Name: צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: חקור מנגנוני רכישת ברזל ב-Staphylococcus aureus באמצעות המוגלובין אנושי כמקור ברזל יחיד. השיטה מסייעת לזהות גורמים בקטריאליים קריטיים לצמיחה בתנאי מחסור בברזל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים בארה&quot;ב שירות בריאות ציבור AI69233 וAI073843 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות. EPS הוא עמית בורוז Wellcome בפתוגנזה של מחלות זיהומיות. קמ&quot;ש מומן על ידי התאית ומולקולרית מיקרוביולוגיה הדרכת מענק תכנית 5 T32 A107611-10.

1. טיהור של המוגלובין מדם טרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש דם אדם טרי בתוספת נוגדי קרישה. לשמור על דם על קרח או ב 4 ° C בכל הטיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דם במשך 20 דקות ב1500 x גרם. תאי הדם האדומים (RBCs) יהיו בתחתית של התחתית. בזהירות לשאוב supernatant והעדינות resuspend גלול ב 0.9% (w / v) פתרון NaCl קר כקרח. חזור צנטריפוגה ולשטוף 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגלולה בנפח 1 מתוך קרים כקרח 10 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 8.0). זה יניע תמוגה של RBCs עקב לחץ האוסמוטי. הוסף ל~ טולואן נפח סופי של 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 4 מעלות צלזיוס בצלייה למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב20000 XG לשעה 1. לאסוף את שבר hemolysate האמצע עוזב טולואן (צף על גבי) וגלולה ללא פגע. השתמש פיפטה-צוואר ארוך כדי לאסוף את שבר האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר דרך מסנן מזרק 0.44 מיקרומטר. אם הפתרון מכיל חלקיקיםעניין ולא יכול להיות מועבר דרך המסנן, חזור על שלב 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר המוגלובין (HB) עם כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהי עמודה (HPLC) אניון חליפין (ריאן, 1000 8 מיקרומטר PL-סקסופון, 150 מ&quot;מ × 4.6 מ&quot;מ). השלב הנייד הוא 10 mM טריס-HCl (pH 8.0) ושלב ב &#39;נייד הם 10 mM טריס-HCl (pH 8.0) + 0.5 M NaCl. 0% -100% שיפוע של B ממס נדרס 2 דקות בשיעור 2.0 מ&quot;ל / דקת זרימה. Elution מנוטר על בסיס קליטה (λ: 410 ננומטר ו 280 ננומטר). לאסוף רק השבריר מתאפיין בצבע אדום בהיר ושיא ספיגה בולט (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיאליזת elution נגד פוספט נאגר מלוח (PBS) למשך הלילה ולאחר מכן לכמה שעות שוב. לעקר על ידי עובר דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את ריכוז המוגלובין, להכין פתרוני המוגלובין סטנדרטיים של ריכוזים ידועים בPBS. לקבוע את הריכוז של המוגלובין במדגם על ידי ערבוב את הפתרונים הסטנדרטיים (ראה טבלה עם ריאגנטיםed) או פתרון לדוגמא עם ריאגנט של 2x דרבקין (שהוכן מאבקה) ביחס 1:1. לדוגמה, לערבב פתרון Hb 100 μl עם מגיב 100 μl 2x של דרבקין בצלחות 96-כן. דגירה במשך 15 דקות וספיגה במידה 540 ננומטר. להתוות עקומת סטנדרט ולקבוע את ריכוז המוגלובין במדגם. חמש עד 15 תשואות מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​הן טיפוסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוגרם 15-20 המטוהרים המוגלובין על 15% SDS-PAGE בשני עותקים. כתם אחד מהג&#39;לי; להעביר את החלבונים מג&#39;ל אחר על גבי קרום ניטרוצלולוזה וimmunoblot למוגלובין (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא ולאחסן 1 aliquots מ&quot;ל של המוגלובין בחנקן נוזלי. </li></ol> 2. הכנת הברזל פוגע תקשורת צמיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Roswell Park Memorial מכון (RPMI) מרק על ידי המסת אבקת RPMI במים, מוסיף סודה לשתייה כפי שהומלץ על ידי היצרן וחומצות cassamino% 1 (CA) (W / V). לעקר על ידי עובר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר והחנות refrigמקורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מתכת מדולדלת RPMI (NRPMI) על ידי הוספת 7% (w / v) Chelex 100 וערבוב במשך הלילה על צלחת ומערבבים. הסר Chelex 100 על ידי עובר דרך מסנן וחנות בקירור 0.2 מיקרומטר. תוספת תקשורת עם מתכות שאינן ברזל חיוניים: 25 מיקרומטר ZnCl 2, 25 מיקרומטר MnCl 2, 100 מ&quot;מימ CaCl 2 ו1 המ&quot;מ MgCl 2 הוכן מראש כפתרון x סטרילי 1000. השתמש בכלי פלסטיק חד פעמים לצעד זה כדי למנוע זיהום מאספקת ברזל מחדש שמישה. </li></ol> 3. צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות המוגלובין כמקור ברזל Sole <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרצף ס סטפילוקוקוס לבידוד באגר סויה tryptic (TSA) ממניות קפוא. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ethylenediamine-N, ניצבת בין bis (חומצה 2-hydroxyphenylacetic) (EDDHA) באתנול נטול מים עד 100 מ&quot;מ. EDDHA אינו נכנס פתרון אבל מעוקרת על ידי אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לEDDHA RPMI לריכוז סופי של 0.5 מ&quot;מ. להתירEDDHA לפזר לפחות 30 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא. עקב וריאציה תצווה לתצווה, ריכוז EDDHA סופי ייתכן שיהיה הצורך הוריד ל0.25 מ&quot;מ כדי לאפשר התפתחות חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבות בודדות של ס סטפילוקוקוס לתוך 5 מ&quot;ל של RPMI מכיל EDDHA ב15 צינורות חרוטי פקק מ&quot;ל. לדגור על 37 ° C עם הרעד ב180 סיבובים לדקה (סל&quot;ד) ל16-20 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תרבויות הלילה עבור 5 דקות ב7500 XG וresuspend בגלולה המכילה NRPMI EDDHA 0.5 מ&quot;מ. לנרמל OD 600 ל ~ 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן NRPMI המכיל 2.5 מיקרוגרם למ&quot;ל והמוגלובין EDDHA 0.1-1.0 מ&quot;מ. בשל שונות בין הקבוצות, ריכוז EDDHA נדרש Chelate ברזל חופשי בNRPMI עשוי להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μl תת השעיה של חיידקים מצעד 3.5 לתוך 1 מ&quot;ל NRPMI + + EDDHA המוגלובין בצינור 15 מיליליטר פקק חרוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התרבויות על 37 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות עם הרעד ב180 סל&quot;ד או בתוף מתגלגל. </li><li&gt; כל 6-12 שעות תיקח 600 קריאות OD על ידי הסרת 50 μl של התרבות ולערבב אותו עם 150 μl של PBS בצלחות 96-כן. </li></ol>

<ol><li>Mazmanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+heme-iron+across+the+envelope+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus.</a> Science. 299, 906-909 (2003).</li>
<li>Pishchany, G., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+for+blood%3A+hemoglobin+as+a+nutrient+source+for+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens.</a> PLOS Pathogens. 8, e1002535(2012).</li>
<li>Haley, K. P., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+battle+for+iron%3A+host+sequestration+and+Staphylococcus+aureus+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection.+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition.</a> Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).</li>
<li>Krishna Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+hemoglobin+capture+by+Staphylococcus+aureus+cell-surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22IsdH.+The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein.</a> IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).</li>
<li>Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-coordinating+tyrosine+is+a+key+determinant+of+NEAT+domain+heme+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer.</a> Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).</li>
<li>Villareal, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+weak+protein-protein+complexes+transfer+heme+across+the+cell+wall+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).</li>
<li>Muryoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+the+iron-regulated+surface+determinant+%28Isd%29+heme+transfer+pathway+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).</li>
<li>Reniere, M. L., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+haem+oxygenases+are+differentially+regulated+by+iron+and+haem%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem.</a> Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemin+transfer+from+IsdA+to+IsdC+in+the+iron-regulated+surface+determinant+%28Isd%29+heme+acquisition+system+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).</li>
<li>Pishchany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+for+human+hemoglobin+enhances+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection.</a> Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).</li>
<li>Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+the+Staphylococcus+aureus+heme+iron+transport+components+IsdA+and+IsdB%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB.</a> Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).</li>
<li>Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+IsdB+is+a+hemoglobin+receptor+required+for+heme+iron+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization.</a> J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsdA+and+IsdB+antibodies+protect+mice+against+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+lethal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge.</a> Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).</li>
<li>Cheng, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+persistence+in+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues.</a> Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).</li>
<li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+in+biological+catalysis%3A+from+enzyme+databases+to+general+principles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li>
<li>Weinberg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+availability+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Iron availability and infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).</li>
<li>Drabkin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+Hemin+Chromoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the Hemin Chromoproteins.</a> Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).</li>
<li>Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD163%3A+a+signal+receptor+scavenging+haptoglobin-hemoglobin+complexes+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).</li>
<li>Torres, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Fur+regulates+the+expression+of+virulence+factors+that+contribute+to+the+pathogenesis+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia.</a> Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).</li>
<li>Hammer, N. D., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Staphylococcus+aureus+Iron+Acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition.</a> Annu. Rev. Microbiol. , (2011).</li>
<li>Hurd, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iron-regulated+surface+proteins+IsdA%2C+IsdB%2C+and+IsdH+are+not+required+for+heme+iron+utilization+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Fems.+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus.</a> Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).</li>
<li>Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetric+behavior+of+hemoglobin+alpha-+and+beta-+subunits+during+acid-induced+denaturation+observed+by+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry.</a> Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).</li>
<li>Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+chromatographic+method+for+the+preparation+of+human+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin.</a> Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).</li>
<li>Shen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unmodified+human+adult+hemoglobin+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).</li>
<li>Manjula, B. N., Acharya, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+molecular+analysis+of+hemoglobin+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography.</a> Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).</li>
<li>Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+envelope+proteins+related+to+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial envelope proteins related to iron.</a> Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).</li>
<li>Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+regulated+outer+membrane+proteins+of+Escherichia+coli%3A+variations+in+expression+due+to+the+chelator+used+to+restrict+the+availability+of+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron.</a> Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).</li>
<li>Rogers, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Binding+Catechols+and+Virulence+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

ברזל הוא חומר מזין חיוני הנדרש על ידי אורגניזמים מכל הממלכות של 15 חיים. בבעלי חוליות, ברזל מבודד את להימנע מרעילות הנגרמת על ידי רכיב זה. תפיסה זו גם מסתירה ברזל מפלישת חיידקים בתהליך המכונה חסינות תזונתית 16. בתגובה, פתוגנים התפתחו אסטרטגיות עוקפות חסינות תזונתית. מנגנון אחד כזה מסתמך על המוגלובין, שהוא המקור הנפוץ ביותר של ברזל בתוך פונדקאי 17. המוגלובין כלול בתוך תאי דם אדומים. ההמוגלובין משתחרר מתאי דם אדומים פגומים כפוף haptoglobin מארח, מה ש...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> טור חילופי אניון HPLC </td><td> ריאן </td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> המגיב של דרבקין </td><td> סיגמא </td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td> סטנדרטי המוגלובין </td><td> פואנטה מדעית </td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> HyClone </td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> צורת נתרן Chelex 100 </td><td> סיגמא </td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> LGC התקנים GmbH </td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td> המוגלובין נוגדן </td><td> סנט קרוז ביוטכנולוגיה, Inc </td><td> SC-21005 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> אגר סויה Tryptic </td><td> BD </td><td> 236920 </td><td></td></tr></tbody></table>

צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

ס aureus הוא חיידק הפתוגני שדורש ברזל כדי למלא תפקידים מטבוליים חיוניים ובגורמים למחלות. המאגר העשיר ביותר של ברזל בתוך המארח האנושי הוא heme, שהוא cofactor של המוגלובין. לרכישת ברזל מהמוגלובין, ס סטפילוקוקוס מנצל מערכת מורכבת ידועה כגורם המשטח ברזל המוסדר (ISD) 1 המערכת. מרכיבי ההמוגלובין ISD המערכת הראשון לאגד המארח, ואז לחלץ ולייבא heme, ולבסוף לשחרר ברזל ממקור צמחי בציטופלסמה החיידקים 2,3. מסלול זה כבר נתח באמצעות מספר רב של מחקרים במבחנת 4-9. יתר על כן, תרומתה של מערכת ISD לזיהום הודגמה שוב ושוב במודלי עכבר 8,10-14. הקמת התרומה של מערכת ISD לרכישת ברזל המוגלובין-נגזר וצמיחה הוכיחה להיות יותר מאתגר. מבחני צמיחה באמצעות ההמוגלובין כמקור ברזל בלעדי מסובכים בy חוסר היציבות של המוגלובין הזמין מסחרי, מזהם ברזל חופשי במדיום הגידול, והרעילות הקשורה chelators ברזל. כאן אנו מציגים שיטה המתגברת על מגבלות אלה. המוגלובין באיכות הגבוהה מוכן מדם טרי ומאוחסן בחנקן נוזלי. המוגלובין מטוהר הוא בתוספת ברזל לימוצה בינוני מחקה את סביבת ברזל העניים נתקלה ידי פתוגנים בתוך מארח החוליות. על דרך רעבה ס סטפילוקוקוס של ברזל חופשי ולהשלים עם צורת מניפולציות מינימאליות של המוגלובין נזרז את הצמיחה באופן שתלוי לחלוטין ביכולת לקשור המוגלובין, לחלץ heme, יעבור heme דרך מעטפת תא החיידק ולבזות heme בציטופלסמה. assay זה יהיה שימושי לחוקרים המבקשים להבהיר את המנגנונים של רכישת הברזל hemoglobin-/heme-derived בס סטפילוקוקוס ואולי חיידקים פתוגנים אחר.

יש לנו מטוהר ההמוגלובין אנושי מhemolysate עם HPLC (צעד הפרוטוקול 1.7). איור 1 הקלטות ספיגת eluate ב 280 ואורכי גל 410 ננומטר. חלק 5 נאסף ומקטעים אחרים שנזרקו. תשואות של 5-15 מיליגרם של המוגלובין למ&quot;ל של eluate נרכשות בדרך כלל. המוגלובין מטוהר נותח על ידי SDS-PAGE במשוכפל וג&#39;לים היה או מוכתם לחלבונים או העביר על ניטרוצלולוזה וimmunoblotted (צעד הפרוטוקול 1.10, איור 2). הע...

כאן אנו מתארים assay צמיחה<em&gt; סטפילוקוקוס אוראוס</em&gt; באמצעות ההמוגלובין כמקור היחידי של ברזל תזונתי זמין. בדיקה זו קובעת את התפקיד של גורמי חיידקים המעורבים ברכישת ברזל המוגלובין נגזר.

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

ניסוי זה בודק את יכולתו של סטפילוקוקוס זהוב להשתמש בהמוגלובין אנושי כמקור ברזל יחיד. ראשית, בודדו כדוריות דם אדומות מדם אנושי טרי. טהר את ההמוגלובין על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים כדי להבטיח את שלמות ההמוגלובין.כעת הוסף המוגלובין למדיום מדולל ברזל כדי לספק את הברזל בצורה של המוגלובין תרבית Next. S reus. בנוכחות המוגלובין ולמדוד את יכולתו לנצל את ההמוגלובין כמקור ברזל.התוצאות מראות כי ראוס מתרבה בנוכחות המוגלובין כמקור ברזל יחיד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון האם פתוגן יכול להשתמש בחלבונים מארחים כמקורות לברזל, ואילו מנגנונים נדרשים לניצול ברזל בתהליך זה. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי רכישת ברזל של סטף ראוס מההמוגלובין.אפשר ליישם אותו גם על מחקרים של חיידקים אחרים ועל האופן שבו הם משתמשים בחלבונים שמכילים ברזל מהמארח. ידגימו את הטכניקה הזו GLA Ani וקתרין היילי מהמעבדה שלי. ראשית, השג דם אנושי מבודד טרי, בתוספת נוגד קרישה ושמור על ארבע מעלות צלזיוס לאורך כל הטיהור גלולה את כדוריות הדם האדומות על ידי צנטריפוגה למשך 20 דקות ב 15, 000 Gs.שאפו בזהירות את החטיפה והשעו בעדינות את הגלולה בקור קרח, תמיסת נתרן כלורי 0.9% לאחר שלוש כביסות, החייאה, השעו את הגלולה בנפח אחד של תריס קר כקרח 10 מילימולארי, HCL ל-RBCs על ידי לחץ אוסמוטי.לאחר מכן מוסיפים טולואן ל-20% נפח סופי ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס על מסובב למשך הלילה. הצנטריפוגה הבאה. הליזאט ב -20,000 גרם לשעה.אוספים את שבר ההמוליזט האמצעי, ומשאירים את שכבת הטולואן העליונה ואת הגלולה ללא הפרעה. העבירו את ההמוליזט דרך מסנן מזרק של 0.44 מיקרומטר. אם התמיסה מכילה חומר חלקיקי ולא ניתן להעביר אותה דרך המסנן, חזור על הצנטריפוגה במהירות גבוהה.כעת טהר את ההמוגלובין עם עמודת חילופי אניונים כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. השתמש בשלב נייד A של 10 מילי-מולארי טריס, HCL, ושלב B נייד של 10 מילי-מולארי טריס, HCL בתוספת 0.5 מילי-מולארי נתרן כלורי. הפעל שיפוע של 0% עד 100% של ממס B במשך שתי דקות בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה.עקוב אחר הפליטה על סמך ספיגה ב-410 ננומטר ו-280 ננומטר. אוספים את השבר המאופיין בצבע אדום בוהק ובשיא ספיגה בולט. דיאליזה של הפליטה כנגד מי מלח חוצצים פוספט למשך כ-16 שעות.כדי לעקר את הדגימה, העבירו אותה דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר לקביעת ריכוז ההמוגלובין. הכן את הפתרונות הסטנדרטיים של HP ב-PBS. כעת מערבבים את התמיסות הסטנדרטיות או את תמיסות המדגם עם שני מגיב xra kins ביחס של אחד לאחד ב-96 צלחות באר לאחר ספיגת מדד דגירה של 15 דקות ב-540 ננומטר.שרטט עקומה סטנדרטית וקבע את ריכוז HP של הדגימות חמישה עד 15 מיליגרם למיליליטר. התשואות הן ציטוטים אופייניים של 15 עד 20 מיקרוגרם דגימת המוגלובין מטוהר על שני ג'לים של 15% עמודי STS. יש לצבוע את אחד הג'לים ולהעביר את החלבונים מג'ל אחר על קרום ניטרוצלולוז לכתם חיסוני להקפאת המוגלובין ולאחסן מיליליטר אחד של ההמוגלובין המבודד בחנקן נוזלי מפס מלאי קפוא S aureus על טריפטיכון, אגר סויה, ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 24 שעות.לחסן מושבות בודדות לחמישה מיליליטר של RPMI המכיל E-D-D-H-A ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-180 סל"ד למשך הלילה. גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-7, 500 Gs.לאחר מכן החייאה, השעו את החיידקים ב-RPMI המכיל 0.5 מילי-מולרי E-D-D-H-A, ונרמלו ל-OD 600 של כשלוש. לאחר מכן, הכינו את N-R-P-M-I המכיל 2.5 מיקרוגרם למיליליטר, HB ו-0.1 עד מילי-מולרי E-D-D-H-A כדי לכלוא את הברזל החופשי.כעת, תת-תרבית של 10 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים למיליליטר אחד של N-R-P-M-I בתוספת E-D-D-H-A פלוס HP מדגרים את התרביות ב-37 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות עם טלטול ב-180 RRP M כל שש עד 12 שעות. הסר 50 מיקרוליטר מתערובת התרבות עם 150 מיקרוליטר PBS בצלחות באר 96 וקח קריאות OD 600. בטיהור HPLC זה של המוגלובין אנושי מהמוליזט, ספיגת האלואט באורכי גל של 280 ו-410 ננומטר נמדדת עם שבר חמש המכיל את ההמוגלובין.בדרך כלל, מתקבלות תשואות של חמישה עד 15 מיליגרם המוגלובין למיליליטר לכל הכנה. ההמוגלובין המטוהר נותח על ידי דף SDS בשכפול, והג'לים היו מייצגים חלבונים או הועברו לניטרוצלולוז וכתמים חיסוניים. לאחר מכן, ההמוגלובין האנושי המטוהר נבדק ליכולתו לתמוך בצמיחה של אסוס ו-ASUS מסוג בר שחסר את קולטן ההמוגלובין הדרוש לרכישת ברזל שמקורו בהמוגלובין.העלייה בצפיפות האופטית של התרביות לאורך זמן מצביעה על כך שב-N-R-P-M-I פלוס E-D-D-H-A פלוס hb, הסוג הפראי ASUS מתפשט, אך המוטאנט לא. לעומת זאת, היכולת להשתמש בתוספת ברזל חופשי זהה הן בזנים מסוג בר והן בזנים מוטנטיים, אף אחד מהם לא מתרבה בהיעדר מקור. בהשוואה זו של מדיה בתוספת המוגלובין מטוהר מדם טרי או המוגלובין ליופילי, ההמוגלובין המטוהר מדם דורש ISDB לגדילה.בעוד שהמוגלובין ליופיליזציה מאפשר התפשטות של מוטנט ISDB לאחר שליטה, ניתן להשלים טיהור נכון של המוגלובין תוך מספר שעות. זכרו, התורמים הם נשאים פוטנציאליים של פתוגנים הנישאים בדם, לכן התייחסו לדם אנושי כחומר מסוכן ביולוגית.

staphylococcus-aureus-growth-using-human-hemoglobin-as-an-iron-source

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול כללית לחקר פלישה של תאים לארח על ידי פתוגן חיידקי, תוך...

הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

מקור: Gupta, S., et al. בידוד ואפיון שלפוחיות חוץ-תאיות המיוצרות על ידי מיקובקטריות מוגבלות בברזל. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך לתרבית Mycobacterium tuberculosis בתנאים מוגבלים בברזל כדי לגרום ללחץ ברזל ולקדם הפרשת סידרופורים התומכים בהישרדות חיידקים.

גידול Mycobacterium tuberculosis בתנאים מוגבלים בברזל

מקור: Maurakis, S., et al. גידול מוגבל במתכת של Neisseria gonorrhoeae לאפיון גנים המגיבים למתכת ורכישת מתכת מליגנדים מארחים. J. Vis. Exp. (2020).סרטון זה מדגים בדיקת גידול חיידקים מוגבלת מתכת כדי לחקור את תפקידם של גנים המגיבים למתכת. חיידקים מסוג בר ומוטנטיים הגדלים במדיום מדולדל מתכת מודגרים עם ליגנד מתכת, וצמיחתם מנוטרת באמצעות קורא צלחות. בתנאים מדוללי מתכת, החיידקים מסוג הבר מבטאים קולטן פני השטח המאפשר קליטה וצמיחה של מתכות, בעוד שהמוטנט חסר קולטן זה, וכתוצאה מכך צמיחה מוגבלת.

בדיקת גידול חיידקים מוגבלת מתכת לחקר תפקידם של גנים המגיבים למתכת

מקור: Behera, R.K. ואחרים, שיטה מבוססת פלואורסצנציה לחקר ויסות גנים חיידקיים ברקמות נגועות. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הכנת תרביות המוליטיות של Staphylococcus aureus כדי לתקן את צמיחת החיידקים ולהשיג סינכרון מטבולי למחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן.

הכנת תרבית סטפילוקוקוס אוראוס המוליטית למחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקה לזיהוי ציטוטוקסיות של זני Staphylococcus aureus אלימים ופחות אלימים נגד נויטרופילים אנושיים בעקבות פגוציטוזה באמצעות ציטומטריית זרימה.

בדיקת ציטוטוקסיות של זני סטפילוקוקוס זהוב על נויטרופילים בעקבות פגוציטוזה

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת מטבוליטים מ סטפילוקוקוס והניתוח הבא שלהם באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ו ספקטרומטריית מסה.

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

המתוארים כאן היא שיטה לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים ברמה התאית. שיטה זו מספקת משאב ללמוד את הגיוון פנוטיפי המתרחשים בתוך אוכלוסיה חיידקי בתגובה הסביבה רקמות במהלך זיהום.

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

אנו מתארים כאן שיטה לצמיחה של זיבה Neisseria במדיום נוזלי מוגבל מתכת כדי להקל על ביטוי של גנים ספיגת מתכת. כמו כן, אנו מגדירים במטה ניסויים לאפיון הפנוטיפ של גונקוצ'י שגדל בתנאים אלה. שיטות אלה ניתן להתאים כדי להיות מתאים לאפיון של גנים התגובה מתכת בחיידקים אחרים.

מתכת-צמיחה מוגבלת של הגגורסריה של ניציבטיים לאפיון של גנים מתכתיים מגיבים ורכישת מתכות מהמארח ליגנדס

פרוטוקול זה נועד לתאר כיצד לחקור את היקף הפנמת Staphylococcus aureus ואת יכולתה לשרוד בתוך התא המארח האנושי, כמו גם את היעילות התאית של תרכובות מיקרוביאלית.

שיפור הגנה מפני אנזימים כדי לחקור הפנמת Staphylococcus aureus ויעילות תאית של תרכובות מיקרוביאלית

בכתב יד זה, אנו מספקים פרוטוקול מקיף להערכת הישרדות אנטיביוטיקה עבור Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus, הפיכת פלסמידים ל - P. aeruginosa ו- S. aureus כדי ליצור זני כתב ולדמיין וריאנטים פנוטיפיים, כגון מתמידים, על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר.

הדמיית מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר של Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus פנוטיפים הטרוגניים

חקור מנגנוני רכישת ברזל ב-Staphylococcus aureus באמצעות המוגלובין אנושי כמקור ברזל יחיד. השיטה מסייעת לזהות גורמים בקטריאליים קריטיים לצמיחה בתנאי מחסור בברזל.

צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

גלה סרטונים נוספים