Name: ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על תירס rayado Fino וירוס חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב Nicotiana benthamiana צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: חקור ניתוח נגישות שאריות ציסטאין על פני חלקיקים דמויי נגיף (VLPs) של maize rayado fino virus המיוצרים ב-Nicotiana benthamiana. למד לקשר פפטידים באמצעות כימיה של NHS-PEG4-maleimide ליישומי ננוטכנולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הרכבת חיסון נגיף וטיהור VLPs מצמחי Nicotiana benthamiana <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר תעתיקי תרי T7-RNA מתפו&quot;א וירוס X (PVX)-מבוססי פלסמידים וקטור שנשאו MRFV חלבון Cys מוטצית מעייל (CP) גנים 12, באמצעותו של Ambion T7-mMessage mMachine הקיט פראי מסוג (wt) ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תגובת תמליל T7, לחסן שני עלים התרחבו באופן מלא של נ benthamiana עם 10 תגובות μl ולדגור על הצמחים במשך 10 ימים בחממה, בתנאי לחות 60% עבור 16 שעות עם אור (25,000-30,000 לוקס) בשעת 25 ° C ו 8 שעתי חשכה בשעת 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלי Harves t נ benthamiana נגועים בנגיף 10 ימים אחרי החיסון (dpi), לשקול את רקמות הצמח (50 גרם) ומניח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומוגני חומר צמחי במערבל בנוכחות של 100 מ&quot;ל של פתרון מצונן של חיץ 0.5 מ &#39;Na-ציטראט, 5.5 pH (שימוש 2 מ&quot;ל של חיץ לגרם של רקמות צמח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן homogenate באמצעות 3 שכבות של cheesecloth ולהבהיר ידי צנטריפוגה ב27000 XG למשך 30 דקות. העברת supernatant לגליל סיים מצונן, למדוד את עוצמת קול, ולאחר מכן להעביר למבחנה סטרילית מצוננת. השלך את הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את supernatant על ידי הוספת 10% פוליאתילן גליקול 8000 (PEG 8000), מערבבים במשך 15 דקות ב 4 ° C, ודגירה במשך 45 דקות נוספות ב 4 ° C כדי להאיץ את חלקיקי נגיף הדמויים (VLPs)-PEG מטריקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במדגם 27000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הגלולה על ידי הוספת 8 מ&quot;ל של חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH מכיל 2% Triton X-100. מערבולת צינורות צנטריפוגות גם כדי לשחרר את הכדור. להעביר את הכדור והחיץ למבחנה סטרילית מצוננת. יש לשטוף את הצינורות באופן מיידי עם 2 מ&quot;ל של אותו המאגר ולהוסיף לכוס. מערבב את ההשעיה ב 4 מעלות צלזיוס עד שהכדורים מתמוססים (בדרך כלל שעות 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבהר ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב27000 XG, להשליך את הגלולה, ו-process supernatant ידי צנטריפוגה ב140.000 XG ל2 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 1 מיליליטר חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH ולמקם את ההשעיה על גבי 10-40% שיפוע סוכרוז עשה במאגר 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השיפוע עבור 3 שעות ב140.000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשפוך אור על החלק העליון של צינור צנטריפוגה ולאסוף רצועה העליונה פיזור אור ב4 סנטימטרים מהחלק העליון של הצינור, לדלל עם חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH, וצנטריפוגה ל3 שעות ב140.000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 0.5 מ&quot;ל של מים וחנות סטרילית ב 4 ° C, למשך שישה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ריכוז VLPs על ידי ביצוע בדיקת חלבון ברדפורד. התשואה של VLPs היא בין 1 ל 3 מיקרוגרם / גרם של רקמות צמח. </li></ol> 2. תגובות fluorescein-5-maleimide-תיוג של VLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של 1 mM fluorescein-5-maleimide (427.37 גרם / שומה) בphosphat נתרן 50 מ&quot;מימדואר חיץ, pH 7.0, 1 mM EDTA. מערבב בעזרת המערבולת ולוודא מסה מלאה. הגן על הצינור מן האור עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף fluorescein-5-maleimide לVLPs מיוצר בשלב 1 ולערבב. השתמש עודף טוחנת 25-קיפול של fluorescein-5-maleimide לכמות טוחנת של sulfhydryls. בדרך כלל, באמצעות 30 μl של VLPs בריכוז של מיקרוגרם 1 / μl ו60 μl של פתרון fluorescein-5-maleimide מייצר תוצאות מתקבלות על דעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התגובה ל2 שעות בטמפרטורת חדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את התגובה על ידי הוספת dithiothreitol (DTT) לריכוז סופי של 50 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר הלא הגיב fluorescein באמצעות עמודת desalting ספין (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב1500 XG בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח SDS-PAGE, להוסיף 10 μl מתוך 2 חיץ מדגם x-SDS PAGE Laemmli עד 10 μl של כל תגובה. אחסן את החלבון המסומן מוגנים מפני אור ב 4 ° C עד חודש אחד אובaliquots שימוש היחיד ב -20 ° C עד 3 חודשים. </li></ol> 3. תיוג תגובה וקביעת התאגדות ביוטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעמודות ספין desalting (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) לבצע החלפת חיץ ממים מלוחים פוספט שנאגר-(PBS), 7.0 pH של VLPs מיוצר בשלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון מנייה 20 מ&quot;מ של maleimide-PEG2-ביוטין ידי הוספת μl 190 של PBS ב-No-לשקול maleimide-PEG2-ביוטין ולערבב ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף maleimide-PEG2-ביוטין לVLPs והמערבב. השתמש עודף טוחנת 10-קיפול של ריאגנט לפתרוני VLPs ≤ 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר הלא הגיב maleimide-PEG2-ביוטין באמצעות עמודת desalting ספין (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב1500 XG בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את השומות של ביוטין לשומות של VLPs באמצעות פירס ביוטין quantitation הקיט (Thermo Scientific) וחצllowing הוראות יצרן. </li></ol> 4. Cross-linking של 2-VLPs Cys וF פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VLPs אשר הביאה שאריות ציסטאין זמינות לצלב-linking בשלב 2 (2-Cys VLPs) משמש בשלב הבא. הכן את פתרון צלב-linking מלאה טרי (28.63 מ&quot;מ) על ידי המסת 10 מ&quot;ג של מקשר צלב NHS-PEG4-maleimide בשנת 680 μl של sulfoxide דימתיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס 17 (F)-אמינו פפטיד ארוך החומצה (LLPNMOKDKEACAKAPL) ב 50 μl של חיץ צימוד (1 x PBS, 7.2 pH; 1 המ&quot;מ EDTA) בריכוז של 0.1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μl צולב מקשר עד 50 μl של פפטיד המומס (חלבון NH2) בריכוז סופי mM 1 (אשר הם עודף טוחנת 10-לקפל ל0.1 מ&quot;מ של פתרון פפטיד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התגובה ל2 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר פפטיד הצולב באמצעות עמודת desalting (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) מתאזנת עם חיץ צימוד (1 x PBS, 7.2 pH; 1 המ&quot;מ EDTA) על ידי צנטריפוגה XG ב 1500ל1 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תערובת תגובת שילוב VLPs (חלבון-SH) ופפטיד הצולב (חלבון NH2) ביחס טוחן נקבע על ידי מספר thiols ו אמין הופעל מעורב בתגובה וההבדל במשקל מולקולרי בין VLPs ופפטידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תגובת התערובת בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח כתם מערבי, לערבב את מוצר מצומד 01:01 התקבלו בLaemmli חיץ, להרתיח במשך 10 דקות, ולהמשיך בSDS-PAGE בגבס מראש 10-20% טריס-גליצין ג&#39;ל (Invitrogen), ואחריו על electroblotting קרום ניטרוצלולוזה (Invitrogen). חסום את הקרומים עם 1 x PBS, 7.2 pH המכיל 0.05% Tween-20 (PBS-Tween) ו5% אבקת חלב דל שומן ובדיקה עם נוגדני פפטיד ספציפיים ואחריו הנוגדן המשני המתאים phosphatase כותרתו. </li></ol>

<ol><li>Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnip+yellow+mosaic+virus+as+a+chemoaddressable+bionanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconj.+Chem%22%5BJournal%5D)">Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle.</a> Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).</li>
<li>Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+X+as+a+vector+for+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Potato virus X as a vector for gene expression in plants.</a> Plant J. 2, 549-557 (1992).</li>
<li>Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+of+gold+particles+in+viral+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanosci.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Packaging of gold particles in viral capsids.</a> J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).</li>
<li>Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+mosaic+virus+liquid+crystals+as+templates+for+the+interior+design+of+silica+mesophases+and+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles.</a> Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).</li>
<li>Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biomolecular+templates+for+the+fabrication+of+metal+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS.+J%22%5BJournal%5D)">Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires.</a> FEBS. J. 274, 317-322 (2007).</li>
<li>Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+a+viral+cage+for+multivalent+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation.</a> Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).</li>
<li>Hammond, R. W., Hammond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+rayado+fino+virus+capsid+proteins+assemble+into+virus-like+particles+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli.</a> Virus Res. 147, 208-215 (2010).</li>
<li>Hermamson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermamson%2C+GT+%22Bioconjugate+techniques%22">Bioconjugate techniques</a>. , Academic Press. San Diego. (1991).</li>
<li>Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+studies+of+protein+cage+nanoparticles+demonstrate+broad+tissue+distribution+and+rapid+clearance+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo.</a> Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).</li>
<li>Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotemplate+synthesis+of+3-nm+nickel+and+cobalt+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires.</a> Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).</li>
<li>Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+CuCl2+concentration+on+the+aggregation+and+mineralization+of+Tobacco+mosaic+virus+biotemplate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid.+Interface.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).</li>
<li>Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successive+deposition+of+alternate+layers+of+polyelectrolytes+and+a+charged+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus.</a> Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).</li>
<li>Natilla, A., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+rayado+fino+virus+virus-like+particles+expressed+in+tobacco+plants%3A+a+new+platform+for+cysteine+selective+bioconjugation+peptide+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display.</a> J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).</li>
<li>Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+trafficking+of+plant+virus+nanoparticles+in+mice+via+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route.</a> Virology. 343, 2224-2235 (2005).</li>
<li>Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+virus-polymer+materials.+Synthesis+and+properties+of+PEG-decorated+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus.</a> Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).</li>
<li>Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+silica-coated+Tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus.</a> J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).</li>
<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+in+the+Tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+as+biotemplates+for+materials+and+their+use+in+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).</li>
</ol>

אזכור של השמות המסחריים של מוצרים מסחריים בפרסום הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מרמז המלצה או תמיכה של משרד החקלאות האמריקנית.

השיטה שהוצגה כאן מאפשרת ניתוח מאוד רגיש ומהיר של cysteines הווה על פני השטח של VLPs בצמחים המיוצרים כמו גם במערכות חלבון אחרות תגובתי. Maleimides הם ריאגנטים thiol ספציפיים, אשר מגיבים עם מולקולות חופשיות sulfhydryl המכילים ליצור קשרי thioether יציבים. שיטה זו נשענת על הספציפיות של maleimides להגיב עם קבוצות sulfhydryl אינה מעורבת באינטראקציות עם חומצות אמינו אחרות. שימור המבנה המקורי של VLPs חשוב מאוד בכל התהליך. ביישום המתואר, התגובות מבוצעות בתנאים מקומיים וב pH 7 כדי לשמור על ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Thinwall, צינורות-Ultra Clear </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMESSAGE mMACHINE T7 קיט </td><td> Tecnologies חיים </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescein-5-Maleimide </td><td> חי טכנולוגיות מדעיות Thermo </td><td> 46130 F150 </td><td> 46130 הם מתחליף סדר עם F150 </td></tr><tr><td> ערכת quantitation ביוטין פירס </td><td> Thermo Scientific </td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-קישור Maleimide-PEG2-ביוטין, אף לשקול פורמט </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM n Crosslinkers (PEG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% טריס-גליצין ג&#39;ל </td><td> Invitrogen </td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Laemmli המאגר </td><td> Bio-Rad </td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td> טריס גליצין SDS ריצת המאגר </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td> טריס גליצין העברת המאגר </td><td> Invitrogen </td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td> כריך נייר מסנן ממברנה ניטרוצלולוזה </td><td> Invitrogen </td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td> זיקת שכותרת phosphatase מטוהרי נוגדני IgG לארנב </td><td> Kirkegaard ומעבדות פרי </td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> תשתית phosphatase NBT / BCIP </td><td> Kirkegaard ומעבדות פרי </td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em&gt; תירס rayado fino וירוס</em&gt; חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em&gt; nicotiana benthamiana</em&gt; צמחים וקישור צולב של פפטידים לvlps

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

חיקוי וניצול מאפייני נגיף ומאפייני physicochemical ופיסיים טומן בחובו הבטחה לספק פתרונות לכמה מהאתגרים הקשים ביותר בעולם. המגוון והסוגים של וירוסים יחד עם המאפיינים המסקרנים הצרופים פוטנציאלי לתת אינספור הזדמנויות ליישומים בטכנולוגיות וירוס מבוססים. וירוסים יש את היכולת עצמית להרכיב לתוך חלקיקים בעלי צורה דיסקרטית וגודל, סגולי של סימטריה, polyvalence, ומאפיינים יציבים תחת מגוון רחב של תנאי טמפרטורה וחומציות. שלא במפתיע, עם מגוון עשיר כל כך של תכונות, וירוסים מוצעים לשימוש בחומרים ביולוגיים 9, חיסונים 14, 15, חומרים אלקטרוניים, כלים כימיים, ו11 מיכלים מולקולריים אלקטרוניים 4, 5, 10, 16, 18, ​​12. על מנת לנצל וירוסים בננוטכנולוגיה, הם חייבים להיות שונים מהצורות הטבעיות שלהם כדי להקנות פונקציות חדשות. זה יחסי ציבור מאתגריםocess יכול להתבצע באמצעות מספר מנגנונים כולל הנדסה גנטית של הגנום הנגיפי וכימיות הצמדת מולקולות זרות או רצויות לקבוצות תגובתי חלקיקי וירוס 8. היכולת לשנות וירוס בעיקר תלויה במאפייני physiochemical ופיסיים של הנגיף. בנוסף, שינויים הגנטיים או physiochemical צריכות להתבצע מבלי להשפיע על המבנה ותפקוד יליד וירוס וירוס לרעה. (MRFV) חלבוני מעייל rayado תירס Fino וירוס עצמי להרכיב בחיידקי Escherichia ייצור VLPs היציב וריק שהם התייצבו על ידי בין חלבונים אינטראקציות ושניתן להשתמש ביישומים מבוססי טכנולוגיות וירוס 8. VLPs מיוצר בצמחי טבק נבדק כפיגום עליו מגוון של פפטידים ניתן להציג 13 קוולנטית. כאן, אנו מתארים את השלבים ל1) תקבעו מי מcysteines ממס הנגיש בcapsid וירוס זמין לmodifiקטיון, ו2) Bioconjugate פפטידים לcapsids השונה. באמצעות שאריות דובר או mutationally הוכנסו-חומצת אמינו וטכנולוגיות צימוד סטנדרטיות, במגוון רחב של חומרים שמוצגים על פני השטח של וירוסי צמחים כגון, וירוס Brome פסיפס 3, וירוס mottle ציפורנים 12, Cowpea chlorotic mottle 6 וירוס, פסיפס טבק וירוס 17, וירוס לפת צהוב פסיפס 1, וMRFV 13.

ביטוי זמני של גני חלבוני מוטצית MRFV מעייל (CP) בנ צמחי benthamiana בVLPs ייצור הווקטור PVX מבוסס מתוארים באיור 1. גן חלבון מעייל MRFV modified מוגבר באמצעות PCR ולאחר מכן תחת שליטת התעתיק של אמרגן CP subgenomic המשוכפל בוקטור PVX מבוסס, pP2C2S 2, (מתנה של ד Baulcombe, מעבדות סיינסבורי, נוריץ&#39;, אנגליה). ב תעתיק הרנ&quot;א מבחנה מייצר תעתיקי רנ&quot;א אז המשמשים לחסן נ צמחי benthamiana. בצמחים הנג...

שיטה לנתח את נגישות הממס של קבוצת thiol של שאריות ציסטאין של<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; (MRFV) חלקיקי וירוס דמוי (VLPs) ואחריו תגובה של פפטיד צלב-linking מתוארים. השיטה מנצלת את הזמינות של מספר קבוצות כימיות על פני השטח של VLPs שיכול להיות מטרה לתגובות ספציפיות.

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבצע אנליזה של נגישות לממס (solvent accessibility) של שאריסי Cysteine על פני השטח של חלקיקים דמויי נגיף (virus-like particles או VLPs), ולאחריה קישור צולב (cross-linking) של פפטידים ל-Cysteine בחלקיקים דמויי הנגיף. דבר זה מושג תחילה על ידי שיבוט של חלבון המעטפת של Maize rayado fino virus או MRFV בתוך וקטור נגיפי המבוסס על נגיף תפוחי אדמה X. לאחר מכן, צמחי N. benthamiana מוחדרים עם הנגיף המודגנ, ו-MRFV VLPs הנוצרים מחלבון המעטפת מטוהרים. לבסוף, VLPs ופפטידים מקושרים באמצעות ammonia-PEG4-maleimide ומזוהים באמצעות western blot. התוצאות המתקבלות מאשרות את ייצורם של קומפלקסי VLP-פפטיד באמצעות אנליזת western blot. טכניקה זו מרחיבה את בסיס הידע על האופן שבו ניתן לבצע שינוי כימי של פני השטח של נגיפים וחלקיקים דמויי נגיף ליצירת חומרים חדשים עבור ננוטכנולוגיה.לאחר הפקת תעתוקי Capped T7-RNA מפלסמידי וקטור המבוססים על potato virus-X הנושאים את הגנים של חלבון המעטפת של MRFV מסוג wild type ושל מוטציית cys, השתמשו בשתי מנות של 10 µL כל אחת כדי להחדיר אותן לשני עלי N. benthamiana. דגרו את הצמחים למשך 10 ימים בחממה בלחות של 60%, עם 16 שעות של אור בטמפרטורה של 25 °C ושמונה שעות של חושך בטמפרטורה של 20 °C. בסיום הדגירה, קצרו את העלים שנדבקו בנגיף, שקלו את רקמת הצמח והניחו אותה על קרח. לאחר טיהור חלקיקי דמוי-נגיף (VLPs) בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו תמיסה של 1 mM של Fluorescein-5-maleimide בבופר סודיום פוספט 50 mM, pH 7.0, ו-1 mM EDTA. ערבבו ב-Vortex עד להמסה מלאה והשתמשו בנייר אלומיניום כדי להגן על התמיסה מאור. ערבבו כ-30 µL של 1 µg/µL של VLPs עם 60 µL של Fluorescein-5-maleimide ודגרו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4 °C. סיימו את התגובה על ידי הוספת DTT בריכוז סופי של 50 mM. השתמשו בעמודת ספינט להסרת מלחים (desalting spin column) כדי להסיר פלואורסצאין שאינו ריאקטיבי. כדי להמחיש את ה-VLPs בעלי שאריות ציסטאין זמינות לקשירה צולבת, בצעו אנליזת SDS page על ידי הוספת 10 µL של 2x sample buffer ל-10 µL מכל תגובה. אחסנו את החלבון המסומן במיגון מאור ב-4 °C למשך עד חודש, או במנות לשימוש חד-פעמי ב-20 °C- למשך עד שלושה חודשים.הכינו תמיסת מלאי רעננה של חומר מקשר (crosslinking stock solution) על ידי המסה של 10 milligrams של NHS-PEG4-maleimide crosslinker ב-680 microliters של dimethyl sulfoxide. המיסו פפטיד באורך 17 (F)-amino acid ב-50 microliters של בופר קונג'וגציה (conjugation buffer) בריכוז של 0.1 millimolar. הוסיפו ארבעה microliters של חומר מקשר ל-50 microliters של הפפטיד המומס כדי להגיע לריכוז סופי של one millimolar. דגרו את התגובה במשך שעתיים בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius. לאחר מכן, השתמשו בעמודת ניתוק מלחים (desalting column) כדי לטהר את התגובה. השתמשו ב-VLPs עם שארירי cysteine זמינים לקישור צולב ובפפטיד המקשור, והכינו תערובת תגובה ביחס מולרי שנקבע לפי מספר התיאולים והאמינים הפעילים המעורבים בתגובה וההבדל במשקל המולקולרי בין ה-VLPs לפפטיד. לאחר דגירה של התגובה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, השתמשו בה לביצוע SDS page ו-western blotting בהתאם לפרוטוקול הכתוב.כאן מוצגת דוגמה לחומצות אמינו רקוטיביות של חלבון המעטפת של MRFV. ניתן להשתמש בכל חומצת אמינו שנבחרה לחיבור קבוצות פונקציונליות, בתנאי שהיא חשופה על פני השטח. הטכניקות הכימיות כוללות אסטרטגיות ביו-קונגוגציה מסורתיות, כגון אצילציה של קבוצת האמינו של ליזין, אלקיליזציה של קבוצת הסולפחידריל של Cysteine, והפעלה של שאריות חומצה קרבוקסילית וצימוד עם אמינים מתוספים.בנוסף, הקבוצות הארומטיות של טירוזין וטריפטופאן יכולות להוות מטרות אטרקטיביות לביו-צמידה (bio conjugation) באמצעות דיאזוטציה ואלקילציה. מוצגת כאן הנגישות של ממס לשארי Cys של VLPs עבור ריאגנטים ספציפיים לטיול. VLPs מסוג בר (wild type) מופרשים ומוטציות cys-VLP הנושאות שארי Cysteine בעמדות 107 עד 111 ו-192 עד 194 של הגן CP אינם מגיבים בתנאים טבעיים עם ריאגנט ספציפי לטיול. Fluorescein-5-maleimide מקנה פלואורסצנציה כתום רק עבור מוטציית Cys-VLP הנושאת שארי Cysteine בעמדות 125 עד 129 של הגן CP. התוצאה מראה כי ל-VLPs במסלול השני יש סידור גיאומטרי של שארי Cysteine הגורם לקבוצות טיול חופשיות החשופות לממס, בעוד ששארי Cysteine בדגימות במסלולים אחד ושלוש מעורבות ככל הנראה בגשרי די-סולפיד בקיפול של חלבון המעטפת. תגובות סימון עם maleimide-PEG2-biotin, ולאחריהן בדיקת ביוטינילציה, מהוות דוגמה נוספת לניתוח נגישות ממס לשארי cys. מכיוון שביוטין הוא מולקולה קטנה יחסית, ניתן להצמידו במספר עותקים ל-VLPs, כאשר כל אחד מהם שילב מולקולה אחת של אווידין כפי שמוצג כאן. רמת הביוטינילציה, 84.74 מול של ביוטין למול של חלבון, מצביעה על מספר מולקולות הביוטין המחוברות ל-VLPs, ובשנית, על מספר הליגנדים שניתן להציג על פני השטח החיצוניים. בשל זמינותן של מספר קבוצות טיול על ה-VLPs, ניתן לחבר פפטידים באמצעות תגובות קישור צולב (crosslinking) עם NHS-PEG4-maleimide.ריאגנט זה הוא מקשר צולב (crosslinker) הטרו-ביפונקציונלי, המכיל קצוות פעילים כגון N-hydroxy succinimide או NHS-Ester וקבוצות maleimide, המאפשרים צימוד קוולנטי של מולקולות המכילות אמינים וסולפהידריל. בדוגמה זו, ה-NHS Ester מגיב עם אמינים ראשוניים ויצור קשרי אמייד, בעוד ש-maleimide מגיב עם קבוצות סולפהידריל ויצור קשרי תיואסטר יציבים. כפי שניתן לראות כאן, תגובות קישור צולב מייצרות קומפלקסים של VLP-פפטיד שהם אימונוריאקטיביים לנוגדנים ספציפיים ב-western blot.פיתוח זה מדגים לחוקרים בתחום הוירולוגיה כיצד לחקור את השימוש בחלקיקי וירוס כפיגום להיצמדות של מגוון רחב של ליגנדים במערך גיאומטרי סדיר עבור יישומים רבים.

analysis-solvent-accessibility-cysteine-residues-on-maize-rayado-fino

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מחקר זה מתאר שיטה המאפשרת אבחון המהיר וברור של מחלות נגיפיות בצמחים כחצי יום באמצעות שילוב של הכנה במיקרוגל בסיוע מפעל לדוגמה עבור מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים ושיטות צביעה שליליות.

מיקרוגל Assisted אבחון מהיר של מחל וירוס צמח על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

רמת תגובתי מינים החמצן הוא גבוה כאשר תאים נתקלים בתנאי עקה. כאן אנו מציגים דוגמה מכתים diaminobenzidine '3'-3, כמו גם תיוג cysTMT ו ספקטרומטריית מסה לפרופיל proteome חיזור...

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

חלקיקים נגיפיים צמח (VNPs) מבטיחים פלטפורמות ליישומים ביו. כאן, אנו מתארים את ההליכים להתפשטות צמח VNP, טיהור, אפיון, וbioconjugation. לבסוף, אנו מראים את היישום של VNPs לביות והדמית גידול תוך שימוש במודל עכבר xenograft ודימות פלואורסצנטי.

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש "תגים" מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמין לשפלת proteasomal של חלבונים.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

קביעת מבנה פתרון של חלבון על ידי פיזור קטן זווית קרני רנטגן (SAXS) דורש דגימות monodisperse. כאן, אנו מציגים שתי אפשרויות על מנת להבטיח עיכובים מינימאליים בין הכנת מדגם ורכישת נתונים: כרומטוגרפיה בגודל הדרה מקוון (SEC) כרומטוגרפיה היון-Exchange Online (IEC).

גודל הדרה מקוונת ו כרומטוגרפיה יון-חליפין על beamline SAXS

ניתוחים הביוכימי ומבניים של חלבונים glycosylated דורשים כמויות גדולות יחסית של דגימות הומוגנית. כאן, אנו מציגים שיטה כימית יעילה עבור גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים מטוהרים של חיידקים על ידי מיקוד תיולים Cys תגובתי.

מכוונת ציסטאין תיולים במבחנה גליקוזילציה בייעודי לאתר של חומרים

כאן, אנו מציגים את הליך כדי fluorescently functionalize את disulfides על האח מים Qβ עם dibromomaleimide. אנו מתארים Qβ ביטוי טיהור, הסינתזה של מולקולות dibromomaleimide-functionalized, ואת התגובה ההטיה בין dibromomaleimide לבין Qβ. וכתוצאה מכך צהוב הניאון מצומדת החלקיק יכול לשמש מכשיר בדיקה קרינה פלואורסצנטית בתוך תאים.

ביצוע הנוצרות על-ידי ההטיה של חלקיקים דמויי וירוס PEGylated פלורסנט מאת כימיה Dibromomaleimide-דיסולפידי

אנו מציגים פרוטוקול כללי לזיהוי קטעים קצרים של רצפי חלבון הומוולוגי מארח-הפתוגן (SSHHPS) מוטבע polyprotein הנגיפי. SSHHPS מזוהים על ידי הפרוטסים נגיפי ולהפנות את ההרס המיועד של חלבונים מארחים ספציפיים על ידי מספר וירוסים הקבוצה הרביעית.

ניתוח של הקבוצה הרביעית ויראלית שימוש במבחנה ובשיטות סיליקו

פרוטוקול זה מתאר את הבחירה של סמנים פלסמודסמליים אופטימליים עבור ניתוחים מבוססי מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיקוד חלבונים לפלסמודסמאטה במהלך אינטראקציות וירוס-פלסמודסמאטה או הובלה פלסמודסמלית.

ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיון חלבונים לפלסמודסמאטה בניקוטיאנה בנטמיאנה

חקור ניתוח נגישות שאריות ציסטאין על פני חלקיקים דמויי נגיף (VLPs) של maize rayado fino virus המיוצרים ב-Nicotiana benthamiana. למד לקשר פפטידים באמצעות כימיה של NHS-PEG4-maleimide ליישומי ננוטכנולוגיה.

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על תירס rayado Fino וירוס חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב Nicotiana benthamiana צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs (וידאו) | JoVE Journal

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על

גלה סרטונים נוספים