החילוץ Digitonin הוא הוכן על ידי דילול פתרון digitonin המניות כדי 0.025% עם חיץ CHO חם רק לפני שימוש. שוב, שים לב שתאים לpuromycin טופל, חיץ החילוץ חייב בנוסף מכיל 20 המ&quot;מימ EDTA יעילות לשבש הריבוזומים 11. טיפין של 100 μl של פתרון החילוץ מונחות על בלוק החימום parafilm המכוסה מייד לפני החילוץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת Digitonin וקיבוע סלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסיר את התאים מ37 המעלות צלזיוס החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתהליך החילוץ, coverslips הוא מניפולציה בעזרת המלקחיים של jewler. עםהמלקחיים להרים את coverslip וטובלים אותו הראשון ולאחר מכן השני גם מכיל מאגר CHO לשטוף את מדיום הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר למחוק את החיץ עודף מהצד האחורי של coverslip עם kimwipe ולמקם את coverslip, צד התא פונה כלפי מטה, על פתרון החילוץ באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 שניות, להרים את coverslip עם המלקחיים ולהעביר אותו באופן מיידי, בצד תא פונה כלפי מעלה, לרווחת המכיל 4% חיץ הקיבוע paraformaldehyde. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן לדגור במדגם מייצב ללפחות 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תאי בקרה Unextracted. כדי לקבוע את הסכום הכולל של ה-mRNA בציטופלסמה זה רעיון טוב כדי להכין את מדגם שליטת unextracted. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים שגודלו בcoverslips מוכנים כאמורים לעיל (ראה סעיף 2.2), אלא ששלב חילוץ digitonin (2.2.3) הוא דלג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, תאים בלתי חולצו צריכים להיות permeabilized ב PBS + טריטון 0.1%X-100 במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol></li></ol> 3. כתמי דגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב בדיקות עבור פלואורסצנטי כלאה באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרצף הראשוני של mRNA של עניין מקופל באמצעות תוכנת רנ&quot;א משנית מבנה חיזוי, כגון RNAstructure 5.0 18. קפלי mRNA מוערכים חזותי לזיהוי אזור של כ 50 נוקלאוטידים שהוא ללא מבנים משניים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשלמה ההפוכה של אזור זה היא מסונתז עם Alexa546 fluorophore המחובר בקצה 5 &#39;של החללית (שנרכש מטכנולוגיות DNA משולבות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החללית מדוללת במי RNase חינם לריכוז מניות של 100 מיקרומטר שניתן לאחסן ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתמה עם בדיקות FISH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב שלמרות שהתאים digitonin-חולצו אינם דורשים permeabilization נוסף, טיפול בדגימות אלה קבועים עם 2 מ&quot;ל של 0.1% טריטון X-100 בדילולPBS במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר לפני צביעת דגים, עוזר להפחית את אות הרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את השקופיות אז נשטפות פעמים עם PBS להסיר כל paraformaldehyde שייר או טריטון X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים אז נשטפים פעמים עם פוראמיד 25% עד 60% במאגר ציטראט נתרן 1X (150 mM NaCl וציטרט הנתרן mM 15). באופן כללי, לבדיקות דגים ספציפיות שהם 50-60 נוקלאוטידים אורך, פוראמיד 60% בלבד, אך ל() הכתמת mRNA פולי עם חללית Oligo (dT) דגים, ברמה של פוראמיד מופחת עד 25%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את החדר המכתים, תחתית צלחת פטרי 150 מ&quot;מ מכוסית במים ופיסת parafilm הוא צפה על פני המים. המים מוסרים על ידי הסיבוב מעל הצלחת, ובכך מאפשרים parafilm לדבוק בתחתית הצלחת. בועות אוויר יוסרו באופן ידני עם kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל coverslip להיות מוכתם, פיפטה μl 100 ירידה של פתרון ההכלאה המכיל דגי חללית של ריבית על השוויafilm בתא המכתים. בדיקת FISH המנייה מדוללת עם פוראמיד 25% עד 60% במאגר ההכלאה (1x SSC, 100 מ&quot;ג / המ&quot;ל dextran סולפט, 1 מ&quot;ג / מיליליטר השמרים tRNA, מורכב riboside vanadyl 5mm, פוראמיד 25-60%) לריכוז עבודה של 0.2 מיקרומטר. שים לב שכמות פוראמיד צריכה להיות מותאמת לבדיקה מסוימת בשימוש, והוא נוכח באותו הריכוז כמו בחיץ לשטוף SSC (ראה שלב 3.3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip מונח בפני צד תא למטה, אל פתרון הדגים בתא המכתים וטופח ל5-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified כגון רקמת תרבות חממה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה והרכבת הדגימות המוכתמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את אזור רחצה חופשיה RNase, נשכבה רצועת parafilm על משטח שטוח ברמה, כגון שולחן מעבדה. כדי להבטיח שparafilm הוא שטוח ורטוב המשטח ישר, הנח parafilm על גבי ולהסיר באופן ידני את כל בועות אוויר עם kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקאמרי הוא המכתיםהוסר מהחממה ומונח על משטח שטוח ברמה. את coverslips מכן רחף על ידי pipetting כ 500 μl של חיץ לשטוף דגים ליד הקצה של כל coverslip. הפתרון יוצג ב- בין coverslip וparafilm באמצעות פעולת נימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל coverslip, 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף (1x SCC עם פוראמיד 25-60%, ראה שלב 3.3.3) הוא pipetted על parafilm אזור הכביסה (ראה שלב 3.4.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים, את coverslips יוסרו מהתא המכתים וכל אחד ממוקם על הירידה של חיץ לשטוף והדגרה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. תהליך הכביסה חוזר 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות זכוכית נשטפות עם אתנול 70%, ומיובשים בkimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל coverslip, 25 μl של פתרון תלייה (DAPI Fluoromount G, הדרום יוטק) היא pipetted לשקופית. שים לב שפתרון זה מכיל 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ה-DNA שכתמים ומאפשר הדמיה של גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> USIמלקחיים וkimwipes ng, החלק האחוריים של coverslip הם מיובשים וחיץ לשטוף דגים עודף נמחק בלי ייבוש המדגם. אז כל coverslip ממוקם צד תא פונה כלפי מטה, על הירידה של פתרון גובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות רכובות מסומנות ויכולות להיות חנות ב 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. הדמיה וכימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ epifluorescence משמש לתמונת התאים הבאים מכתים דגים. תא transfected יכול להיות מובחן מתאי untransfected ידי אות פלואורסצנציה בהירה בערוץ המתאים. באופן אידיאלי, כל שדה שנרכש, מכיל גם תא untransfected לשמש כדי לקבוע את קרינת הרקע לכימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תמונות שדה של הדג וערוץ DAPI הם נרכשים. בנוסף, אם התאים הם שיתוף צבעוניים עם סמנים חלבוניים, תמונה של ערוץ immunofluorescence גם רכשה. שימו לב שחילוץ digitonin יכול לשמש גםכדי להמחיש הריבוזומים ER-כפותים וחלבונים 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח שאת עוצמות הקרינה בין השדות ניתן להשוות, את זמן החשיפה לכל ערוץ צריך להישאר קבוע עבור כל קבוצה של ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב כדי לוודא שאת עוצמות הניאון בין התאים בcoverslips השונה ניתן להשוות, השינויים מהיום ליום בעוצמת epiluminescence או ריקבון באות הדג צריכים להיות ממוזערים על ידי הדמיה את כל coverslips בפגישה אחת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות. כדי לכמת את הכמות של mRNA שהוא מקומית בחדר המיון, אנחנו משתמשים בתוכנת אלמנט ש&quot;ח ניקון. עם זאת תוכנת ניתוח תמונה אחרת כגון ImageJ ניתן להשתמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי ניקון ש&quot;ח אלמנט תמונת הניתוח, פריפרית התא ואת הגרעין מתואר כאזור נפרד של תחומי עניין (Rois). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל החזר על השקעה, עוצמת הניאון (אני T לעצמת התא המוחלטת, ואני N כדיעצמה גרעינית) והאזור (T ו N) נרשמות ומיוצאות לגיליון Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תמונה, עוצמת ניאון הרקע (אני B) נקבעה על ידי הקלטת האינטנסיביות של תאים לא transfected. אם (A) רמות ה-mRNA פולי הם נתחו, אזור תא חינם נבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסכום הכולל של חדר מיון (בתאים שחולצו) או cytoplasmic (בתאי unextracted) פלואורסצנטי מחושב על ידי הנוסחא: [ט] [אני לא - אני B] - [N] [N - אני B] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העוצמת המכתימה הגרעינית גם ניתן לחשב ומשמשת כבקרה פנימית בין טיפולים שונים. מאז גרעינים אינם מושפעים מטיפול digitonin 17 או שיבוש הריבוזום 11, הסכום של mRNA הגרעיני צריך להישאר קבוע בין כל אחד מטיפולים אלה. כדי לחשב פלואורסצנטי הגרעיני הנוסחא הבאה משמשת: [N] [N - אניB] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האחוזים של mRNA cytoplasmic שהוא ER-ממוקד יכולים להיות מחושבים על ידי לקיחה את הקרינה הממוצעת ER של תאים חולצו 30-40 (ראה 4.2.4) מחולקת בפלואורסצנטי cytoplasmic הממוצע מתאי unextracted 30-40 (שוב ראה 4.2.4) . זה קריטי, כי התאים שחולצו וunextracted מוכנים, מוכתמים וצלמו במקביל. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+%28SRP%29+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li>
<li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+%28SRP%29+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).</li>
<li>Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+homolog+of+SEC61p+and+SECYp+is+associated+with+ribosomes+and+nascent+polypeptides+during+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation.</a> Cell. 71, 489-503 (1992).</li>
<li>Grlich, D., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+translocation+into+proteoliposomes+reconstituted+from+purified+components+of+the+endoplasmic+reticulum+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane.</a> Cell. 75, 615-630 (1993).</li>
<li>Milcarek, C., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+polyribosomes+in+HeLa+cells%3A+association+of+polyadenylic+acid+with+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes.</a> J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).</li>
<li>Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+association+of+messenger+RNA+with+microsomal+membranes+in+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts.</a> J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).</li>
<li>Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+association+of+messenger+RNA+labeled+in+the+presence+of+fluoroorotate+with+membranes+of+the+endoplasmic+reticulum+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver.</a> J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).</li>
<li>Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+mRNA+on+the+endoplasmic+reticulum+membranes+after+in+vivo+disassembly+of+polysomes+by+an+inhibitor+of+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation.</a> J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).</li>
<li>Kruppa, J., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+poly+A%28%2B%29+messenger+RNA+from+rat+liver+rough+microsomes+upon+disassembly+of+bound+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes.</a> J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).</li>
<li>Adesnik, M., Maschio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+specific+classes+of+messenger+RNA+into+free+and+membrane-bound+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes.</a> Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).</li>
<li>Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p180+Promotes+the+Ribosome-Independent+Localization+of+a+Subset+of+mRNA+to+the+Endoplasmic+Reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum.</a> PLoS Biol. 10, e1001336(2012).</li>
<li>Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+ribosome+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of ribosome functions.</a> Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).</li>
<li>Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+translation+in+eukaryotic+systems+by+harringtonine%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine.</a> Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).</li>
<li>Weeks, D. P., Baxter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+peptide-chain+initiation+by+2-%284-methyl-2%2C6-dinitroanilino%29-N-methylpropionamide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.</a> Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).</li>
<li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147, 789-802 (2011).</li>
<li>Lerner, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+and+translation+of+mRNAs+encoding+soluble+proteins+on+membrane-bound+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes.</a> RNA. 9, 1123-1137 (2003).</li>
<li>Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+protein+import+in+permeabilized+mammalian+cells+requires+soluble+cytoplasmic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors.</a> J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).</li>
<li>Lcuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+implications+of+mRNA+localization+pathways+in+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).</li>
<li>Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mRNA+nuclear+export+kinetics+in+mammalian+cells+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection.</a> J Vis Exp. 46, e2387(2010).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הלוקליזציה של mRNAs לאתרי subcellular שונים, באמצעות האינטראקציה של תמלילים עם חלבוני לוקליזציה mRNA, היא תופעה נפוצה חשובה למיון הנכון של חלבונים ליעד הסופי שלהם, ולכוונון העדין של ביטוי גנים לדרישות המקומיות של subcellular אזור 19,20. באמצעות הבדיקה שתואר כאן, אנו שבנו לבחון את השאלה האם mRNAs שמקודד חלבוני הפרשה יכול להישמר בחדר המיון בנוכחותו או היעדריו של הריבוזומים או תרגום. ואכן, מצא כי קבוצת מש...

באאוקריוטים, קידוד ה-mRNA מופרש וחלבוני קרום יכולים להיות ממוקדים לחדר מיון השיתוף translationally ידי 1,2 חלקיק הכרת האות ואפשר לקיים ER דרך האינטראקציות הישירות בין הריבוזומים וtranslocons במהלך תרגום 3,4. עם זאת, האם יכול להיות ממוקד mRNAs ומתוחזק על ER העצמאי או הריבוזומים או תרגום לא היה ברור עד לאחרונה. מחקרים קודמים ניסו לענות האם יש קשר תרגום עצמאי mRNA עם ER באמצעות טכניקות חלוקה תאיות. בגלל תנאים כימיים קשים נדרשו לנתק את הריבוזומים משלפוחית ​​ER נגזר, שעשוי לשבש את ה-mRNA-ER העדינה פוטנציאלי העמותה, מחקרים אלה לא היו חד משמעיים, הוכחה ל5-8 ונגד 9,10 עיגון ריבוזומלי עצמאי של mRNA לחדר המיון . כדי להתגבר על בעיות אלו פתחנו פרוטוcol לבודד ותמונה mRNAs ER-כפות. הליך זה כרוך טיפול חילוץ קל, שמסיר ביעילות את כל תוכן cytoplasmic של התא (כולל mRNAs אינו ER-כפות) תוך שמירה על מורפולוגיה ER וכל המולקולות הקשורים אליו. באמצעות פרוטוקול זה אנו מראים כי קבוצת משנה של mRNAs ממוקדות ולאחר מכן שמרה על חדר המיון באופן עצמאי או תרגום של הריבוזומים 11.

ויזואליזציה של mrnas לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

באאוקריוטים, רוב RNAs השליח (mRNAs) המקודדים מופרשת והחלבונים בממברנה מותאמת לשפה מקומיים על פני השטח של reticulum endoplasmic (ER). עם זאת, להדמיה של mRNAs אלה יכול להיות מאתגרות. זה נכון במיוחד כאשר רק חלק קטן מן mRNA הוא ER-משויך והפצתם לאברון זה הנה חסום על ידי תמלילים שאינם ממוקדים (כלומר &quot;חופשי&quot;). על מנת לפקח mRNAs ER-נלווה, פתח שיטה שבה תאי מטופלים עם חשיפה קצרה לפתרון חילוץ digitonin כי סלקטיבי permeabilizes קרום הפלזמה, ובכך מסיר את תוכן cytoplasmic, תוך שמירה על שלמות ER . כאשר שיטה זו היא בשילוב עם ניאון כלאה באתר (FISH), אפשר לחזות באופן ברור mRNAs ER-כפות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באמצעות פרוטוקול זה המידה של ER-עמותה לאו תעתיקי תפזורת פולי () או mRNAs הספציפי ניתן להעריךואפילו לכימות. בתהליך, אפשר להשתמש בבדיקה זו כדי לחקור את טבעו של אינטראקציות mRNA-ER.

כדי לקבוע את האחוז של mRNA שהוא ER-משויך, COS-7 תאים שtransfected עם פלסמידים שהכילו phosphatase אלקליין השליה (ALPP) או ציטוכרום P450-8B1 (CYP8B1) היה או חילוץ עם digitonin ולאחר מכן קבוע, או ישירות קבוע (ראה תרשים 1, להשוות &quot;Unextracted Ctrl&quot; כדי &quot;לשלוף Ctrl&quot;). פלואורסצנטי לא גרעיני כומתה בשתי דגימות והשבריר של mRNA ER-משויך מחושב (איור 2). הנתונים שלנו מראים בבירור כי לשניהם ALPP וCYP8B1, כ 60% מmR...

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי הניאון<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לזהות או פולי תפזורת () mRNA או תעתיקים ספציפיים.

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

מטרת הליך זה היא לדמיין RNA שליח הקשור לרטיקולום האנדופלזמי או ל-er. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של תאי תרבית רקמת יונקים על תלושי כיסוי. השלב השני של ההליך הוא לטפל בתאים עם מאגר מיצוי כדי להסיר mRNA ציטופלזמי שאינו קשור לחדר המיון.השלבים הבאים הם לתקן במהירות את התאים ולצבוע את ה-mRNA על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרה. השלבים האחרונים הם לדמות ולאחר מכן לכמת את כמות הקרינה הקשורה ל-er. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות כיצד mRNAs קשורים לפני השטח של אברון זה בתנאים שונים.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות ביולוגיות מרכזיות של תאים כגון האם ניתן לשמור על mRNA המקודדים חלבונים מפרישים על פני השטח, ללא תלות בריבוזומים או בסינתזת חלבונים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהיא כרוכה בכמה שלבים מסובכים של מניפולציה סלולרית. זרע תאי תרבית הרקמה על החלקות כיסוי שטופלו בחומצה לפחות יום אחד לפני הניסוי עולה שבעה ובשל תאי OS הם שתי אפשרויות מתאימות מכיוון שיש להם ייצור חלבון מופרש גבוה ו-ERs מוגדרים היטב.אם נבדק MR NA אקסוגני, יש להעביר את התאים יום אחד לאחר הזריעה ולאחר מכן לדגור על התאים למשך 18 שעות נוספות כדי לאפשר MR. ביטוי NA. ביום הניסוי. כדי להשיג יעילות מיצוי גבוהה, התאים לא צריכים לעלות על שטף של 80% על החלקת הכיסוי כדי לזהות אם ניתן לטפל ב-mRNAs עם ה-ER ללא תלות בתאי תרגום באמצעות חומרים המשבשים את האינטראקציה בין ריבוזומים ל-mRNA בחומרים אלה או באמצעי בקרה לתאים 30 דקות לפני החילוץ.במקרה זה משתמשים במעכבי תרגום, מיצין טהור והומו הרינגטון ב או HHT. התחל בחימום תמיסת מיצוי טרייה המכילה טונין חפור וחוצץ עבודה של XCHO אחד עד 37 מעלות צלזיוס. הגדר גוש חימום ל 40 מעלות צלזיוס והכנס גוש מתכת הפוך ליצירת משטח עבודה שטוח.הרטיבו את גוש המתכת במים, ואז כסו אותו בחתיכת פרפורם טרייה והחליקו את כל הבועות באמצעות כפפות נטולות RNA ורקמות נטולות מוך. לאחר מכן, עבור כל זוג פתקי כיסוי, הכינו צלחת שש בארות לשטיפה וקיבוע התאים לארבע בארות. הוסף שני מיליליטר של מאגר CHO מחומם לשתי הבארות האחרונות.הוסף שני מיליליטר מתמיסת הקיבוע. לאחר מכן אחסן את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס עד הצורך. על גוש החימום, הניחו טיפה של 100 מיקרוליטר מתמיסת החילוץ עבור כל החלקת כיסוי של תאים לעיבוד.כעת בעזרת מלקחיים של תכשיטן, הרם פתק כיסוי מצופה תא וטבל אותו בבארות הראשונה והשנייה המכילות מאגר CHO. זה שוטף את מצע הגידול. לאחר מכן הסר במהירות את המאגר העודף מהצד האחורי של החלקת הכיסוי.והנח בקצרה את צד תא החלקת הכיסוי כלפי מטה על תמיסת החילוץ. לאחר 10 שניות, העבר את צד תא החלקת הכיסוי כלפי מעלה אל מאגר הקיבוע שבו הוא אמור להישאר לפחות 15 דקות. שלב מיצוי התאים חיוני להסרת כל ה-mRNA הפלסטי של cyop שאינו קשור ל-ER.בנוסף, הכן תלוש כיסוי בקרה שבו התאים מקובעים ללא החילוץ. שלב אחרי קיבוע. שטפו את תאי הבקרה הללו שחולצו פעמיים עם PBS ולאחר מכן חלחלו ב-PBS וב-TRITTON X 100.למרות שזה לא נדרש, יש לשטוף את החפירה בתאים שחולצו גם באותה תמיסת PBS וטריטון כדי להפחית את הקרינה ברקע לאחר חדירת התאים. שטפו את השקופיות פעמיים עם PBS כדי להסיר את הקיבוע וחומר הניקוי. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם 60% fide במאגר נתרן ציטראט חד פעמי או SSC.עם זאת, אם נעשה שימוש בבדיקת דג אוליגו DT כדי לצבוע את כל התאים, poly mRNA מפחית את רמת ה-fide ל-25%לאחר מכן, הכינו את מאגר ההכלאה עם בדיקת הדגים. לדלל את בדיקת הדג ל-0.2 מיקרומולר באותו ריכוז של פידה במאגר הכלאה. כעת הכינו את תא הצביעה.ממלאים את תחתית צלחת פטרי בגודל 150 מילימטר במים. ואז צף חתיכת פרפורם על המים והפוך את המנה על פיה. סרט הפרה יידבק לתחתית המנה כשהמים בורחים.אם יש בועות אוויר, הסר אותן עם כפפות ורקמות נטולות מוך לכל פיפטה החלקה של 100 מיקרוליטר מתמיסת ההכלאה המכילה את בדיקת הדגים על סרט הפרה. כעת הנח את צד תא החלקת הכיסוי כלפי מטה על התמיסה. לבסוף דגרו את החדר למשך חמש עד 24 שעות בתא לח וחם.לפני שנגמר זמן הכתמת הדגים, הכינו אזור כביסה ללא RNA, רטובים יותר מפלס משטח שטוח במים וכסו אותו ברצועות פרם. הסר את כל בועות האוויר בעזרת כפפות וטישו נטול פשתון. בסיום הצביעה, העבירו את החדר לאזור העבודה עבור כל החלקת כיסוי פיפטה מיליליטר אחד של מאגר כביסה על אזור הכביסה.סרט פרה להעברת החלקות הכיסוי פיפטה ראשונה חצי מיליליטר של מאגר שטיפת דגים ליד קצה כל החלקת כיסוי. הנוזל יימשך מתחת להחלקת הכיסוי על ידי פעולה נימית. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הסר את החלקות הכיסוי מהתא והניח אותם על טיפות מאגר הכביסה.והמתינו חמש דקות. חזור על טכניקת כביסה זו שלוש פעמים נוספות. שימוש בטיפות טריות של מיליליטר אחד של מאגר כביסה על אזור הכביסה.בינתיים, נקו מגלשות זכוכית עם 70% אתנול וייבשו אותן עם טישו נטול מוך. לאחר מכן עבור כל החלקת כיסוי, מרחו 25 מיקרוליטר של תמיסת הרכבה DPI על מגלשה בעזרת מלקחיים, הרם פתק כיסוי וייבש את הצד האחורי שלו עם רקמה נטולת מוך כדי להסיר עודפי מאגר כביסה. לאחר מכן העבר את צד תא החלקת הכיסוי כלפי מטה על טיפת תמיסת ההרכבה.ניתן לאחסן את השקופיות שהושלמו בארבע מעלות צלזיוס עד להדמיית עלותן. שבעה תאים שהועברו עם פלסמידים המכילים פוספטאז אלקליין שליה או ציטוכרום P 4 58 B אחד חולצו עם טונין ולאחר מכן תוקנו או תוקנו ישירות כדי לקבוע את אחוז ה-mRNA הללו הקשור ל-ER. הקרינה הלא גרעינית כומתה בשתי הדגימות וחלק ה-mRNA הקשור ל-ER חושב עבור שני ה-mRNA.כ-60% מהמקטע הציטופלזמי היה קשור ל-ER כדי לנטר את קשר ה-ER של תעתיקים אלה. לאחר עלויות טרנספטציה של דיסוציאציה של ריבוזום שבעה תאים טופלו באמצעי ביקורת, pur MYCIN או HHT, ולאחר מכן חולצו טונין ו-mRNA קבוע. הצביעה גילתה כי ה-A LPP, אך לא ה-CYP 8 P mRNA אחד נשאר קשור ל-ER לאחר שיבוש הריבוזום.כימות mRNA תמך בתצפית זו וחשוב מכך הראה שרמת ה-mRNA הגרעיני הייתה עקבית בכל הדגימות. נתונים אלה חושפים כי תת-קבוצה של mRNAs ממוקדי ER, כגון תעתיק A LPP, נשמרת על פני השטח של ה-ER לאחר פירוק ריבוזום. באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים להתחיל לחקור כיצד mRNAs שונים התמקמו בתאים תת-תאיים נפרדים כגון הרשתית האנדופלזמית בשילוב עם מבחנים אחרים המשמשים לניתוח ייצוא גרעיני mRNA.ניתן להשתמש בהליך זה כדי לחקור את המיקוד הראשוני של mRNAs שסונתזו לאחרונה לפני השטח של ה-er.

visualization-endoplasmic-reticulum-localized-mrnas-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

ב חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים על coverslips מיקרוסקופ מאפשר הדמיה של לוקליזציה חלבון.

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה משויך הקרום החיצוני מיטוכונדריה. אנו מתארים הליך חלוקה subcellular שמטרתה בידוד של שמרי המיטוכונדריה עם mRNAs הקשורים אליו והריבוזומים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים שגודל בתנאים מגוונים במטרה לחשוף את המנגנונים של לוקליזציה mRNA ותרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.

בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

כאן, אנו מציגים עבור צבע רב לוקליזציה של חלבוני ממברנה בודדת פרוטוקול organelles של תאים חיים. כדי לצרף fluorophores, משמשים החלבונים תיוג עצמי. חלבונים, במיקום שונה ממברנות תאי האברון המשמש אותו, יכול להיות מקומי עם דיוק של ~ 18 ננומטר.

צבע רב לוקליזציה מיקרוסקופיה של חלבוני ממברנה בודדת ב- Organelles של תאים בתרבית של חיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

הצורך בגישות חדשות לחקר אתרי מגע עם ממברנות (MCS) גדל עקב העניין הגובר בחקר מבנים תאיים אלה ומרכיביהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיות מיקרוסקופיה שהיו זמינות בעבר כדי לזהות ולכמת קומפלקסים של חלבונים תוך-אברונים ובין אברונים השוכנים ב-MCS.

ויזואליזציה וכימות של אינטראקציות חלבון תוך-אברוני אנדוגניות באתרי קשר של ER-מיטוכונדריה על ידי מבחני קשירת קרבה

ככל שהתאים להגיע confluency, הם חייבים להיות subcultured או passaged. סרט הווידאו הזה תדגים נוהל subculturing הן חסיד ותאי ההשעיה.

Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

למד שיטה לויזואליזציה של mRNAs המקומצים ברטיקולום האנדופלזמי בתאי יונקים באמצעות היברידיזציה in situ פלואורסצנטית. טכניקה זו מאפשרת הבחנה בין mRNA ציטופלזמי ל-ER-bound וכימות פלואורסצנציה לחקר דינמיקת mRNA.

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

גלה סרטונים נוספים