חי הדמיה של תגובות סמים בmicroenvironment הגידול במודלים עכבריים של סרטן השד
24 במרץ 2013
אנו מתארים שיטה לתגובת הדמיה לטיפול נגד הסרטן In vivo, ברזולוציה של תא בודדה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב בזמן אמת אחר חדירת תרופות ותגובה טיפולית למתן תרופה טיפולית. זה מושג על ידי טיפול ראשון בבעל החיים בתרופה. לאחר מכן, בלוטת החלב המפשעתית המכילה את הגידול נחשפת על ידי יצירת דש עור.
לאחר מכן העכבר מועבר לשלב המיקרוסקופי ונמדדים ריווי החמצן בדם וקצב הדופק ומוחדר קו מגורים למתן נוזלים ותרופות או צבע. לבסוף, תמונות זמן-lapse נרכשות לניתוחים מאוחרים יותר. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים במוות תאי או באינטראקציות סטרומה של גידול בתגובה לתרופה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב חי של גידולי חלב בעכברים.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרו-סביבה של הגידול, כגון כיצד מרכיבי סטרומה שונים של גידול משפיעים על התגובה לטיפול. לפני שמתחילים, עיין בפרוטוקול הכתוב ללוחות זמנים אופייניים למתן תרופות והדמיה. הפעל מעקר חרוזים חם ותן לו להגיע לפחות 200 מעלות צלזיוס.
לאחר שטיפת כלי הניתוח במים וסבון, כולל זוג מלקחיים עם שיניים, זוג מלקחיים משוננים ושני זוגות מספריים, השתמש במעקר החרוזים החם כדי לעקר אותם למשך 30 שניות לפחות. ואז תנו להם. קריר. הנח ספוג מעבדה על גבי מכסה הקלקר שישמש כפלטפורמה כירורגית.
השתמש בסרט מעבדה כדי להצמיד חרוט אף עם קו למערכת ההרדמה למשריית המעבדה ומחט מסוימת בגודל 18 על סנטימטר וחצי דרך הסרט למכסה הקלקר משני צידי חרוט האף כדי לשמור על חרוט האף מאובטח במקומו. הניחו בצד גזה סטרילית של בטדין. שני מגבוני איזופרופנול 70%, שקופית מיקרוסקופ, דבק סופר וארבע חתיכות של סרט מעבדה ברוחב חצי אינץ'.
לאחר הרדמת החיה בתא אינדוקציה, כאשר היא נושמת עמוק ולאט לאט העבירו את העכבר למשטח הניתוח, כשצד הגחון פונה כלפי מעלה. כדי למנוע לחץ גבוה, פתח את קו ההרדמה למשטח הניתוח ולאחר מכן סגור את קו ההרדמה לתא האינדוקציה. הפחת את ריכוז האיזופלורן מ-4% ל-2.5%בדוק שעומק ההרדמה מספיק לניתוח על ידי ביצוע צביטה בכרית כף הרגל.
אם בעל החיים אינו מגיב, השתמש בארבע חתיכות של סרט מעבדה כדי להדק את גפיו למשטח הניתוח והשתמש בסכין גילוח חשמלי כדי להסיר את השיער משטח הגחון. השתמש במגבונים איזופרופנול 70%, ולאחר מכן בטדין שנמרח על גזה סטרילית כדי לחטא את פני הגחון של החיה באמצעות מספריים ומלקחיים עם שיניים. בצע חתך קו אמצע גחוני תת עורי מכשלושה מילימטרים מעל השופכה לתהליך הקסיפואיד.
הקפד להימנע מניקוב או חיתוך הצפק בעזרת המספריים והמלקחיים המשוננים. ניתק בעדינות את העור מחלל הצפק עם בלוטת החלב המפשעתית המכילה את הגידול להדמיה עדיין מחובר. מקם שקופית מיקרוסקופ זכוכית על דש העור כך שעיקר הגידול יושב שטוח ברגע שהעכבר מונח על הבמה, וכדי שהוא לא ייחסם על ידי הגפיים האחוריות.
לאחר ששקופית המיקרוסקופ הוצבה כראוי, השתמש בדבק סופר כדי לחבר את השקופית למשטח החיצוני של העור. הסר את סרט המעבדה המאבטח את גפיו של בעל החיים. פתח את קו ההרדמה לשלב המיקרוסקופ, ולאחר מכן סגור את קו ההרדמה למשטח הניתוח.
העבר במהירות את החיה לשלב המיקרוסקופ לאחר העברת החיה, מקם ואבטח את קו ההרדמה וחרוט האף כדי להבטיח שהעכבר יישאר מורדם ונמצא במצב נוח. הפחת את ריכוז האיזופלורן ל-1.5%חשוף את הגידול כך שהוא ממוקם על גבי ובמרכז אחת מיציאות ההדמיה המכוסות זכוכית בשלב המיקרוסקופ. הכנס את הקו התוך-צפקי השוכן עם ערכת עירוי מכונפת המחוברת למזרק מיליליטר אחד המכיל תמיסת מלח PBS סטרילית או מי מלח עם פרופידיום יודיד.
כאשר מחדירים את הקו התוך-צפק, הזריקו לבעל החיים 100 מיקרוליטר מלח עם פרופידיום יודיד והמשיכו להזריק 50 מיקרוליטר מי מלח עם פרופידיום יודיד כל שעה עד לסיום סשן ההדמיה. בעזרת חלקי העיניים, ודא שהגידול ממוקם נכון והודבק בעדינות במורד שקופית המיקרוסקופ והקו התוך-צפק. יש לאבטח את המגלשה בצורה רופפת מספיק כדי שזרימת הדם לרקמה לא תיחסם.
הדבקת שקופית המיקרוסקופ עוזרת למזער את חפצי ההדמיה המוכנסים על ידי נשימת החיה כדי לרכוש תמונות זמן-lapse. השתמש במיקרו-מנהל תוכנת הקוד הפתוח, הידור וניתוח הנתונים הגולמיים באמצעות IRIS או תוכנת ניתוח תמונות אחרת. גדילי DExT מצומדים פלואורסצנטיים יכולים לשמש כסמן חלופי להעברת תרופות לרקמות.
מוצגת כאן הגעתם של שני מגה-דלטון דקסטרן IV מצומדים שהוזרקו לעכבר המבטא חלבון פלואורסצנטי כחול בתאי סרטן השד. לאחר הגעת התרופה לגידול, ניתן לדמות אקסטרוואזציה ודיפוזיה כדי לקבוע את מחצית החיים התוך-וסקולרית ואת הפצת התרופה. כאן, מוצגת האקסטרוואזציה וההפצה של 10 קילו-דלטון דקסטרן IV מצומד LOR המוזרק לעכבר המבטא חלבון פלואורסצנטי כחול בתאי סרטן השד וחלבון פלואורסצנטי ירוק בתאים מיאלואידים.
הדמיה יכולה לספק מידע לגבי סוג המוות התאי שתאי הסרטן עוברים. כאן, שינויים גרעיניים מבניים המעידים על נמק או אפופטוזיס נצפים בעכבר המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק מצומד לשני b. לאחר טיפול בדוקסורוביצין, מוות של תאי סרטן המושרה על ידי כימותרפיה מביא לעתים קרובות לגיוס תגובתי של תאים חיסוניים לגידולים.
הנה דוגמה לתגובה סטרומלית זו לטיפול חריף בדוקסורוביצין בעכבר המבטא חלבונים פלואורסצנטיים כחולים וירוקים בסרטן השד ובתאים מיאלואידיים בהתאמה. בנוסף להמחשת התגובה הסטרומלית הכוללת לכימותרפיה, ניתן לדמיין כאן גם תגובות סטרומליות מיוחדות. הפגוציטוזה של חומר תאים נמק על ידי תא שכן מוצגת לאחר שליטה.
טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 30 עד 60 דקות וניתן לדמות בעלי חיים במשך 12 עד 40 שעות אם היא מבוצעת כראוי.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לדימות התגובה לטיפול נגד סרטן in vivo ברזולוציה של תא בודד. הטכניקה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר חדירת התרופה והתגובה הטיפולית בגידולי שד של עכברים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- טכניקות דימות
רקע
- הבנת האינטראקציות בסביבה המיקרוסקופית של הגידול היא קריטית לטיפול בסרטן.
- דימוי בזמן אמת יכול לספק תובנות לגבי יעילות ומסירת תרופות.
- דימוי ברזולוציה של תא בודד משפר את ההבנה של תגובות תאיות.
- טכניקות של דימוי חי חיוניות למחקר של תהליכים ביולוגיים דינמיים.
מטרת המחקר
- למעקב אחר חדירת תרופות לגידולים.
- לניתוח תגובות טיפוליות ברמה התאית.
- לחקירת האינטראקציות בין תאי הגידול לרכיבי הסטרומה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- נעשה שימוש במודלים של עכברים עם גידולי מושתלים לצורך דימוג.
- דימוג במרווחי זמן (Time-lapse) בוצע באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם דיסקה מסתובבת.
- מתן התרופה נוטר באמצעות קטטר קבוע.
- נעשה שימוש בסמנים פלורסצנטיים כדי להמחיש את התפלגות התרופה ותגובות תאיות.
תוצאות עיקריות
- דימוי בזמן אמת חשף שינויים במות תאים ובאינטראקציות עם הסטרומה של הגידול.
- סממנים מצומדים פלואורסצנטית הדגימו הובלה יעילה של התרופה.
- הדימוי סיפק תובנות לגבי סוג מות התאים המתרחש בגידולים.
- נצפו תגובות סטרומליות לכימותרפיה, אשר הדגישו גיוס תאי חיסון.
מסקנות
- השיטה מאפשרת ניתוח מפורט של תגובות טיפוליות בגידולים.
- דימיון בזמן אמת יכול להעמיק את ההבנה לגבי יעילות התרופה.
- גישה זו יכולה להנחות אסטרטגיות עתידיות לטיפול בסרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה בזמן אמת של התפלגות תרופות ושל אינטראקציות בין הגידול לסטרומה במודלים של עכברים חיים מאפשרת הפחתת סיכונים מכנית של טיפולים אונקולוגיים על ידי קישור החשיפה הפרמקוקינטית לתגובה הפרמקודינמית. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות ובביטחון ניבוי במודלים פרה-קליניים על ידי לכידה של תהליכים ביולוגיים דינמיים המשפיעים על יעילות התרופה. השיטה מסייעת במיון פורטפוליו על ידי זיהוי מוקדם של מנגנוני עמידות המתווכים על ידי הסטרומה כבר בשלבי הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של חדירת תרופות ומות תאי סרטן בזמן אמת.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על נדידת תאי סטרומה וגיוס תאי מערכת החיסון בעקבות הטיפול.
- ערך חיזוי: תומך בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי חשיפה של האופן שבו אינטראקציות בסביבת המיקרו של הגידול מושפעות מהתגובה לתרופה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי עבודה המשכיים, על ידי קביעת מדדי ייחוס כמותיים לפיזור תרופות ולתגובתיות הסטרומה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות של הבדיקה באמצעות דימוי בשיטת Time-lapse של ממשקי גידול-סטרומה עקביים.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה עבור מועמדים למספר תרופות ותצורות סטרומה שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על הרלוונטיות למחלה על ידי לכידה של תגובות סטרומליות המשקפות תצפיות קליניות של גיוס תאי מערכת החיסון לאחר כימותרפיה.
- סנכרון פרה-קליני: מקשרת בין ממצאי הגילוי לאישוש פרה-קליני באמצעות נקודות סוף מדידות, כגון מוות של תאי סרטן ונדידה סטרומלית.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת בסיס להחלטות המשך (go/no-go) באמצעות כימות של מחסומים המתווכים על ידי הסטרומה ליעילות התרופה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת קריאות דינמיות של חשיפה לתרופה ותגובה ביולוגית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי קישור אספקת תרופות לתוצאות תאיות במיקרו-סביבות גידול שלמות.
- סריקה: מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות פתחי דימות סטנדרטיים ורכישת תמונות בשיטת time-lapse הניתנת לשחזור.
- אנליזה: מאפשרת השוואה כמותית של התפלגות תרופות, קינטיקה של מוות תאי ונדידה של תאי סטרומה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול תגובות סטרומה המנבאות השפעות של תרופות המתווכות על ידי מערכת החיסון.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמת דימות הניתנת לשימוש חוזר להערכת תרופיות מגוונות במודלים שונים של סרטן השד.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באינטראקציות בין תרופה, גידול וסטרומה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות פרוטוקולים של הכנה כירורגית ודימות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי זיהוי מוקדם של מנגנוני עמידות ביולוגיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון המבוסס על פרופילים של אינטראקציה עם הסטרומה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים בעכברים, ניהול הרדמה וטכניקות של דימוי intravital.
- תלוי במיקרוסקופיה קונפוקלית מסוג spinning disk, במערכות במה בעלות בקרת טמפרטורה ובתשתית לסימון פלורסצנטי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להכנת גידולים, הולכת תרופות ורכישת תמונות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה למודלים שונים של גידולים, הרכבים של הסטרומה וחומרים טיפוליים.
- מוגבל על ידי משך הדימוי (עד 40 שעות) וארטיפקטים פוטנציאליים הנובעים מתנועת בעל החיים או מנשימה.
