Name: Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: למדו שיטה חזותית להערכת תחרות חיידקית באמצעות מערכת הפרשה מסוג T6SS ב-Pseudomonas aeruginosa. השיטה מאפשרת הערכה ישירה של הישרדות תאי Escherichia coli ופעילות חיסונית בין חיידקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome מענק WT091939MA. אלן Filloux נתמך על ידי החברה המלכותית.

1. זני חיידקים ותרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להנדס תא נמען Escherichia coli (Prey, P) על ידי ההפיכה (באמצעות 2 CaCl טיפול הסטנדרטי או electroporation) 15 E. coli תאי DH5α עם פלסמיד המאפשר-complementation של גן lacZ (טבלה 1). פלייט התאים הפכו על צלחות אגרו וריא-Bertani (LBA, אגר 1.5%) המכילים 5-bromo-4-כלורו-β-indolyl-D-galactopyranoside (X-גל) במינון 40 מ&quot;ג / מיליליטר ריכוז סופי ואנטיביוטי מתאימים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולמחרת בבוקר בחר לtransformants הכחול (ראה § 1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את תאי תורם aeruginosa Pseudomonas הT6SS פעילים (ד +) או T6SS-פעיל (D-) (טבלה 1) בלילה בLBA 37 ° C. בדוגמא מובאת כאן השתמשנו פ retS aeruginosa להתאמץ בעלH1-T6SS constitutively פעיל 16 ומוטציה isogenic עם מחיקה של אשכול גני H1-T6SS (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להכין תרבות נוזלית לילה בבקבוק סודה על ידי inoculating שיבוט כחול בהיר בין א &#39; transformants coli (P) מהצלחת מתוארת ב§ 1.1, ב5 מ&quot;ל של מרק הסויה tryptic (TSB) בתוספת עם האנטיביוטיקה המתאימה. לגדול תחת תסיסה ב 37 מעלות צלזיוס המשך באותה מידה עם מושבה יחידה של (D +) ושל (ד -) מהצלחת המתוארת ב§ 1.2. </li></ol> 2. Assay תחרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחות LBA לניסוי למחרת. ודא צלחות אלו יובשו כראוי (או ליד המבער בונזן או בקבינט זרימה שכבתית). הכן &quot;Assay-קלט&quot; (קלט) צלחת לזנים (D +), (ד -), ו (P </strong&gt;). הכן צלחת לזנים &quot;Assay פלט&quot; (פלט) (ד - + P) ו( D + + P). פרד ולתייג את הצלחות בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צמיחה בין הלילה (ראה § 1.3), למדוד את הצפיפות האופטית (OD 600nm) של תרבות חיידקי הקלט (ד &#39;-, D + ו-P) ולחשב את הנפח הנדרש להשגת צפיפות תאים שווי ערך ליחידת OD 600nm 1 של כל זן . לכל תרבות תא &quot;קלט&quot; (ד -, D + ו-P) בתחילה נאסף בצינורות של 1.5 מיליליטר Eppendorf סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את דגימות חיידקים ב13000 סל&quot;ד במהלך דקות 1 בטמפרטורת חדר ולזרוק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדורים של D -, D + תרבויות, וP, ב100 μl של TSB הטרי על ידי pipetting העדין ולחסן 10 מ&quot;ל של כל אחד Corresponding מתח כנקודה אחת על &quot;הקלט&quot; הצלחת (שהוכן ב§ 2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן &quot;הפלט&quot; צלחת (שהוכן ב§ 2.1). לייתר דיוק, לערבב בעדינות 30 μl של (+ D) עם 30 μl (P) ו30 μl של (ד -) עם 30 מ&quot;ל (P) בשני צינורות Eppendorf נפרדים (שים לב שהתרבויות משמשות הן אלה המתוארים ב§ 2.4) . לחסן 20 μl של התערובות (D + / P) ו( ד - / P) כמו כתמים בודדים על &quot;הפלט&quot; צלחת. אפשר לייבש את הנקודות סמוך מבער בונזן ולמקם את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך תקופה מתאימה של זמן שבמהלך הרג החיידקים מתרחש. במקרה של פ aeruginosa, הרג חיידקים יעיל נצפה לאחר דגירת 5 שעות כאשר משווים לT6SS פעיל עם זן פגום T6SS. </li></ol> 3. תצפית איכותית של tהוא הורג את החיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחות LBA המכילים 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​X-gal לreadout של assay. הצלחות תיקראנה &quot;קלט readout&quot; או &quot;R-קלט&quot; כדי לזהות חיידקים מבודדים או &quot;פלט readout&quot; או &quot;R-פלט&quot; לזהות תרבויות חיידקים מעורבות ובכך לקרוא את ביצועי הרג. צלחות אלו צריכים גם להיות מיובשים כהלכה. חלוק את הצלחת בארבעה חלקים שווים על הגב ותסמן חלקים אלה 0, 10 -1, 10 -2 ו10 -3, מייעד את הדילולים של תרבות חיידקים למקום על הצלחות אגרו (ראה § 3.3). הדילול יאפשר הערכה חצי כמותית של יחס חיידקים הכחול / לבן באותה הנקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עם לולאת סטרילי נקודתי החיידקים הבודדות מהצלחת &quot;קלט&quot; (ראה § 2.4) ו&quot; פלט &quot;צלחת (ראה § 2.5) וresuspend כל מקום בצינורות 1.5 מ&quot;ל Eppendorf שונים המכילים 1 מ&quot;ל של TSB. הנח באפנדורף ייקר בלוק במהלך 30 דקות לresuspend יעילותחיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרה של 5 3 פעמי צינורות Eppendorf המכילים 900 μl של TSB ולהמשיך לכל מקום resuspended לעשרה דילולים סידוריים קיפול עד 10 -3. הקפד להחליף טיפי פיפטה ולמערבולת 5 שניות בין כל שלב דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך אל התצפית של הדילולים חיידקיים הוכנו ב§ 3.3 על צלחות שיובשו היטב LBA המכילים 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​X-gal על ידי מתחיל עם מדולל ביותר להשעיה המרוכזת, מה שהופך את &quot;R-הקלט&quot; צלחות אלה ל&quot; &quot;כתמים ואת&quot; קלט הפלט &quot;R-צלחות עבור&quot;-פלט הכתמים &quot;(איור 2). מערבולת בקצרה כל צינור לפני שימשיך לתצפית לשמור השעית חיידקים הומוגנית. לשחזור של התוצאות, 20 μl נקודה בשלושה עותקים בתוך ריבוע (איור 2). היובש היחסי של הצלחת שלך הוא חשוב בשלב זה שכן את הכתמים צריכים להישאר בנפרד מופרד בצלחת ולא לגלוש לכיוון זה. כימות של assay התחרות אפשרית גם בשלב זה של הניסוי. בעקבות הצעד 3.3, התפשט 100 μl של 10 -3 הדילול על צלחות המכילות 40 מיקרוגרם LBA / מ&quot;ל X-gal. לשחזור של התוצאות, המשך לציפוי בשלושה עותקים לכל נקודה מ&quot; הפלט &quot;צלחת. מקם את צלחות הדילול בלילה 37 (מקבילים לדגירת שעות 16) מעלות צלזיוס חממה. המשך לספירת המושבות הכחולות (תאי P שנותרו בחיים). תוצאות אופייניות שהתקבלו לאחר 5 שעות של תחרות מוצגות באיור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הצלחת הפתוחה (ללא מכסה) בתוך שטח סטרילי כדי לאפשר את ספיגת הנוזלים עודפים בתוך כל מקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניס את צלחת 37 מעלות צלזיוס חממה בן לילה. במהלך זמן דגירה זה, ההרג עדיין מתרחש בתמהיל (D + / P) מאז שני הזנים עדיין במגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונהאו לסרוק את הצלחות שלך לניתוח הפלט (איור 2). איפה הנקודות נשארו ברובם כחולות הוא מציין כי א coli לא נהרג על ידי פ &#39; aeruginosa. זה מה שקורה כאשר א coli מעורבב עם פ T6SS-פגום מתח aeruginosa (D-) (איור 2, צלחת בפינה הימנית התחתונה). </li></ol>

<ol><li>Filloux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+type+VI+secretion+machine%3A+yet+another+player+for+protein+transport+across+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes.</a> Microbiology. 154 (6), 1570(2008).</li>
<li>Cascales, E., Cambillau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+type+VI+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural biology of type VI secretion systems.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102(2012).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+T4+tail+and+tail+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers.</a> Virol. J. 7, 355(2010).</li>
<li>Ballister, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+self-assembly+of+tailorable+nanotubes+from+a+simple+protein+building+block%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733(2008).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+apparatus+and+phage+tail-associated+protein+complexes+share+a+common+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154(2009).</li>
<li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+translocates+a+phage+tail+spike-like+protein+into+target+cells+where+it+cross-links+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508(2007).</li>
<li>Ma, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+effector+requires+bacterial+endocytosis+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells.</a> Cell Host Microbe. 5 (3), 234(2009).</li>
<li>Hood, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+targets+a+toxin+to+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25(2010).</li>
<li>Russell, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+delivers+bacteriolytic+effectors+to+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells.</a> Nature. 475 (7356), 343(2011).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+type+VI+secretion+effector+recognition+by+a+cognate+immunity+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002613(2012).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+anti-amoebae+and+anti-bacterial+activities+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> PLoS One. 6 (8), (2011).</li>
<li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathog. 6 (8), e23876(2010).</li>
<li>Murdoch, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opportunistic+pathogen+Serratia+marcescens+utilizes+type+VI+secretion+to+target+bacterial+competitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors.</a> J. Bacteriol. 193 (21), 6057(2011).</li>
<li>Boyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+bacterial+type+VI+secretion+system+by+a+genome+wide+in+silico+analysis%3A+what+can+be+learned+from+available+microbial+genomic+resources%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?</a> BMC Genomics. 10, 104(2009).</li>
<li>Maniatis, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring, NY. (1982).</li>
<li>Mougous, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virulence+locus+of+Pseudomonas+aeruginosa+encodes+a+protein+secretion+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus.</a> Science. 312 (5779), 1526(2006).</li>
<li>Records, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system%3A+a+multipurpose+delivery+system+with+a+phage-like+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751(2011).</li>
<li>Hachani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+secretion+and+multimerization+of+VgrG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins.</a> J. Biol. Chem. 286 (14), 12317(2011).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

השיטה שהוצגה במאמר זה מאפשרת תצפית חזותית של פעילות / bacteriostasis T6SS בתיווך bactericidal. הבדיקה מבוצעת על פני השטח של צלחת אגרה. זה כבר הראה בעבר כי assay ההרג T6SS תלוי הופיע עם תרבות חיידקי נוזל המעורבת הוא לא יעיל, סביר להניח בגלל חוסר קשר יציב בין שני החיידקים 8. T6SS הוא האמין פעולה עם מנגנון דומה לזו ששמשה את bacteriophages להזריק דנ&quot;א לתוך תאי המטרה 17. בתרבות של נוזל, המבנה דמוי צינור של T6SS עלול להישבר בקלות רבה יותר, קשר בין החיידקים יכול ללכת לאיבוד, ואת הרעלים לא יעיל מועברים. במונחים של זמני דגירה, 5 השעות הראשונות של קשר שאנו מתארים בין המתח התורם והטרף מספיקות כדי להתבונן הרג חיידקים בין פ aeruginosa וא coli, כמוצג באיור 3 </strong&gt;. עם זאת, רצוי להתאים את זמן הדגירה על ידי ביצוע קינטית על מנת לייעל את תנאי הניסוי. מאחר ושיטה זו היא טכניקת צבע מבוססת, תוצאות הפלט יכולים להיות בסכנה על ידי פיגמנטציה של זן התורם. לדוגמה, במקרה של פ aeruginosa, זנים מסוימים לייצר רמות גבוהות של פיגמנטים צבעוניים כגון pyocyanin וpyoverdine, אשר יכול להפריע לreadout assay, מה שהופך את ההבחנה מהטרף קשה יחסית. מצעים אחרים chromogenic β-גלקטוזידאז, כמו מגנט גל או גל אדום, יכולים לשמש במקום X-gal (טבלה 1). Assay התחרות יכול לעשות שימוש בגנים מדווחים אחרים להודעה. לדוגמה, בדיקה דומה גם בוצעה באמצעות 12 פושט חלבון פלואורסצנטי ירוק שכותרתו. הבדיקה שלנו, ואילו לא כמותית, נותנת אינדיקציה טובהפעילות T6SS מאחר שהוא מבוסס על ההישרדות או ההרג של טרף כתב. טכניקה זו מציגה את היתרון של להיות קל ונוח להערכת הפעילות / bacteriostasis bactericidal של T6SSs מכל מיני חיידקים. עד כה, הפעילות של T6SS הוכחה כנגד חיידקים גראם שליליים, ואין דוגמה מובהקת לחיידקי T6SS רגישים גראם חיוביים כבר דווח עדיין 12. זה גם ברור שאי התאמה בתרבות של מיני חיידקים השונים לבדיקה (למשל צמיחת טמפרטורה, חמצון, תקשורת הספציפית) היא להילקח בחשבון. הבדיקה שלנו יכולה לשמש גם כדי להעריך איזה ממרכיבי T6SS הם חיוניים משום שגם עקבות של רעל מופרש עשויות להיות מספיק כדי להרוג את הטרף. גם פעילות חלשה של T6SS יכולה אז ברורה להיות מזוהית על ידי הבדיקה שלנו, בהשוואה להפרשה סטנדרטית הליך בדיקת T6SS תלוית תרבות באמצעות כתם supernatant והמערביניתוח. עם זאת, יחידת ספירה נכונה מושבת יוצרים (CFU) עדיין נדרשה לכימות מדויק של פעילות T6SS זה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> aeruginosa פ PAKΔ retS (D +) (T6SS הפעיל) </td><td> זן מעבדה </td><td></td><td> תאר בעיון 16 </td></tr><tr><td> פ aeruginosa PAKΔ retS Δ H1-T6SS (ד -) (T6SS לא פעיל) </td><td> מחקר זה </td><td></td><td> אשכול H1-T6SS (הכולל את גני PA0070 לPA0095) נמחק על ידי חילופי allelic ביצוע הנוהל המתואר בעיון 18. הבר המוטטורי נוצר עם הסט הבא של primers: בפריימרים הבר עד: 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;, ו 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &quot;. את פריימרים הבר מטה: 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;, <pre style=";text-align:right;direction:rtl"> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E.coli DH5α </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> ה-F-φ80 lac ZΔM15 Δ (Lac ZYA-arg F) U169 rec A1 סוף A1 HSD R17 (r - k, מ &#39;יא +) Pho sup E44-λ thi -1 gyr A96 rel A1 </td></tr><tr><td> pBluescript השני SK (+) </td><td> Agilent </td><td> 212205 </td><td> וקטור זה מבטא את הפפטיד של α β-גלקטוזידאז משמש לα-complementation. </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> השתמש ב 40 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> אגר וריא Bertani </td><td> Merck-כימיקלים </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (קזאין סויה מרק) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> גאון ורטקס ייקר 3 </td><td> איקא </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> סורק </td><td> Epson </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> ספקטרופוטומטר </td><td> WPA Biowave </td><td> מד צפיפות תאים CO8000 </td><td></td></tr><tr><td> מגנט גל </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> גל אדום </td><td> מחקר אורגני </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. זנים, חומר ומגיב פלסמיד בשימוש. </td></tr></tbody></table>

assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי t6ss בתיווך

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

מערכות הפרשת VI סוג ב &#39;(T6SSs) הן נאנומכונות המולקולרית המאפשרת לחיידקים גראם שליליים, להובלה ולהזריק חלבונים לתוך מגוון רחב של 1,2 תאי המטרה. T6SS מורכב של 13 רכיבי ליבה ומציגה דמיון מבני עם זנב הצינור של bacteriophages 3. Phage משתמש צינור ומכשיר ניקוב לחדור את מעטפת התא של חיידקי היעד ולהזריק DNA. מוצע כי T6SS הוא מכשיר bacteriophage הפוך יצירת נתיב ספציפי במעטפת תא החיידק לנהוג effectors ורעלים אל פני השטח. התהליך יכול לקחת עוד יותר ומכשיר T6SS יכול לנקב תאים אחרים שבה החיידק נמצא במגע, ולכן הזרקת effectors ליעדים אלה. צינור הזנב וחלקי מכשיר התיקתוק של T6SS הם עשו עם חלבוני VgrG HCP ו, בהתאמה 4,5. הרבגוניות של T6SS הודגמה דרך היםtudies באמצעות חיידקים פתוגנים שונים. את T6SS cholerae Vibrio יכול לשפץ את cytoskeleton של תאי מארח האיקריוטים ידי הזרקת VgrG &quot;התפתח&quot; נושא C-מסוף יקטין cross-linking תחום 6,7. עוד דוגמה בולטת תועדה לאחרונה באמצעות aeruginosa Pseudomonas שתוכל למקד ולהרוג חיידקים באופן T6SS תלוי, ולכן מקדם את הקמתה של חיידקים מיקרוביאליים בנישות ספציפיות וסביבה התחרותית 8,9,10. במקרה האחרון, שלוש T6SS-מופרשים חלבונים, כלומר Tse1, Tse2 וTse3 זוהו כרעלים המוזרקים בחיידקי היעד (איור 1). התא התורם מוגן מפני השפעה המזיקה של effectors אלה דרך מנגנון אנטי רעל, בתיווך Tsi1, Tsi2 וTsi3 חלבוני החסינות 8,9,10. פעילות מיקרוביאלית זה יכול להיות במעקב כאשר חיידקי T6SS-מיומנים הם שיתוף טפח על היםolid משטחים בתחרות עם מיני חיידקים אחרים או עם חיידקי T6SS-לא פעילים מאותו המין 8,11,12,13. הנתונים הזמינים הדגישו גישה מספרית לבדיקת תחרות חיידקים, כוללים ספירת CFU זמן רבה שתלויה במידה רבה על מקבלים אנטיביוטיים. במקרה של זנים עמידים בפני אנטיביוטיקות כמו פ aeruginosa, שיטות אלה יכולים להיות בלתי הולמים. יתר על כן, עם זיהוי של כ 200 לוקוסים T6SS שונים בלמעלה מ 100 הגנום של חיידקים 14, כלי מיון נוחים רצויים מאוד. פתחנו assay כי הוא קל לשימוש ואינו דורש חומרי מעבדה סטנדרטיים וחומרים כימיים. השיטה מציעה טכניקה מהירה ואיכותית כדי לפקח על פעילות T6SS התלוי bactericidal / bacteriostasis באמצעות לחץ כתב כטרף (במקרה זה חיידקי Escherichia DH5α) המאפשר-complementation של גן lacZ. בסך הכל, בשיטה זו היא ללפותיק ומאפשר זיהוי מהיר של פנוטיפים T6SS הקשורות בצלחות אגרו. פרוטוקול ניסוי, זה יכול להיות מותאם לזנים אחרים או מיני חיידקים תוך התחשבות בתנאים מסוימים, כגון תקשורת צמיחה, טמפרטורה או זמן של קשר.

תוצאות אופייניות מוצגות באיור 1 עם הזנים וריאגנטים המתוארים בטבלה 1. הצלחות שמוצגות בתרשים זה נסרקו לאחר דגירת לילה. את &quot;readout-הקלט&quot; לוחיות להראות דפוס דילול סדרתי לזנים המשמשים בבדיקה זו. כצפוי, ה חיידק טורף נקודות (P) overexpressing גן lacZ מופיעים כחול על תקשורת בתוספת עם X-גל, ואילו התורם פ זני aeruginosa (D +, T6SS פעיל) ו( ד -, פעיל T6SS) נותר לבן. את &quot;readout-הפלט&quot; צלחות שבתמהיל בין הטרף ומתח פעיל T6SS (D + / P) נצפה להראות את היעלמותו של הכחול ובכך הטרף המצביעות על זה כבר נהרג. זה מדגים את יכולתו של התורם לoutcompete הטרף. ההתמדה של הצבע הכחול על (ד - / P) צלחת מדגימה את חוסר היכולת של תורם T6SS פעיל להרוג טרף הכחול. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. הריגתו של א coli ידי פ T6SS-בקיא aeruginosa. פ aeruginosa מזריק רעלים לE. coli תא המטרה באופן T6SS תלוי (המוצג על ידי החץ הלבן). שני רעלים Tse1 וTse3 (כתום ועיגול אדום) מוזרקים לתוך E. periplasm coli ולבזות 9 peptidoglycan. רעל Tse2 (העיגול צהוב) מוזרק לתוך E. coli ציטופלסמה ויש לו פעילות bacteriostatic 8,10. הפעולה המשולבת של הרעלים הורגת את תאי המטרה (ברק הגולגולת). ההישרדות של תאי המטרה יכולה להיות מזוהית על ידי ניטור הפעילות של β-גלקטוזידאז הפיק (ראה גם איור 2). פeruginosa מוגן מפני פעילותם של רעלנים על ידי חלבוני חסינות Tsi1, Tsi2 וTsi3 (כתום, ריבועים צהובים ואדומים, בהתאמה) 8,9,10. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> איור 2. assay הצלחת אגר לפקח הרג חיידקי T6SS תלוי בדמות זו מוצגת בחלק העליון את &quot;readout-הקלט&quot; הצלחות המורכבות מהדילולים הסידוריים של D -., D +, ותאי קלט P. תאי קלט P הם כחולים בשל α-complementation של גן lacZ והפיקו עד β-גלקטוזידאז שדבק X-gal. בחלק התחתון מוצגת את &quot;readout-הפלט&quot; צלחות בהיקף של דילולים סידוריים של התמהיל בין החיידקים הפעילים (D + / P) </strאונג&gt;, או לא פעיל (ד - / P), T6SS התורם פ מתח aeruginosa עם E. coli טרף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. כימות של ההרג של E. coli על ידי פ aeruginosa לאחר דגירת 5 שעות. הגרף מציג ספירת CFU של E. coli שמתואר בשלב 3.4. התוצאות מוצגות כאן מראים את הבדל בין 3-לקפל T6SS + וT6SS-הזנים, המצביעות על כך שרוב ההרג מתרחש במהלך 5 השעות הראשונות של קשר.

אנו מתארים assay איכותי לפקח תחרות חיידקים מתווכת על ידי<em&gt; Aeruginosa Pseudomonas</em&gt; מערכת הפרשת הסוג שישי (T6SS). הבדיקה מסתמכת על ההישרדות / הרג של תאי מטרת coli Escherichia נושאים<em&gt; LacZ</em&gt;-כתב. טכניקה זו היא מתכווננת כדי להעריך את הפעילות / bacteriostasis bactericidal של מיקרואורגניזמים T6SS-מיומנים.

Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את יכולתם של שני מיני חיידקים להתחרות זה בזה כאשר הם משגשגים באותה נישה. בפרט, נעריך את תפקידה של מערכת ההפרשה מסוג 6 או סוג 6 בתהליך תחרות זה. זה מושג על ידי הכנת לוחות קלט בדיקה עם תאי תורם עם סוג שש פעיל או תאי טרף, שיהפכו ללוחות בקנה מידה OnX כחול.לאחר מכן מכינים לוחות פלט בדיקה שעליהם משולבים זני התורם והשבח. לאחר מכן, הצלחות מודגרות כדי לאפשר פעילות מסוג שש להתרחש. לאחר מכן מכינים דילול סדרתי מלוחות הקלט והפלט, והתרביות המדוללות נצפו על לוחות הקלט והפלט של הקריאה.מתקבלות תוצאות המראות הבדלים בדומיננטיות של הצבע הכחול בכל נקודה על סמך תצפית חזותית פשוטה המצביעה על הישרדות תאי הטרף בכל מקרה. ככל שיותר כחול פירושו יותר הישרדות טרף ולכן פעילות הרג ירודה של התאים התורמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ספירת יחידות יוצרות מושבה, הוא ששיטה זו קלה ולא גוזלת זמן ומאפשרת הערכה ישירה של פעילות סוג שש כנגד טרף נתון.לכן הטכניקה הזו מעריכה את פעילות אטמי החיידקים בתרביות מעורבות, ולכן היא עשויה לעזור להבין מדוע חלק מהזיהומים הפולימיקרוביאליים הכרוניים נשלטים בסופו של דבר על ידי מין חיידקי אחד, כמו במקרה של פסאודומונה שין בריאות של חולי סיסטיק פיברוזיס. כדי להתחיל פסאודומונס ברוטו תאי תורם אירוגן שהם סוג שש פעיל D חיובי או סוג שש לא פעיל D שלילי על לוחות LB אגר או LBA למשך הלילה ב -37 מעלות צלזיוס. בדוגמה המוצגת כאן, השתמשנו בזן RET S של פסאודומונס אירוגן, בעל H אחד פעיל מכונן סוג שש, ומוטציה איזוגנית עם מחיקה של מהנדס אשכול הגנים H אחד סוג שש, תא מקבל E coli או טרף על ידי הפיכת DH חמש אלפא עם פלסמיד, מה שמאפשר השלמת אלפא של הגן החסר.בודד את החיידקים ממאגר גליצרול ב-LB עם XGL ואנטיביוטיקה מתאימה ודגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס למחרת. בחר ובחר שנאים כחולים והכין תרבית לילה בחמישה מיליליטר של טריפטיכונים מרק סויה או TSB עם אנטיביוטיקה גדל תחת תסיסה ב -37 מעלות צלזיוס לניסוי למחרת הכינו צלחות LBA המסומנות כקלט בדיקה לזנים, D חיובי, D, שלילי ו- P ופלט בדיקה עבור D שלילי פלוס P ו- D חיובי פלוס P. עבור כל תרבית תאי קלט, מדוד את הצפיפות האופטית וחשב את הנפח הנדרש כדי להשיג צפיפות תאים שווה ערך ליחידה אחת OD 600. אוספים כל תרבית בצינור מיקרו סטרילי של 1.5 מיליליטר.לאחר פיילוט דגימות החיידקים ב-13,000 סל"ד למשך דקה אחת ו-Resus משהה את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של TSB טרי לחסן 10 מיקרוליטר מכל זן כנקודה אחת על לוחית הקלט A. לאחר מכן, מערבבים בעדינות 30 מיקרוליטר של D חיובי עם 30 מיקרוליטר של P ובצינור שני, 30 מיקרוליטר של D שלילי עם 30 מיקרוליטר P.לאחר מכן יש לחסן את פלט A של הצלחת עם נקודה של 20 מיקרוליטר מכל תערובת. לאחר שאפשרו לכתמים להתייבש ליד אוטובוס ומבער, דגרו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר הרג חיידקים.כדי לנתח את ביצועי הריגת החיידקים, הכינו לוחות LBA המכילים 40 מיקרוגרם למיליליטר xal. לקריאת הבדיקה, סמן את קלט קריאת הלוחות כדי לזהות חיידקים מבודדים או פלט החוצה כדי לזהות תרביות חיידקים מעורבות בגב כל צלחת המחולקת לארבעה חלקים שווים, וסמן את הקטע אפס 10 למינוס אחד, 10 למינוס שתיים ו-10 למינוס שלוש. כל דילול יאפשר הערכה כמותית למחצה של יחס החיידקים הלבנים הכחולים באותה נקודה.בעזרת לולאה סטרילית, אספו את כתמי החיידקים הבודדים מלוח הקלט A ומלוחית הפלט A והשעו מחדש כל נקודה בצינורות מיקרו נפרדים של 1.5 מיליליטר המכילים מיליליטר אחד של TSB. לנער את הצינורות למשך 30 דקות כדי להשעות מחדש את החיידקים בזמן שהתרביות רועדות. הכן חמש סטים של שלושה צינורות מיקרו שכל אחד מהם מכיל 900 מיקרוליטר TSB.לאחר מכן החל מכל נקודה מושעה, הכינו דילולים סדרתיים פי עשרה באמצעות טיפים טריים ומערבולת קצרה בין נקודת הדילול כל דילול על לוחות LVA xal, החל מהדגימה המדוללת ביותר וכלה בדגימה הלא מדוללת. ציפוי צינורות הקלט A על לוחות הקלט R ודילול הפלט A על לוחות הפלט R לכל נקודת שחזור 20 מיקרוליטר במשולש בתוך כל רבע. כדי לכמת את חיבור התחרות בשלב זה לוחית 100 מיקרוליטר מתוך 10 עד מינוס שלושה דילולים מדגימות פלט A בשלוש עותקים על לוחות LBA xga דוגרים לילה ב -37 מעלות צלזיוס וסופרים מושבות כחולות באזור סטרילי משאירים את הלוחות פתוחים כדי לאפשר לעודפי נוזלים להיספג ורווח החממה בן לילה ב -37 מעלות צלזיוס, באותה תקופה עדיין מתרחשת הרג.מכיוון ששני הזנים עדיין במגע לתמונת ניתוח הפלט או סרוק את הלוחות. כתמים שנותרו כחולים ברובם מצביעים על כך שאי קולי לא נהרג. כפי שמקובל בתרבית עם זן הפוזיס הפגום מסוג שש המוצג, להלן דילול סדרתי עבור לוחות קלט הקריאה עבור הזנים המשמשים בבדיקה זו.כצפוי, ה-e coli pre spots P על פני ביטוי הגן החסר מופיעים כחולים במדיה בתוספת XGL, בעוד שהאף התורם p aerogen זנים D חיובי סוג 6 פעיל ו-D שלילי סוג 6 נשארים לבנים. לוחות פלט הקריאה שעליהם זוהה התערובת בין הטרף לזן פעיל מסוג D חיובי P מראים את היעלמותו של הטרף הכחול, ובכך מצביעים על כך שהוא נהרג. זה מדגים את יכולתו של התורם להתחרות בטרף.ההתמדה של הצבע הכחול על לוחית P שלילית D מדגימה את חוסר היכולת של תורם לא פעיל מסוג 6 להרוג את הטרף הכחול. לכן בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהדרישות לגדילה או לפעילות הפרשה מסוג 6 עשויות להשתנות מזן חיידק אחד למשנהו, ולכן ייתכן שיהיה צורך במעט התאמה של מערך הניסוי. בנוסף, עליכם גם לזכור שאם אתם רוצים להעריך את פעילות ההפרשה מסוג 6 במין אחד, חשוב מאוד גם להשוות בקפדנות את הפעילות של מוטנט הפרשה מסוג 6 עם הזן ההורי במידת האפשר.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין טוב יותר כיצד להגדיר חיבור חזותי כדי להעריך את ההישרדות של תאים מקדימים לאחר שהם נמצאים במגע עם מיומן מסוג 6 או זן פגום מסוג 6.

a-visual-assay-to-monitor-t6ss-mediated-bacterial-competition

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Speare, L., et al. בדיקת חממת מטבעות לכימות אינטראקציות תחרותיות בין מבודדי Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים בדיקת דגירה משותפת המשמשת לחקר האופן שבו זני חיידקים מתחרים בסביבה משותפת. הוא מיושם באופן נרחב במיקרוביולוגיה כדי לזהות מנגנונים, כגון הרג תלוי מגע או הרג שאינו תלוי במגע, המניעים אינטראקציות אלה.

בדיקת חממת מטבעות לחקר אינטראקציות תחרותיות בין זני חיידקים

מקור: פרינבם, ק., וסיריאפורן, א. בדיקת אלימות חיידקית מהירה מבוססת תמונה באמצעות אמבה. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים שיטה מהירה מבוססת תמונה להערכת אלימות חיידקים על ידי דגירה של אמבות עם חיידקים מחוברים למשטחים או פלנקטוניים, יישום פד אגרוז קלציין-אצטוקסיתיל (calcein-AM), ודימות פלואורסצנציה לזיהוי נזק לתאי המארח.

בדיקה מהירה מבוססת תמונה לסינון אלימות חיידקית הנגרמת על פני שטח

סרטון זה מדגים שיטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תחרות חיידקים ברמת התא הבודד. שיטה זו מספקת תובנות לגבי המבנה והתפקוד של קהילות חיידקים.

בדיקת דגירה משותפת של חיידקים: טכניקה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לדמיין תחרות חיידקית תוך ספציפית ברמת התא הבודד

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת הפעילות החיידקית בתיווך משלים של נוגדנים הנמצאים בסרום. גישה זו משלבת סרום מבודד עם חיידקים פתוגניים וחלבוני השלמה אקסוגניים. עם הדגירה, החיידקים גדלים על צלחת אגר, ואת המושבות המיוצרות מכומתים כדי למדוד את titer bactricidal בסרום.

בדיקה חיידקית בסרום לפעילות חיידקית בתיווך משלים של נוגדנים

חיידקים עשויים לצבור מוטציות מזיקות או מועילות במהלך חייהם. באוכלוסייה של תאים אנשים שצברו מוטציות מועילות עשויים במהירות עולים על חבריהם. כאן אנו מציגים הליך פשוט כדי לדמיין תחרות intraspecies באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן באמצעות אנשים בעלי תווית פלואורסצנטית.

ניטור תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים חיידקיים על ידי Cocultivation של זנים שכותרתו פלואורסצנטית

מתוארות שתי בדיקות לבדיקת תפוקה גבוהה מבוססת מיקרוסקופיה של גורמי מארח המעורבים בזיהום ברוצלה. בדיקת הכניסה מזהה גורמי מארח הנדרשים לכניסת ברוצלה ובדיקת נקודת הקצה הנדרשים לשכפול תוך תאי. בעוד שרלוונטי לגישות חלופיות, בדיקת siRNA בתאי HeLa משמשת להמחשת הפרוטוקולים.

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

ניתן להשתמש בבדיקת עיכוב הגדילה הנדחית כדי להעריך את השפעת התחרות על ידי חיידק מבודד אחד על אחר. עיכוב מכומת על ידי מדידת אזור הפינוי סביב המבודד המייצר מעכב, או מוערך באופן איכותי על ידי קביעת היקף העיכוב הנראה לעין.

צמיחה נדחית Assay העיכוב לכמת את ההשפעה של antimicrobials הנגזר חיידקים על תחרות

זו גישה מולקולרית מבוסס לקביעת כושר חיידקי מאפשר זיהוי מדויק ומדויק של מיקרואורגניזמים באמצעות ברקודים ייחודי DNA גנומית כי הם כימות דרך ה-PCR הדיגיטלי. הפרוטוקול מתאר חישוב המדד תחרותי עבור זני סלמונלה ; עם זאת, הטכנולוגיה ניתנת להתאמה בקלות לפרוטוקולים הדורשים קוונפיקציה מוחלטת של אורגניזם גנטית מחושל.

דיגיטלי PCR מבוססי אינדקס תחרותי עבור ניתוח תפוקה גבוהה של כושר בסלמונלה

חיידקים לקודד מנגנונים שונים לעוסקים בתחרות הבינחיידקית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על תרבות לאפיון אינטראקציות תחרותיות בין מבודד חיידקי וכיצד הם משפיעים על המבנה המרחבי של אוכלוסיה מעורבת.

המשך הדגירה של האינטראקציה התחרותית בין vibrio פישרי מבודד

כתב יד זה מתאר שיטה לשימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית חד-תאית כדי לדמיין ולתמת תחרות חיידקים בקוקולטורה.

כימות של תחרות בין-בקטריאלית באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות חד-תאית

למדו שיטה חזותית להערכת תחרות חיידקית באמצעות מערכת הפרשה מסוג T6SS ב-Pseudomonas aeruginosa. השיטה מאפשרת הערכה ישירה של הישרדות תאי Escherichia coli ופעילות חיסונית בין חיידקים.

Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

גלה סרטונים נוספים