צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

ניסוי זה בודק את יכולתו של סטפילוקוקוס זהוב להשתמש בהמוגלובין אנושי כמקור ברזל יחיד. ראשית, בודדו כדוריות דם אדומות מדם אנושי טרי. טהר את ההמוגלובין על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים כדי להבטיח את שלמות ההמוגלובין.

כעת הוסף המוגלובין למדיום מדולל ברזל כדי לספק את הברזל בצורה של המוגלובין תרבית Next. S reus. בנוכחות המוגלובין ולמדוד את יכולתו לנצל את ההמוגלובין כמקור ברזל.

התוצאות מראות כי ראוס מתרבה בנוכחות המוגלובין כמקור ברזל יחיד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון האם פתוגן יכול להשתמש בחלבונים מארחים כמקורות לברזל, ואילו מנגנונים נדרשים לניצול ברזל בתהליך זה. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי רכישת ברזל של סטף ראוס מההמוגלובין.

אפשר ליישם אותו גם על מחקרים של חיידקים אחרים ועל האופן שבו הם משתמשים בחלבונים שמכילים ברזל מהמארח. ידגימו את הטכניקה הזו GLA Ani וקתרין היילי מהמעבדה שלי. ראשית, השג דם אנושי מבודד טרי, בתוספת נוגד קרישה ושמור על ארבע מעלות צלזיוס לאורך כל הטיהור גלולה את כדוריות הדם האדומות על ידי צנטריפוגה למשך 20 דקות ב 15, 000 Gs.שאפו בזהירות את החטיפה והשעו בעדינות את הגלולה בקור קרח, תמיסת נתרן כלורי 0.9% לאחר שלוש כביסות, החייאה, השעו את הגלולה בנפח אחד של תריס קר כקרח 10 מילימולארי, HCL ל-RBCs על ידי לחץ אוסמוטי.

לאחר מכן מוסיפים טולואן ל-20% נפח סופי ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס על מסובב למשך הלילה. הצנטריפוגה הבאה. הליזאט ב -20,000 גרם לשעה.

אוספים את שבר ההמוליזט האמצעי, ומשאירים את שכבת הטולואן העליונה ואת הגלולה ללא הפרעה. העבירו את ההמוליזט דרך מסנן מזרק של 0.44 מיקרומטר. אם התמיסה מכילה חומר חלקיקי ולא ניתן להעביר אותה דרך המסנן, חזור על הצנטריפוגה במהירות גבוהה.

כעת טהר את ההמוגלובין עם עמודת חילופי אניונים כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. השתמש בשלב נייד A של 10 מילי-מולארי טריס, HCL, ושלב B נייד של 10 מילי-מולארי טריס, HCL בתוספת 0.5 מילי-מולארי נתרן כלורי. הפעל שיפוע של 0% עד 100% של ממס B במשך שתי דקות בקצב זרימה של שני מיליליטר לדקה.

עקוב אחר הפליטה על סמך ספיגה ב-410 ננומטר ו-280 ננומטר. אוספים את השבר המאופיין בצבע אדום בוהק ובשיא ספיגה בולט. דיאליזה של הפליטה כנגד מי מלח חוצצים פוספט למשך כ-16 שעות.

כדי לעקר את הדגימה, העבירו אותה דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר לקביעת ריכוז ההמוגלובין. הכן את הפתרונות הסטנדרטיים של HP ב-PBS. כעת מערבבים את התמיסות הסטנדרטיות או את תמיסות המדגם עם שני מגיב xra kins ביחס של אחד לאחד ב-96 צלחות באר לאחר ספיגת מדד דגירה של 15 דקות ב-540 ננומטר.

שרטט עקומה סטנדרטית וקבע את ריכוז HP של הדגימות חמישה עד 15 מיליגרם למיליליטר. התשואות הן ציטוטים אופייניים של 15 עד 20 מיקרוגרם דגימת המוגלובין מטוהר על שני ג'לים של 15% עמודי STS. יש לצבוע את אחד הג'לים ולהעביר את החלבונים מג'ל אחר על קרום ניטרוצלולוז לכתם חיסוני להקפאת המוגלובין ולאחסן מיליליטר אחד של ההמוגלובין המבודד בחנקן נוזלי מפס מלאי קפוא S aureus על טריפטיכון, אגר סויה, ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 24 שעות.

לחסן מושבות בודדות לחמישה מיליליטר של RPMI המכיל E-D-D-H-A ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-180 סל"ד למשך הלילה. גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-7, 500 Gs.לאחר מכן החייאה, השעו את החיידקים ב-RPMI המכיל 0.5 מילי-מולרי E-D-D-H-A, ונרמלו ל-OD 600 של כשלוש. לאחר מכן, הכינו את N-R-P-M-I המכיל 2.5 מיקרוגרם למיליליטר, HB ו-0.1 עד מילי-מולרי E-D-D-H-A כדי לכלוא את הברזל החופשי.

כעת, תת-תרבית של 10 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים למיליליטר אחד של N-R-P-M-I בתוספת E-D-D-H-A פלוס HP מדגרים את התרביות ב-37 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות עם טלטול ב-180 RRP M כל שש עד 12 שעות. הסר 50 מיקרוליטר מתערובת התרבות עם 150 מיקרוליטר PBS בצלחות באר 96 וקח קריאות OD 600. בטיהור HPLC זה של המוגלובין אנושי מהמוליזט, ספיגת האלואט באורכי גל של 280 ו-410 ננומטר נמדדת עם שבר חמש המכיל את ההמוגלובין.

בדרך כלל, מתקבלות תשואות של חמישה עד 15 מיליגרם המוגלובין למיליליטר לכל הכנה. ההמוגלובין המטוהר נותח על ידי דף SDS בשכפול, והג'לים היו מייצגים חלבונים או הועברו לניטרוצלולוז וכתמים חיסוניים. לאחר מכן, ההמוגלובין האנושי המטוהר נבדק ליכולתו לתמוך בצמיחה של אסוס ו-ASUS מסוג בר שחסר את קולטן ההמוגלובין הדרוש לרכישת ברזל שמקורו בהמוגלובין.

העלייה בצפיפות האופטית של התרביות לאורך זמן מצביעה על כך שב-N-R-P-M-I פלוס E-D-D-H-A פלוס hb, הסוג הפראי ASUS מתפשט, אך המוטאנט לא. לעומת זאת, היכולת להשתמש בתוספת ברזל חופשי זהה הן בזנים מסוג בר והן בזנים מוטנטיים, אף אחד מהם לא מתרבה בהיעדר מקור. בהשוואה זו של מדיה בתוספת המוגלובין מטוהר מדם טרי או המוגלובין ליופילי, ההמוגלובין המטוהר מדם דורש ISDB לגדילה.

בעוד שהמוגלובין ליופיליזציה מאפשר התפשטות של מוטנט ISDB לאחר שליטה, ניתן להשלים טיהור נכון של המוגלובין תוך מספר שעות. זכרו, התורמים הם נשאים פוטנציאליים של פתוגנים הנישאים בדם, לכן התייחסו לדם אנושי כחומר מסוכן ביולוגית.