ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

מטרת הליך זה היא לדמיין RNA שליח הקשור לרטיקולום האנדופלזמי או ל-er. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של תאי תרבית רקמת יונקים על תלושי כיסוי. השלב השני של ההליך הוא לטפל בתאים עם מאגר מיצוי כדי להסיר mRNA ציטופלזמי שאינו קשור לחדר המיון.

השלבים הבאים הם לתקן במהירות את התאים ולצבוע את ה-mRNA על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרה. השלבים האחרונים הם לדמות ולאחר מכן לכמת את כמות הקרינה הקשורה ל-er. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות כיצד mRNAs קשורים לפני השטח של אברון זה בתנאים שונים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות ביולוגיות מרכזיות של תאים כגון האם ניתן לשמור על mRNA המקודדים חלבונים מפרישים על פני השטח, ללא תלות בריבוזומים או בסינתזת חלבונים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהיא כרוכה בכמה שלבים מסובכים של מניפולציה סלולרית. זרע תאי תרבית הרקמה על החלקות כיסוי שטופלו בחומצה לפחות יום אחד לפני הניסוי עולה שבעה ובשל תאי OS הם שתי אפשרויות מתאימות מכיוון שיש להם ייצור חלבון מופרש גבוה ו-ERs מוגדרים היטב.

אם נבדק MR NA אקסוגני, יש להעביר את התאים יום אחד לאחר הזריעה ולאחר מכן לדגור על התאים למשך 18 שעות נוספות כדי לאפשר MR. ביטוי NA. ביום הניסוי. כדי להשיג יעילות מיצוי גבוהה, התאים לא צריכים לעלות על שטף של 80% על החלקת הכיסוי כדי לזהות אם ניתן לטפל ב-mRNAs עם ה-ER ללא תלות בתאי תרגום באמצעות חומרים המשבשים את האינטראקציה בין ריבוזומים ל-mRNA בחומרים אלה או באמצעי בקרה לתאים 30 דקות לפני החילוץ.

במקרה זה משתמשים במעכבי תרגום, מיצין טהור והומו הרינגטון ב או HHT. התחל בחימום תמיסת מיצוי טרייה המכילה טונין חפור וחוצץ עבודה של XCHO אחד עד 37 מעלות צלזיוס. הגדר גוש חימום ל 40 מעלות צלזיוס והכנס גוש מתכת הפוך ליצירת משטח עבודה שטוח.

הרטיבו את גוש המתכת במים, ואז כסו אותו בחתיכת פרפורם טרייה והחליקו את כל הבועות באמצעות כפפות נטולות RNA ורקמות נטולות מוך. לאחר מכן, עבור כל זוג פתקי כיסוי, הכינו צלחת שש בארות לשטיפה וקיבוע התאים לארבע בארות. הוסף שני מיליליטר של מאגר CHO מחומם לשתי הבארות האחרונות.

הוסף שני מיליליטר מתמיסת הקיבוע. לאחר מכן אחסן את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס עד הצורך. על גוש החימום, הניחו טיפה של 100 מיקרוליטר מתמיסת החילוץ עבור כל החלקת כיסוי של תאים לעיבוד.

כעת בעזרת מלקחיים של תכשיטן, הרם פתק כיסוי מצופה תא וטבל אותו בבארות הראשונה והשנייה המכילות מאגר CHO. זה שוטף את מצע הגידול. לאחר מכן הסר במהירות את המאגר העודף מהצד האחורי של החלקת הכיסוי.

והנח בקצרה את צד תא החלקת הכיסוי כלפי מטה על תמיסת החילוץ. לאחר 10 שניות, העבר את צד תא החלקת הכיסוי כלפי מעלה אל מאגר הקיבוע שבו הוא אמור להישאר לפחות 15 דקות. שלב מיצוי התאים חיוני להסרת כל ה-mRNA הפלסטי של cyop שאינו קשור ל-ER.

בנוסף, הכן תלוש כיסוי בקרה שבו התאים מקובעים ללא החילוץ. שלב אחרי קיבוע. שטפו את תאי הבקרה הללו שחולצו פעמיים עם PBS ולאחר מכן חלחלו ב-PBS וב-TRITTON X 100.

למרות שזה לא נדרש, יש לשטוף את החפירה בתאים שחולצו גם באותה תמיסת PBS וטריטון כדי להפחית את הקרינה ברקע לאחר חדירת התאים. שטפו את השקופיות פעמיים עם PBS כדי להסיר את הקיבוע וחומר הניקוי. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים עם 60% fide במאגר נתרן ציטראט חד פעמי או SSC.

עם זאת, אם נעשה שימוש בבדיקת דג אוליגו DT כדי לצבוע את כל התאים, poly mRNA מפחית את רמת ה-fide ל-25%לאחר מכן, הכינו את מאגר ההכלאה עם בדיקת הדגים. לדלל את בדיקת הדג ל-0.2 מיקרומולר באותו ריכוז של פידה במאגר הכלאה. כעת הכינו את תא הצביעה.

ממלאים את תחתית צלחת פטרי בגודל 150 מילימטר במים. ואז צף חתיכת פרפורם על המים והפוך את המנה על פיה. סרט הפרה יידבק לתחתית המנה כשהמים בורחים.

אם יש בועות אוויר, הסר אותן עם כפפות ורקמות נטולות מוך לכל פיפטה החלקה של 100 מיקרוליטר מתמיסת ההכלאה המכילה את בדיקת הדגים על סרט הפרה. כעת הנח את צד תא החלקת הכיסוי כלפי מטה על התמיסה. לבסוף דגרו את החדר למשך חמש עד 24 שעות בתא לח וחם.

לפני שנגמר זמן הכתמת הדגים, הכינו אזור כביסה ללא RNA, רטובים יותר מפלס משטח שטוח במים וכסו אותו ברצועות פרם. הסר את כל בועות האוויר בעזרת כפפות וטישו נטול פשתון. בסיום הצביעה, העבירו את החדר לאזור העבודה עבור כל החלקת כיסוי פיפטה מיליליטר אחד של מאגר כביסה על אזור הכביסה.

סרט פרה להעברת החלקות הכיסוי פיפטה ראשונה חצי מיליליטר של מאגר שטיפת דגים ליד קצה כל החלקת כיסוי. הנוזל יימשך מתחת להחלקת הכיסוי על ידי פעולה נימית. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הסר את החלקות הכיסוי מהתא והניח אותם על טיפות מאגר הכביסה.

והמתינו חמש דקות. חזור על טכניקת כביסה זו שלוש פעמים נוספות. שימוש בטיפות טריות של מיליליטר אחד של מאגר כביסה על אזור הכביסה.

בינתיים, נקו מגלשות זכוכית עם 70% אתנול וייבשו אותן עם טישו נטול מוך. לאחר מכן עבור כל החלקת כיסוי, מרחו 25 מיקרוליטר של תמיסת הרכבה DPI על מגלשה בעזרת מלקחיים, הרם פתק כיסוי וייבש את הצד האחורי שלו עם רקמה נטולת מוך כדי להסיר עודפי מאגר כביסה. לאחר מכן העבר את צד תא החלקת הכיסוי כלפי מטה על טיפת תמיסת ההרכבה.

ניתן לאחסן את השקופיות שהושלמו בארבע מעלות צלזיוס עד להדמיית עלותן. שבעה תאים שהועברו עם פלסמידים המכילים פוספטאז אלקליין שליה או ציטוכרום P 4 58 B אחד חולצו עם טונין ולאחר מכן תוקנו או תוקנו ישירות כדי לקבוע את אחוז ה-mRNA הללו הקשור ל-ER. הקרינה הלא גרעינית כומתה בשתי הדגימות וחלק ה-mRNA הקשור ל-ER חושב עבור שני ה-mRNA.

כ-60% מהמקטע הציטופלזמי היה קשור ל-ER כדי לנטר את קשר ה-ER של תעתיקים אלה. לאחר עלויות טרנספטציה של דיסוציאציה של ריבוזום שבעה תאים טופלו באמצעי ביקורת, pur MYCIN או HHT, ולאחר מכן חולצו טונין ו-mRNA קבוע. הצביעה גילתה כי ה-A LPP, אך לא ה-CYP 8 P mRNA אחד נשאר קשור ל-ER לאחר שיבוש הריבוזום.

כימות mRNA תמך בתצפית זו וחשוב מכך הראה שרמת ה-mRNA הגרעיני הייתה עקבית בכל הדגימות. נתונים אלה חושפים כי תת-קבוצה של mRNAs ממוקדי ER, כגון תעתיק A LPP, נשמרת על פני השטח של ה-ER לאחר פירוק ריבוזום. באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים להתחיל לחקור כיצד mRNAs שונים התמקמו בתאים תת-תאיים נפרדים כגון הרשתית האנדופלזמית בשילוב עם מבחנים אחרים המשמשים לניתוח ייצוא גרעיני mRNA.

ניתן להשתמש בהליך זה כדי לחקור את המיקוד הראשוני של mRNAs שסונתזו לאחרונה לפני השטח של ה-er.