ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על תירס rayado Fino וירוס חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב Nicotiana benthamiana צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע ניתוח נגישות ממס של שאריות ציסטין על פני חלקיקים דמויי וירוס או vlp, ואחריו קישור צולב של פפטידים לציסטינים על חלקיקים דמויי נגיף. זה מושג על ידי שיבוט ראשון של וירוס המבוך רטו פנו או חלבון MRM RF VCO בווקטור וירוס מבוסס וירוס תפוחי אדמה X. צמחי נקסט ובנאנה מחוסנים בנגיף המותאם ו-MRM RFVV PS שנוצר מחלבון המעטפת מטוהרים.

לבסוף, VLP ופפטיד מקושרים באמצעות אמוניה PEG four ide ומזוהים על ידי כתם מערבי. מתקבלות תוצאות המזהות את הייצור של קומפלקסים של פפטידים VLP באמצעות ניתוח כתמים מערביים. הטכניקה מרחיבה את בסיס הידע על פני שטח מהונדסים כימית של וירוסים וחלקיקים דמויי וירוס כדי לייצר חומר חדש לננוטכנולוגיה.

לאחר הפקת שבעה תעתיקי RNA מווירוס תפוחי אדמה X בסיס פלסמידים הנושאים mrm, RFV מסוג בר וגנים של חלבון מעטפת מוטנטי ב-CIS משתמשים בשני מינונים של 10 מיקרוליטר כל אחד כדי לחסן שניים ועלי בנאם דוגרים על הצמחים במשך 10 ימים בחממה ב-60% לחות ו-16 שעות אור ב-25 מעלות צלזיוס ושמונה שעות חושך ב-20 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה קוטפים את העלים הנגועים בנגיף, שוקלים את רקמת הצמח ומניחים אותה על קרח. לאחר טיהור החלקיקים דמויי הנגיף על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו תמיסה של מילי-מולרית אחת.

פלואורסצאין חמש IDE במאגר נתרן פוספט 50 מילי-מולרי, מערבולת EDTA pH 7.01 מילי-מולרית להמסה מלאה ושימוש בנייר אלומיניום כדי להגן על התמיסה מפני אור. מערבבים כ-30 מיקרוליטר של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר VLP ו-60 מיקרוליטר של פלואורסצאין חמש IDE ודוגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. סיים את התגובה על ידי הוספת DTT מהריכוז הסופי של 50 מילימולר באמצעות עמודת ספין התפלה.

הסר את הפלואורסצאין הלא מגיב כדי לדמיין את ה-vlp עם שאריות ציסטאין זמינות לקישור צולב. בצע ניתוח דף SDS על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של שני x מאגר דגימה ל-10 מיקרוליטר מכל תגובה. אחסן את החלבון המסומן מוגן מאור בארבע מעלות צלזיוס למשך עד חודש או בכמויות חד פעמיות בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד שלושה חודשים.

הכן תמיסת מלאי צולבת טרי על ידי המסת 10 מיליגרם של NHS Peg four IDE crosslinker ב-680 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד ממיסים פפטיד ריאות של חומצת אמינו 17 F ב-50 מיקרוליטר של מאגר צימוד בריכוז של 0.1 מילימולר. הוסף ארבעה מיקרוליטר של קרוסלינקר ל-50 מיקרוליטר של הפפטיד המומס לריכוז סופי של מילי-מולרית אחת. דגרו על התגובה במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן השתמש בעמודת התפלה כדי לטהר את התגובה באמצעות vlp עם שאריות ציסטאין זמינות לקישור צולב והפפטיד הצולב. הגדר תערובת תגובה ביחס מולארי שנקבע על ידי מספר הקבצים והאמינים המופעלים המעורבים בתגובה וההבדל במשקל המולקולרי בין vlp לפפטיד. לאחר דגירה של התגובה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, השתמש בה לביצוע דף SDS וכתמים מערביים על פי פרוטוקול הטקסט.

דוגמה לחומצות אמינו תגובתיות של חלבון MRF VCO מוצגת כאן. כל חומצת אמינו שנבחרה יכולה לשמש לחיבור חלקים אם היא חשופה על פני השטח. הטכניקות הכימיות כוללות אסטרטגיות צימוד ביולוגיות מסורתיות כגון בידוד קבוצת האמינו של ליזין, אלקילציה של קבוצת הסולף ההידרולית של ציסטין, והפעלת שאריות חומצה קרבוקסילית וצימוד עם אמינים נוספים.

בנוסף, הקבוצות הארומטיות של טירוזין וטריפטופן יכולות להוות מטרות אטרקטיביות לצימוד ביולוגי באמצעות איזציה ואלקילציה מאוירות. להלן הנגישות הממס של שאריות CIS של VLP להגשת ריאגנטים ספציפיים מטוהרים מסוג פרא vlp ו-CIS VLP הנושאים שאריות ציסטין במיקום 107 עד 111 ו-192 עד 194 של הגן CP אינם מגיבים בתנאים טבעיים עם מגיב ספציפי THI פלואורסצאין 5 IDE מעניק פלואורסצנטי כתום רק עבור מוטנט הציסטה VLP הנושא שאריות ציסטין במיקום 125 עד 129 של הגן C. התוצאה מראה כי ל-VLP בנתיב השני יש סידור גיאומטרי של שאריות ציסטין וכתוצאה מכך קבוצות קבצים חופשיות חשופות לממס, בעוד ששאריות הציסטין בדגימות בנתיב 1 ו-3 מעורבות אולי בגשרי דיס סולפיד.

בקיפול תגובות תיוג חלבון המעטפת עם IDE PEG, שני ביוטין ואחריהם בדיקת התרוממות רוח של ביוטין מייצגים דוגמה נוספת לניתוח נגישות הממס של שאריות ציס. מכיוון שביוטין הוא מולקולה קטנה יחסית, ניתן להצמיד אותו במספר עותקים ב-vlp, שכל אחד מהם שילב מולקולה אחת של אבדון כפי שמוצג כאן. רמת הביוטין, 84.74 מול של ביוטין לכל שומה של חלבון מציינת את מספר מולקולות הביוטין המחוברות ל-vlp, וכתוצאה מכך ניתן לחבר את מספר ה-ins שניתן להציג על פני השטח החיצוניים בגלל הזמינות של מספר קבוצות קבצים על פפטידי ה-vlp על ידי הצלבת תגובות עם NHS Peg four ide.

מגיב זה הוא מקשר צולב דו-תפקודי הטרו, המכיל קצוות תגובתיים כגון n הידרוקסי CIN aide או קבוצות NHS Ester ו-IDE המאפשרים צימוד קוולנטי של מולקולות המכילות אמין ו-hyd. בדוגמה זו, ה-NHS Ester מגיב עם אמינים ראשוניים היוצרים קשרי אמיד, ואילו IDE מגיב עם קבוצות הידרו סולף היוצרות קשרי תיואסטר יציבים. כפי שניתן לראות כאן, תגובות צולבות מייצרות קומפלקסים של פפטידים VLP שהם אימונו-ריאקטיביים עם הנוגדנים הספציפיים בכתם המערבי.

פיתוח זה מדגים לחוקרים בתחום הווירולוגיה כיצד לחקור את השימוש בחלקיקי וירוס כפיגום לחיבור מגוון גדול של ליגנדים במערך גיאומטרי רגיל ליישומים רבים.