Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את יכולתם של שני מיני חיידקים להתחרות זה בזה כאשר הם משגשגים באותה נישה. בפרט, נעריך את תפקידה של מערכת ההפרשה מסוג 6 או סוג 6 בתהליך תחרות זה. זה מושג על ידי הכנת לוחות קלט בדיקה עם תאי תורם עם סוג שש פעיל או תאי טרף, שיהפכו ללוחות בקנה מידה OnX כחול.

לאחר מכן מכינים לוחות פלט בדיקה שעליהם משולבים זני התורם והשבח. לאחר מכן, הצלחות מודגרות כדי לאפשר פעילות מסוג שש להתרחש. לאחר מכן מכינים דילול סדרתי מלוחות הקלט והפלט, והתרביות המדוללות נצפו על לוחות הקלט והפלט של הקריאה.

מתקבלות תוצאות המראות הבדלים בדומיננטיות של הצבע הכחול בכל נקודה על סמך תצפית חזותית פשוטה המצביעה על הישרדות תאי הטרף בכל מקרה. ככל שיותר כחול פירושו יותר הישרדות טרף ולכן פעילות הרג ירודה של התאים התורמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ספירת יחידות יוצרות מושבה, הוא ששיטה זו קלה ולא גוזלת זמן ומאפשרת הערכה ישירה של פעילות סוג שש כנגד טרף נתון.

לכן הטכניקה הזו מעריכה את פעילות אטמי החיידקים בתרביות מעורבות, ולכן היא עשויה לעזור להבין מדוע חלק מהזיהומים הפולימיקרוביאליים הכרוניים נשלטים בסופו של דבר על ידי מין חיידקי אחד, כמו במקרה של פסאודומונה שין בריאות של חולי סיסטיק פיברוזיס. כדי להתחיל פסאודומונס ברוטו תאי תורם אירוגן שהם סוג שש פעיל D חיובי או סוג שש לא פעיל D שלילי על לוחות LB אגר או LBA למשך הלילה ב -37 מעלות צלזיוס. בדוגמה המוצגת כאן, השתמשנו בזן RET S של פסאודומונס אירוגן, בעל H אחד פעיל מכונן סוג שש, ומוטציה איזוגנית עם מחיקה של מהנדס אשכול הגנים H אחד סוג שש, תא מקבל E coli או טרף על ידי הפיכת DH חמש אלפא עם פלסמיד, מה שמאפשר השלמת אלפא של הגן החסר.

בודד את החיידקים ממאגר גליצרול ב-LB עם XGL ואנטיביוטיקה מתאימה ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס למחרת. בחר ובחר שנאים כחולים והכין תרבית לילה בחמישה מיליליטר של טריפטיכונים מרק סויה או TSB עם אנטיביוטיקה גדל תחת תסיסה ב -37 מעלות צלזיוס לניסוי למחרת הכינו צלחות LBA המסומנות כקלט בדיקה לזנים, D חיובי, D, שלילי ו- P ופלט בדיקה עבור D שלילי פלוס P ו- D חיובי פלוס P. עבור כל תרבית תאי קלט, מדוד את הצפיפות האופטית וחשב את הנפח הנדרש כדי להשיג צפיפות תאים שווה ערך ליחידה אחת OD 600. אוספים כל תרבית בצינור מיקרו סטרילי של 1.5 מיליליטר.

לאחר פיילוט דגימות החיידקים ב-13,000 סל"ד למשך דקה אחת ו-Resus משהה את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של TSB טרי לחסן 10 מיקרוליטר מכל זן כנקודה אחת על לוחית הקלט A. לאחר מכן, מערבבים בעדינות 30 מיקרוליטר של D חיובי עם 30 מיקרוליטר של P ובצינור שני, 30 מיקרוליטר של D שלילי עם 30 מיקרוליטר P.לאחר מכן יש לחסן את פלט A של הצלחת עם נקודה של 20 מיקרוליטר מכל תערובת. לאחר שאפשרו לכתמים להתייבש ליד אוטובוס ומבער, דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר הרג חיידקים.

כדי לנתח את ביצועי הריגת החיידקים, הכינו לוחות LBA המכילים 40 מיקרוגרם למיליליטר xal. לקריאת הבדיקה, סמן את קלט קריאת הלוחות כדי לזהות חיידקים מבודדים או פלט החוצה כדי לזהות תרביות חיידקים מעורבות בגב כל צלחת המחולקת לארבעה חלקים שווים, וסמן את הקטע אפס 10 למינוס אחד, 10 למינוס שתיים ו-10 למינוס שלוש. כל דילול יאפשר הערכה כמותית למחצה של יחס החיידקים הלבנים הכחולים באותה נקודה.

בעזרת לולאה סטרילית, אספו את כתמי החיידקים הבודדים מלוח הקלט A ומלוחית הפלט A והשעו מחדש כל נקודה בצינורות מיקרו נפרדים של 1.5 מיליליטר המכילים מיליליטר אחד של TSB. לנער את הצינורות למשך 30 דקות כדי להשעות מחדש את החיידקים בזמן שהתרביות רועדות. הכן חמש סטים של שלושה צינורות מיקרו שכל אחד מהם מכיל 900 מיקרוליטר TSB.

לאחר מכן החל מכל נקודה מושעה, הכינו דילולים סדרתיים פי עשרה באמצעות טיפים טריים ומערבולת קצרה בין נקודת הדילול כל דילול על לוחות LVA xal, החל מהדגימה המדוללת ביותר וכלה בדגימה הלא מדוללת. ציפוי צינורות הקלט A על לוחות הקלט R ודילול הפלט A על לוחות הפלט R לכל נקודת שחזור 20 מיקרוליטר במשולש בתוך כל רבע. כדי לכמת את חיבור התחרות בשלב זה לוחית 100 מיקרוליטר מתוך 10 עד מינוס שלושה דילולים מדגימות פלט A בשלוש עותקים על לוחות LBA xga דוגרים לילה ב -37 מעלות צלזיוס וסופרים מושבות כחולות באזור סטרילי משאירים את הלוחות פתוחים כדי לאפשר לעודפי נוזלים להיספג ורווח החממה בן לילה ב -37 מעלות צלזיוס, באותה תקופה עדיין מתרחשת הרג.

מכיוון ששני הזנים עדיין במגע לתמונת ניתוח הפלט או סרוק את הלוחות. כתמים שנותרו כחולים ברובם מצביעים על כך שאי קולי לא נהרג. כפי שמקובל בתרבית עם זן הפוזיס הפגום מסוג שש המוצג, להלן דילול סדרתי עבור לוחות קלט הקריאה עבור הזנים המשמשים בבדיקה זו.

כצפוי, ה-e coli pre spots P על פני ביטוי הגן החסר מופיעים כחולים במדיה בתוספת XGL, בעוד שהאף התורם p aerogen זנים D חיובי סוג 6 פעיל ו-D שלילי סוג 6 נשארים לבנים. לוחות פלט הקריאה שעליהם זוהה התערובת בין הטרף לזן פעיל מסוג D חיובי P מראים את היעלמותו של הטרף הכחול, ובכך מצביעים על כך שהוא נהרג. זה מדגים את יכולתו של התורם להתחרות בטרף.

ההתמדה של הצבע הכחול על לוחית P שלילית D מדגימה את חוסר היכולת של תורם לא פעיל מסוג 6 להרוג את הטרף הכחול. לכן בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהדרישות לגדילה או לפעילות הפרשה מסוג 6 עשויות להשתנות מזן חיידק אחד למשנהו, ולכן ייתכן שיהיה צורך במעט התאמה של מערך הניסוי. בנוסף, עליכם גם לזכור שאם אתם רוצים להעריך את פעילות ההפרשה מסוג 6 במין אחד, חשוב מאוד גם להשוות בקפדנות את הפעילות של מוטנט הפרשה מסוג 6 עם הזן ההורי במידת האפשר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין טוב יותר כיצד להגדיר חיבור חזותי כדי להעריך את ההישרדות של תאים מקדימים לאחר שהם נמצאים במגע עם מיומן מסוג 6 או זן פגום מסוג 6.