Name: Assay Chemotaxis סי אלגנס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: למדו להעריך כימוטקסיס ב-Caenorhabditis elegans באמצעות שיטה פשוטה וזולה. השיטה מודדת את התפלגות התולעים בתגובה לתרכובות שונות ומספקת מדד כימוטקטי להשוואה בין זנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למדעי חיים ופקולטה לאמנויות ומדעים באוניברסיטה של ​​המלכה למימון עבודה זו. כמו כן, אנו מודים למעבדת צ&#39;ין-סאנג במתן החומרים הכימיים הדרושים, הציוד והתמיכה טכנית. אנו מודים גם QGEM 2011, טוני במיוחד הוא על תרומתו לדיון.

1. הכנה / שטיפת התולעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנכרן את התולעים עד 11 בוגרים צעירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיליליטר פיפטה 2 מתוך סל S על צלחת Chemotaxis ס&quot;מ 5 של מבוים תולעים שפשוט ניקית את הדשא של OP50 E. coli. הטה את הצלחת לפי צורך כדי להבטיח את התולעים נשטפים מפני שטח הצלחת לתוך המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 מיליליטר פיפטה של ​​הפתרון בסל תולעת-S לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 10 שניות תוך שימוש בPicoFuge 6,600 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב סל S, משאיר את הכדור ללא הפרעה של תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון 1 S מ&quot;ל בסל לצינור microcentrifuge, להפוך כמה פעמים כדי לשטוף את התולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.4-1.6 עוד שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 10 שניות פעם החמישית, הפעם aspirating supernatant לנפח סופי של CA. 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 2 של התולעים על גבי צלחת NGM על מנת להבטיח שיש בין 50 ל 250 תולעים בכל דגימת μl 2. להתאיםהריכוז של תולעים בסל S לפי צורך על ידי resuspending את התולעים בנפח קטן יותר או גדול יותר של סל S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתולעים בassay מייד לאחר שטיפה את התולעים עד שעה 1. </li></ol> 2. הכנת לוחות המבחן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סימון התחתון של צלחת 5 ס&quot;מ, לחלק את המנה ל 4 רבעים שווים. ניתן להשתמש בו אגר chemotaxis או NGM. מינימום של 3 ניסויים נדרשים לזן גנטי הנבדקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את העיגול ברדיוס של 0.5 ס&quot;מ סביב המוצא (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את נקודה בכל רבע עם או &quot;T&quot; עבור &quot;מבחן&quot; או &quot;C&quot; עבור &quot;בקרה&quot;, להבטיח כי באתרים הם במרחק שווה ממקורו ואחד את השני. הנקודות חייבים להיות לפחות 2 ס&quot;מ מהמקור. סמן את הרביעים שמאליים והימניים תחתון כעליונים רביעים מבחן וצד ימין למעלה ורביעים שמאליים תחתונים כקבוצת ביקורת (איור 1). </li></ol> 3. פועל Assay </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרון על ידי שילוב של בדיקת כמויות שווה של מתחם הבדיקה ו0.5 מ &#39;אזיד (הרדמה משמשת לעצור את התולעים עם הגיע ברבע). מערבבים את הפתרון על ידי שילוב של שליטת הממס משמש לדילול מתחם הבדיקה עם אזיד M 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 2 מפתרון התולעת (שהוכן ב1.8) מהגלולה על המקור (שבו שתי השורות מצטלבות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר מכן, פיפטה μl 2 של פתרון המבחן על שני האתרים &quot;T&quot;. כמו כן, פיפטה את אותה הכמות של תמיסת הבקרה על גבי שני האתרים &quot;C&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתולעת ואת טיפות odorant כבר נספגו באגרו, החלף את המכסים ולהפוך את הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 60 דקות, הנח את התולעים ב4 ° C בחממה. להסיר רק צלחת מן החממה, כאשר ניתן לספור אותו. השארת תולעים בטמפרטורת חדר עשויה לאפשר להם לגייס שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את מספר התולעים בכל רבע שחצה את circ הפנימי לחלוטיןLe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.2-3.6 באמצעות תמיסת הבקרה בשני ורביעי מבחן שליטה. זה ישמש כצלחת שליטה. שלוש צלחות כאלה צריכים להיעשות ולרוץ לשמש כשליטה מתאימה. </li></ol> 4. לפרש את הציונים / קביעת מדד Chemotaxis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מדד chemotaxis באמצעות משוואה 1. זו תניב מדד chemotactic בין -1.0 ו 1.0. </li></ol> (1) Chemotaxis מדד = (# תולעים בשני רביעי מבחן - # תולעים בשני רביעי בקרה) / (סה&quot;כ # מוורמס הבקיע) ציון 1.0 מציין משיכה מקסימלי לעבר המטרה ומייצג 100% מהתולעים המגיעים ברביעים המכילים את היעד הכימי. מדד -1.0 מעיד על דחייה מקסימלי. שיטות assay דומות כבר מועסקות 3 (טבלת 1). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דווח על ממוצע Chemotaxiשל מדד (CI) ושגיאת תקן של משמעות (SEM). לבצע מבחן t של סטודנט השוואת הנתונים מצלחות הבדיקה ובקרה. </li></ol>

<ol><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li>
<li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+preference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li>
<li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Positive+Butanone+Learning%2C+Short-term%2C+and+Long-term+Associative+Memory+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).</li>
<li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+chemotaxis+responses%3A+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li>
<li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467(2008).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li>
<li>Hart, A. C. Behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHart%2C+AC+%22WormBook%22">WormBook</a>. , (1895).</li>
</ol>

יש לנו מה למסור.

Chemotaxis, למרות שנשלט על ידי מערכת מורכבת של מנגנונים עצביים וסלולריים, יכול להיות בקלות ובאופן אובייקטיבי לכמת באמצעות מבחני chemotaxis. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר מכל מבחני, יש לנקוט בצעדים קריטיים מסוימים. ראשית, בימוי התולעים הוא חיוני במניב תוצאות ניסוי עולות בקנה אחד. תולעים בשלבי חיים שונים מתנהגים בצורה שונה 13; תולעים בשלב כל כך מעורבים עשויים להטות תוצאות ניסוי. שנית, להבטיח לכל א &#39; coli הוא לשטוף את התולעים הוא קריטי, כשיירי חיידקים עלול...

וורד פותח לראשונה בשנת 1973 assay chemotaxis 5, ומאז יש לו יישומים מרחיקים לכת. נוירוביולוגיה היא תחום אחד שיש לו יתרון בשימוש במגוון רחב של מבחני chemotaxis. הסתגלות חוש הריח, צורה פשוטה של למידה וזיכרון, הודגמה בג elegans באמצעות מבחני chemotaxis 6. הם גם היו בשימוש כדי להראות שג elegans יכול לפתח אתנול סובלנות-תוצאה שמדגימה את הגמישות התנהגותית של התולעים לא רק, אבל זה גם מראה כי התולעים יכולים להיות שימושיים מאוד במחקר של תלות באלכוהול בבני אדם 3. מבחני אפילו פותחו כדי להדגים את יכולתו של ג elegans לאחסון קצר וזיכרון לטווח ארוך על ידי מראה כי עמותות מבוצעות על ידי התולעים בין chemoattractants ומזון (OP50) 7. בנוסף, בהתחשב במידע הרב זמין כרגע לגבי ג elegans הגנום, chemotaxiהתנהגותו של ג של elegans השתנה פעמים רבות על ידי גרימת מוטציות 1,8. זה מאפשר להרבה אפשרויות הנדסיות מרגשות, כגון פיתוח של ג elegans ככלי bioremediation. לכן, מאז הפיתוח הראשוני של assay chemotaxis בשנת 1973, זה כבר שינה בתדירות גבוהה ומשמש להבהיר תעלומות במגוון רחב של תחומים. מבחני מסוימים שנועדו לגלות את המסלול הספציפי שצולם על ידי את התולעים לכיוון יעד. Assay הטיפוסי מסוג זה פותח על ידי וורד 5. שלושה תולעים הונחו על אגר נמסו במשך 15 דקות. התנועות שלהם אותרו על ידי החותם שהשאיר כמו שהם נסעו מהפריפריה של הצלחת עד לשיפוע attractant במרכז הצלחת. כל התולעים על הצלחת נעצרו באמצעות כלורופורם בסופו של כל משפט. צאצא אחד של שיטה זו הניח תולעת אחת באמצע הצלחת עם attractant ושליטהמרחקים שווים והפך לא מהמקור 2. פירס-Shimomura et al. פיתחה assay להתבוננות בטבעה של התנועה מעורבת בchemotaxis 9 המדויק. תולעים בודדים הוצבו ב9 מנות ס&quot;מ פטרי המכילים גם ריכוז אחיד של attractant או שיפוע בצורה רדיאלית, שהגיעו לשיא במקור attractant. תוכנת מחשב שזיהתה את התולעת הייתה בשימוש כדי להקליט את ההתנהגות הנצפית. מצלמת וידאו המחוברת למיקרוסקופ עבדה בשיתוף עם הבמה כדי להתאים את צלחת פטרי באופן אוטומטי כassay רץ על מנת להבטיח את התולעת נשארה בשדה הראייה. מזה, מידע מפורט יותר התגלה לגבי הגורם לפירואטים המוצגים על ידי ג elegans. מבחני אחרים, יותר דומים לזה שתואר כאן, בדקו את התגובה של אוכלוסייה גדולה של תולעים לתרכובות בדיקה. מבחני chemotaxis שתי כבר ברבעהשתמש כדי לחקור את התפקידים שנוירונים שונים, קולטנים, ומולקולות העברת אותות שיחק כאשר ג elegans נחשף לתרכובות שונות 1. בין 20-50 תולעי שטף הוצבו בסמוך למרכז הצלחת עם attractant ושליטה בשני קצוות קוטביים יחד עם ההרדמה, אזיד הנתרן (NAN 3). לאחר 60 דקות, מדד chemotactic עם ערכים מ -1.0 ל 1.0 נוצר על בסיס ההפרש בין כמה תולעים הוצמדו לattractant או השליטה. מדד chemotactic דומה היה בשימוש בassay דיווח במאמר זה, אם כי assay קודם לכן לא הצליח להעריך אך ורק תולעים שאינן ניעתי. assay זה היה לאחר מכן הוחל בהמשך לבדיקת ההשפעות של אבלציה העצבית בchemotaxis. וריאציה נוספת של assay האמור בוצעה בו 100-200 תולעים הונחו במרכז צלחת המכילה ארבעה רביעים 3. רביעים סמוכים גם הכילו את המבחן אולשלוט בחומר. כמו במבחנים קודמים, התולעים היו משותקים על ידי הפעולה של אזיד הנתרן לפני שהבקיע. שיטה דומה מתוארת כאן כדרך להעריך את התגובות של ג elegans לתרכובות שונות. עם זאת, יש לו את השיטה מתחת לערך מוסף של הערכה רק תולעים שעברו מרחק סף המפריד נייד מנייחים תולעים. מבחני אחרים לא שולבו הנחיות דומות להתעלמות תולעים נייחים. Frøkjær-ג&#39;נסן et al. פיתחה assay תכליתי אשר יכול לשמש כדי לבדוק את תרכובות מסיסים שניהם נדיפים ומים 10. צלחת פטרי הייתה מחולקת לארבעה רבעים. הרביעים העליונים ותחתונים לא מכילים ממסים. הרבע השמאלי הכיל מים, והזכות הכילה attractant. כאשר בודקים odorants נדיפים, אנליטי הונח על המכסה של הצלחת, מעל רבע הראוי, ואילו תרכובות מסיסים במים הונחו ישירות על אגאr. השיטות קיימים כיום להערכת תגובת chemotactic של ג elegans כל הזמן להיות מעודן כדי לייעל את נוחות השימוש, יעיל, ודיוק שלהם. כך, בעוד שיש לו את assay המתואר כאן את היכולת להעריך את המספר הגדול ביותר של תולעים (תפוקה המקסימלית:. 250 תולעים / לשעה לכל צלחת, מעט גדולה יותר מהתפוקה שהפגינה לי ואח&#39; 3); הוא כוח האמיתי של שיטה זו שיאו תמציתי של רבים מהמאפיינים של מבחני קודמים (טבלת 1).

<table><tbody><tr><td>S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O ל-1 ליטר.] אוטוקלב</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoFuge</td><td>Stratagene</td><td>400552</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופים</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חיתוך</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette P1000</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette P10</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Sodium Azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגר Chemotaxis [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) או 2% Difco-agar. אוטוקלב. מוסיפים 5 mM אשלגן פוספט, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol/מי זיקוק</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרכובות בדיקה (למשל. 0.5% diacetyl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0600</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>CA97062-046</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>VWR</td><td>CA12001-120</td><td></td></tr><tr><td>NH4OH</td><td>BDH</td><td>CABDH8641-2</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

assay chemotaxis סי אלגנס

C. elegans Chemotaxis Assay

אורגניזמים רבים משתמשים chemotaxis לחפש מקורות מזון, להימנע מחומרים רעילים, ולמצוא בני זוג. Caenorhabditis elegans יש התנהגות chemotaxis מרשימה. הנחת היסוד מאחורי בודק את התגובה של התולעים לodorant הוא למקם אותם בשטח ולבחון את התנועה עוררה בתגובה לodorant. אפילו עם מבחני הזמינים רבים, אופטימיזציה של תולעת מתחילה מיקום יחסי הן לשליטה ואזורי מבחן, תוך מזעור האינטראקציה של תולעים אחד עם השני, תוך שמירה על גודל מדגם משמעותי נשארה בתהליך עבודה 1-10. השיטה המתוארת כאן שואפת לטפל בבעיות אלה על ידי שינוי assay שפותח על ידי Bargmann et al. 1. צלחת פטרי מחולקת לארבעה רבעים, שני רביעים מול מסומנים &quot;בדיקה&quot; ושתיים מיועדים &quot;שליטה&quot;. הרדמה ממוקמת בכל המבחן ובאתרי בקרה. את התולעים ממוקמים במרכזה של הצלחת עם circlדואר מסומן סביב המוצא כדי להבטיח שתולעים אינם נעימים ביהיו להתעלם ממנו. ניצול מערכת של ארבעה רביעים ולא אחד או שתיים 1 2 מבטל הטיה בתנועה של התולעים, כפי שהם במרחק שווה מדגימות בדיקה ובקרה, ללא קשר לאיזה צד של המקור שהם התחילו. זה עוקף את הבעיה של תולעים נאלצים לנסוע דרך מקבץ של תולעים אחרים להגיב לodorant, אשר יכול לעכב את התולעים או להכריח אותם לקחת דרך עקיפה יותר, מניב פרשנות שגויה של הנתיב המיועד שלהם. שיטה זו מראה גם יתרונות מעשיים על ידי בעל מדגם גדול יותר ומאפשר לחוקר להפעיל את assay ללא השגחה ולהבקיע את תולעי פעם אחת הזמן המוקצב פג.

השוואה בין ג פראי סוג (N2) elegans לODR-10 (ky10) שעברו המוטציה. אנחנו השתמשנו דיאצטיל, ג ידוע chemoattractant elegans, להשוות תולעי wildtype לזה של מוטציה שחסרה את הקולטן ל1,12 דיאצטיל. לwildtype (N2) תולעי מדד chemotactic היה 0.100 ± 0.066 לאתנול, ו0.839 ± .031-.5% דיאצטיל. כצפוי, דיאצטיל מעורר תגובת chemoattractive משמעותית מwild-type תולעים (P &lt;0.003). ב...

שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מתואר. מדד chemotactic (CI) הועסק כדרך להעריך בדיוק את התגובה של תולעים למטרות מסוימות, ומשמש כפלטפורמה להשוואה בין זנים ותרכובות של עניין.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את התגובה הכימוטקטית של C elegance באמצעות בדיקה פשוטה וזולה. זה מושג על ידי בידוד תולעים מתוזמנות והצבתן במרכז צלחת מסומנת. במרחק שווה מכל אתרי הבדיקה והשליטה שהופקדו בכל אתר נמצא תרכובת מעניינת או תרכובת בקרה, שתיהן בשילוב עם חומר הרדמה שירתק את התולעים כשהן מתקרבות.לאחר 60 דקות, מונה את התפלגות התולעים הסופית על הצלחת, והיחס בין מיקומי התולעים משמש כדי לספק מדד בדיקה. בסופו של דבר, כימות המשיכה של ים האלגנטיות לתרכובות מסוימות יכול לשמש להערכת התוצאות ההתנהגותיות של מניפולציות ניסיוניות בסיסיות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא כוללת היבטים מועילים רבים של קודמותיה, תוך אפשרות לשימוש נוח יותר.בדיקה זו מספקת תובנה לגבי התנהגות ים האלגנטיות והיא שימושית במיוחד בשילוב עם מניפולציות נוירוגנטיות ובדיקות נוירוביולוגיות אחרות. התחל עם צלחות של חמישה סנטימטרים העמוסות באגר כימוטקסי או NGM. סמן את החלק התחתון של הצלחות לארבעה רבעים שווים.הכן לפחות שלוש צלחות לפחות לשלושה ניסויים לכל זן גנטי שנבדק ולכל מצב שנבדק. לאחר מכן, סמן עיגול ברדיוס של 0.5 סנטימטר סביב המקור. לאחר מכן סמן נקודות ברבעים הנגדיים עם T לבדיקה או C לבקרה, וודא שהאתרים רחוקים שווה ממקורם זה מזה.הנקודות חייבות להיות במרחק של לפחות שני סנטימטרים מהמקור לצורך בדיקה זו. יש להכין תולעים צעירות מבוגרות בפיתוח מסונכרן על צלחות כימוטקסי בנות חמישה סנטימטרים. תולעים שנמצאות בשלבי פיתוח שונים עשויות להגיב באופן שונה לחומרים האנליטיים.כתוצאה מכך, חשוב מאוד שכל התולעים המשמשות בבדיקה נמצאות באותו שלב התפתחותי. ברגע שהתולעים פינו מדשאה של OP 50 e coli, צמצמו שני מיליליטר של מאגר S בסיסי לצלחת. תפעלו את הצלחת כדי להכניס את כל התולעים לחיץ כדי לשטוף את התולעים.צמצמו מיליליטר אחד מהתולעים בחיץ לתוך מבחנת מיקרו צנטריפוגה וצנטריפוגו אותם למשך 10 שניות. השתמשו בפיקו פיוג' ב-6,600 סל"ד, שאפו את הבסיל כפי שהוא, והשאירו את הגלולה של התולעים ללא שינוי. כעת יש לשטוף את התולעים האלו שלוש פעמים נוספות בשיטה זהה.התחל בהוספת מאגר S בסילי לצינור והפוך את הצינור כדי להחזיר את התולעים לפתרון. לאחר הכביסה הסופית, צנטריפוגו את התולעים למשך 10 שניות נוספות ולאחר מכן שאפו את הסופרנטנט לנפח סופי של 100 מיקרוליטר. לאחר מכן, ודא צפיפות מספקת של תולעים על ידי צמצום שני מיקרוליטר מהתולעים השטופות מהגלולה לצלחת NGM.חייבות להיות לפחות 50 תולעים, אך לא הרבה יותר מ-250 תולעים. אם יש יותר מדי תולעים, הגדל את נפח תמיסת ESP בזיליקום. ואם יש מעט מדי תולעים, סובב אותם למטה והשהה אותם בנפח נמוך יותר.הנח את צינור התולעים בקובץ עשן. ברגע שהוכנו, התולעים טובות לשימוש בבדיקת כימוטקסי למשך שעה. ראשית, הכן את הפתרונות.ערבבו את תמיסת הבדיקה על ידי שילוב נפחים שווים של התרכובת הנבדקת עם חומר ההרדמה 0.5 מולרי אזיד. לאחר מכן, ערבבו פתרון בקרה של הממס המשמש לדילול התרכובת הנבדקת עם 0.5 מולרי נתרן אזיד. עכשיו הכן צלחת בדיקה.ראשית צמצמו שני מיקרוליטר של תמיסת תולעים מהגלולה על מקור צלחת הבדיקה. שנית, הוסיפו את החומרים הריחיים צמצמו שני מיקרוליטר מהתמיסה הנבדקת לשני אתרי T וצמצמו שני מיקרוליטר מהתמיסה הבקרה לשני אתרי T. ברגע שהתולעים וטיפות הריח נספגו בחומר האגר, החליפו את המכסים, הפכו את הצלחות והניחו 60 דקות לזמן הבדיקה.לצורך

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים את שיטות הבדיקה C. elegans למידה אסוציאטיבי זיכרון אסוציאטיבי קצר לטווח ארוך. אלה מבחני האוכלוסייה להעסיק את היכולות תולעים chemotax כלפי odorants נדיפים, וליצור אסוציאציות חיוביות על זיווג עם מזון butanone chemoattractant. הגדלת מספר תקופות מיזוג גורם זיכרון לטווח ארוך.

סי אלגנס למידה חיובית Butanone, לטווח קצר, לטווח ארוך מבחני זיכרון אסוציאטיבי

מערכת ECIS / מוניות היא אוטומטית, בזמן אמת assay המודד chemotaxis סלולריים. ב assay זה, התאים לעבור מתחת לשכבה של agarose להגיע האלקטרודה היעד. התנועה נייד נמדדת הופעת עמידות 0 AC הנוכחי.

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

סרטון זה מציג כימוטקסיס בנמטודה C. elegans ומציג פרוטוקול לדוגמה הבודק סלידה כימוטקטית מנחושת גופרתית.

ג. אלגנס בדיקת כימוטקסיס: שיטה לבדיקת כימוסנסציה בתולעים

חוקרים יכולים להפעיל תנועה לפי דרישה ב-C. elegans על ידי הפעלת שדה חשמלי שתולעים חשות בו ומגיבות אליו. סרטון זה מציג התנהגות אלקטרוטקטית ומציג פרוטוקול דגימה שנעשה במכשיר מיקרופלואידי.

בדיקת Electrotaxis: שיטה לצפייה בתנועה ב- C. elegans

שיטת מייקרו אלקטרו fluidic חצי אוטומטית כדי לגרום לתנועה על פי דרישה...

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies...

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

אנו מציגים התנהגות הקלטה הקלטה ופרוטוקול המאפשר ניתוח אוטומטי של נמטודות, Caenorhabditis elegans 'העדפת תרכובות מסיסות באסאי מבוסס האוכלוסייה. מאמר זה מתאר את הבנייה של תא התנהגות, פרוטוקול assay התנהגותי, וניתוח וידאו השימוש בתוכנה.

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

פיתחנו בעבר פרוטוקולים עבור Caenorhabditis elegans ליצירת זיכרונות אסוציאטיביים לטווח קצר וארוך על ידי אימון המוני ומרווח, בהתאמה. כאן מתוארים פרוטוקולים מפורטים להתניה של C. elegans על ידי זיווג 1-פרופנול וחומצה הידרוכלורית כגירויים מותנים ובלתי מותנים, בהתאמה, ליצירת זיכרון אסוציאטיבי מרתיע.

למידה אסוציאטיבית מרתיעה ויצירת זיכרון על ידי זיווג שני כימיקלים ב- Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבדיקת למידה אסוציאטיבית על ידי ביצוע התניה קלאסית באורגניזם המודל C. elegans. הפרדיגמה מבוססת על זיווג ריכוז המלח בסביבה עם נוכחות או היעדר מזון, מה שמשנה את הכימוטקסיס שלהם לכיוון המלח או הרחק ממנו.

מדידת למידה אסוציאטיבית בכימוטקסיס של הנמטודה Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה קובע שיטות לחילוץ וכימות תגובות לפרומון המין הנדיף ב- C. elegans, ומספק כלים לחקר תקשורת כימית ומסלול ניווט.

מיצוי פרומון מין נדיף ובדיקת כימותרפיה ב- Caenorhabditis elegans

למדו להעריך כימוטקסיס ב-Caenorhabditis elegans באמצעות שיטה פשוטה וזולה. השיטה מודדת את התפלגות התולעים בתגובה לתרכובות שונות ומספקת מדד כימוטקטי להשוואה בין זנים.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

גלה סרטונים נוספים