גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה
29 בספטמבר 2013
פרוטוקול זה מתאר השיטה של mutagenesis insertional מלכודת הגן באמצעות Gal4-VP16 ככתב הראשי וה-GFP / RFP ככתבים משניים בדג זברה. בערך אחד מעשרה צאצאי מלכודת גן תשואת דגי F0-להביע גבוה שיתוף להביע GFP וRFP. הליך המיון וניתן לשנות בקלות כדי להתאים לגודל של המעבדה מבצעת את מסך mutagenesis insertional.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק דגי מוטנטים באמצעות טרנספוזון שובר גנים בווקטורים עם GAL4 ו-VP16 כמדווחים העיקריים למלכודת גנים. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקה משותפת של וקטור מלכודת הגנים יחד עם טרנספוזון Tol2 לעוברי דגי זברה. העוברים המוזרקים נסרקים לפלואורסצנציית GFP שלושה ימים לאחר ההפריה, וכ-30% מהעוברים הבהירים ביותר נבחרים כדי להקים את מאגר ה-F0.
בשלב הבא, מבצעים הזדווגות של דגי ה-F zero עם קו הבדיקה U-A-S-M-R-F-P כדי לסנן מעבר של אירועי gene trap לתאי הנבט. השלב הסופי הוא ביצוע outcross לדור ה-F1 כדי לבסס את דור ה-F two ולהפיק עוברים לאפיון מולקולרי של אירועי gene trap באמצעות inverse PCR ו-five prime race. בסופו של דבר, כדגי F zero אחד מתוך 10 שנסרקו אמור להוליד צאצאים עם gene trap.
טרנספוזונים לשבירת גנים (Gene breaking transposons) תוכננו כך שלא יגרמו למוטציות עם השתלבותם בכניסות של גנים המקודדים לחלבונים. וקטורי ה-GBT שלנו משתמשים ב-G four P 16 כדוח גני-מלכודת (gene trap reporter) עיקרי. שינוי זה מגביר את הרגישות לגנים המבוטאים ברמות נמוכות, ומאפשר לנו להשתמש במוטנטים של מלכודת גנים ללא פנוטיפים מוגברים כדרייברים של G four לצורך ביטוי ספציפי לרקמה של טראנסגנים אחרים.
אנו סבורים כי צוואר הבקבוק העיקרי בשיטה שלנו הוא השגת שיעורי שילוב גבוהים מספיק של מלכודת גנים בקו הנבט של דגי F zero. בהדגמה זו, נסקור מספר שלבים קריטיים: הכנת DNA, MICROINJECTION וסריקת F zero. וקטור מלכודת הגנים GBTB one משתמש ב-GAL four VP 16 כמרכיב הדיווח העיקרי של מלכודת הגנים.
משתמשים בטרנספוזונים מינימליים של tall two בקצוות לצורך אינטגרציה של מלכודת גנים. אירועי מלכודת גנים מזוהים באופן ישיר על ידי רפורטר EGFP תחת בקרה של 14 X GAL four UAS. קסטת מלכודת הגנים השלמה מוקפת באתרים של direct locks P.
דבר זה הופך את אירועי לכידת הגנים להפיכים באמצעות ביטוי של רקומבינזת Cre לצורך ביסוס הוכחה לקשר סיבתי בין אינטגרציה ספציפית של לכידת גנים לבין פנוטיפ נצפה. בנוסף, קסטת ה-U-A-S-E-G-F-P מוקפת באתרי FRT ישירים. הזרקה של mRNA של רקומבינזת Flippase תוביל להסרה של קסטת ה-U-A-S-E-G-F-P, כך שמוטציית לכידת הגנים תישאר ללא סימון של פלואורסצנציית EGFP, מה שיאפשר את השימוש בה בקוים טרנסגניים המסמנים רקמות ספציפיות או אירועים התפתחותיים באמצעות פלואורסצנציית GFP לפני ההזרקה המיקרוסקופית.
הכינו את ה-transpose על ה-DNA ואת ה-transposes mRNA. הכינו את ה-DNA של וקטור ה-gene trap מסוג GBTB. בעת שימוש בערכה סטנדרטית ל-mini prep ובהתאם לפרוטוקול היצרן, חיוני לכלול את שלב השטיפה ב-PB בעת הכנת ה-DNA.
במידה ולא, ה-DNA מה-mini prep יהיה מזוהם ב-RNAs, דבר שיוביל לדגרדציה של ה-mRNA של הטרנספוזים; דללו את ה-DNA במים נקיים מ-RNA לריכוז של 10 nanograms per microliter. כדי להכין את שני ה-mRNA של הטרנספוזים, ראשית ביצעו ליניאריזציה של PT three TS T two באמצעות xbo one. לאחר מכן, בצעו טרנסקריפציה ל-DNA הליניארי באמצעות ערכת M message machine T three in vitro transcription עם שינוי אחד.
הוסף 0.5 µL של מעכב RNA rib lock לאחר שלב הטיפול ב-DNA. טהר את ה-mRNA באמצעות ערכה סטנדרטית והערך את איכות ה-mRNA שהועתק in vitro באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל agarose. דלל את ה-mRNA במים נטולי RNA לריכוז של 40 ng/µL ואחסן כ-aliquots של 2 µL בטמפרטורה של 80°C-. ממש לפני המיקרו-הזרקה, הכן את תערובת ההזרקה על ידי הוספת 8 µL של transpose DNA מדולל ל-aliquot של 2 µL של transpose mRNA.
הזריקו שלושה ננוליטרים של תערובת DNA/RNA לחלמון של עוברי דג זברה בשלב התא הבודד באמצעות טכניקות מיקרו-הזרקה סטנדרטיות, תוך כיוון לממשק שבין החלמון לבלסטומר. לאחר ההזרקה, הריצו חמישה מיקרוליטרים מהיתרה של תמיסת ההזרקה על ג'ל agarose בריכוז 1% לצורך בקרת איכות, כדי לוודא ש-mRNA של הטרנספוז לא התפרק. כשש עד שמונה שעות לאחר ההזרקה, הסירו עוברי דגים לא מופרות ומתים, ופזרו 60 עד 80 עוברים לכל צלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר. עוברי דגים לא תקינים ומתים יוסרו יום אחד לאחר ההפריה, יומיים לאחר ההפריה ושלושה ימים לאחר ההפריה. בשלושה ימים לאחר ההפריה, בצעו את הבדיקה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי המצויד בفلורסצנציה או מיקרוסקופ אנכי.
סננו את העוברים והסירו עוברים לא תקינים. סננו את העוברים הנותרים שאינם מראים פגמים גלויים. עבור פלואורסצנציית GFP, בחרו את עוברי ה-F zero הזוהרים ביותר וגדלו אותם באמצעות נהלי הגידול הסטנדרטיים לדגי zebrafish במעבדה זו.
בדרך כלל מזריקים GBTs לקווים בעלי תבניות פיגמנטציה של סוג בר (wild type) או דפוס נמר. סביר לצפות ש-20 עד 30% מהעוברים המוזרקים שנבחרו לגידול ישרדו עד לבגרות. אינטגרציה של וקטור ה-GBTB one gene trap יכולה להוביל לביטוי של EGFP באמצעות שני מנגנונים שונים.
הראשון הוא אירוע לכידת גנים (gene trap) אמיתי. הווקטור משתלב בתוך גן, נוצר תסריט (transcript) חיבור בין הקצה החמישי (5') של אותו תסריט גנמי אנדוגני לבין GAL4-VP16, והוא מתורגם לחלבון חיבור המכיל את הקצה הטרמינלי של החלבון ומצופה על ידי הגן המוטה שהוחדר ו-GAL4-VP16. חלבון חיבור זה נקשר ל-14XUAS ומפעיל את השעתוק של EGFP.
האירוע השני, הפחות רצוי, הוא מלכודת מחזק (enhancer trap). במקרה זה, הפרומוטור המינימלי שלפני ה-EGFP נופל תחת בקרתו של מחזק הסמוך לאתר האינטגרציה, מה שמוביל לייצור של EGFP בהעדר GAL four, VP 16. כדי להבחין בין שתי מחלקות אלו של אירועים, נוצר קו טרנסגני 14 X-U-A-S-M-R-F-P המסומן על ידי gamma crystalline GFP ספציפי לעדשה.
אירועי לכידת גנים (Gene trap) מאומתים על ידי הכלאה של דגים שהוזרקו ב-GBT עם דגי U-A-S-M-R-F-P הומוזיגוטים וסריקה לאיתור ביטוי משותף של GFP ו-RFP, דבר האפשרי רק אם GAL four, VP 16 נוצר ומפעיל את U-A-S-M-R-F-P ב-trans. כדי להתחיל את הליך הסריקה של דגי F zero, יש להכליא כל דג F zero בנפרד עם דגי U-A-S-M-R-F-P הומוזיגוטים. מכיוון שהדגים שהוזרקו ב-GBT בעלי דפוסי פיגמנטציה מסוג wild type או leopard, וקו ה-U-A-S-M-R-F-P ההומוזיגוטי הוא על רקע brass, ניתן להבחין בקלות בין דגי F zero לבין דגי U-A-S-M-R-F-P. דבר זה מבטל את הצורך לתעד אם דג ה-F zero הנסרק היה זכר או נקבה, וכן מונע שגיאות פוטנציאליות הנובעות מטעויות בתיעוד או בקביעת מינו של כל דג. למחרת.
החזירו את דגי ה-U-A-S-M-R-F-P הנחוש לאקווריום שלהם. העבירו את דגי ה-F zero שנתנו עוברים למכלי דגים סטטיים בודדים בזמן איסוף העוברים לסריקה, והעבירו את העוברים שנאספו לצלחות פטרי חדשות בשעות אחר הצהריים של היום אפס. סרקו את העוברים לזֶהרת GFP ו-RFP יום אחד לאחר ההפריה ושלושה ימים לאחר ההפריה.
שלפו עוברים החיוביים הן ל-GFP והן ל-RFP ומיינו אותם לפי דפוס הביטוי של G-F-P-R-F-P. אם נצפה יותר מדפוס אחד בתוך שגרת ביצים (clutch), גדלו אותם כדי להקים את דור ה-F1. שימו לב שעוברי 3D PF החיוביים ל-GFP אך לא ל-RFP אינם נשלפים, שכן הם מייצגים אירועי enhancer trap.
בצעו הכלאה חוזרת של דגי ה-F zero שהפיקו צאצאים חיוביים ל-G-F-P-R-F-P כדי לקבל קבוצה שנייה של דגים חיוביים. דגי ה-F1 נסרקים להקמת משפחות F two לצורך תיעוד דפוס הביטוי של מלכודת הגנים (gene trap) ולהקפאת קבוצות של עוברים לצורך זיהוי מולקולרי של אתרי מלכודת הגנים. ראשית, השליחו הכלאה של דגי F1 בודדים עם דגי U-A-S-M-R-F-P הומוזיגוטים ביום למחרת. העבירו את דגי ה-F1 שהפיקו עוברים למכלי השהיה (static tanks) בודדים, בעוד העוברים נאספים לסריקה יום אחד לאחר ההפריה.
ייתכן שסימון ה-RFP עדיין לא הופיע, לכן יש לסנן את העוברים לאור פלואורסצנציית GFP ולהוציא את העוברים החיוביים ל-GFP בשלושה ימים לאחר ההפריה; לאחר מכן יש לסנן הן לפלואורסצנציית GFP והן לפלואורסצנציית RFP ולהוציא את those החיוביים לשניהם. לאחר מכן, צלם את העוברים החיוביים הן ל-GFP והן ל-RFP בחמישה ימים לאחר ההפריה, והקפא קבוצות של 20 עוברים חיוביים ל-GFP-RFP ו-20 עוברים שליליים ל-GFP-RFP לצורך זיהוי גנים מוטסים באינסרט באמצעות inverse PCR ו-5 prime RACE. את שאר העוברים החיוביים ל-GFP-RFP יש לגדל כדי להקים את דור ה-F2 במקרה של הזרקה מוצלחת.
לפחות 80% מהעוברים שהוזרקה להם תערובת ה-DNA של מלכודת הגנים ו-mRNA של transposase יפגינו דרגה מסוימת של פלואורסצנציית GFP. ביטוי GFP נמוך מעיד על הזרקה לא מוצלחת או על פירוק של ה-transposase RNA עקב זיהום ב-RNA. כאשר נבחרים העוברים בעלי ה-GFP החזק ביותר להקמת מאגר ה-F zero, בערך דג F zero אחד מתוך 10 שנסרקו יניב צאצאים עם מלכודת גנים מבין דגי ה-F zero מהם שוחזרו אירועי מלכודת הגנים.
רובם מעבירים אירוע לכידת גן בודד בנוסף למספר אינטגרציות של טרנספוזונים שאינם מבטאים. מכיוון שכל קסטת לכידת הגן מוקפת על ידי אתרי loxP ישירים, כל מוטציות לכידת גנים המוצגות בדיאגרמה זו, שבה תיבות כחולות מייצגות אקסונים של הגן המוטה, הן הפיכות באמצעות ביטוי של Cre recombinase. תמונות אלו מראות ביטוי משותף של GFP ו-RFP במערכת העצבים של קו לכידת הגנים NSF TP six; הזרקה של RNA של Cre לעוברי NSF TP six מובילה לאובדן הביטוי של GFP ו-RFP.
שימו לב כי אין הפחתה בביטוי של GFP בעדשה, כפי שצפוי. רוב הפרוצדורות המתוארות כאן ישימות גם לסריקות gene trap אחרות וגם לניסויי טרנסגנזה רגילים עם TOL two וטרנספוזונים אחרים באמצעות פרוצדורת ה-gene trap המתוארת כאן. ביצוע של 20 עד 30 הצלבות חוץ (out crosses) של דור F zero בשבוע אמור להוביל להשגה של gene trap אחד בשבוע.
עם זאת, ניתן להגדיל את קנה המידה של הפרוצדורה בקלות.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה למוטגנזה של השתלה באמצעות מלכודת גנים (gene trap) בדגי zebrafish, תוך שימוש ב-Gal4-VP16 כדווח ראשי וב-GFP/RFP כדווחים משניים. ההליך מאפשר זיהוי של צאצאים בעלי מלכודת גנים המבטאים GFP ו-RFP בו-זמנית, עם תהליך סינון שניתן להתאימו לגודל המעבדה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
- מודלים טרנסגניים
רקע
- מוטגנזה השתלתית באמצעות מלכודת גנים (Gene trap) היא טכניקה המשמשת ליצירת מוטציות בגנים ספציפיים.
- Gal4-VP16 משמש כחלבון רפורטר רגיש לביטוי גנים.
- GFP ו-RFP משמשים להדמיה של אירועי מלכודת גנים.
- השיטה שואפת למזער מוטציות לא רצויות במהלך האינטגרציה.
מטרת המחקר
- ליצירת דגי zebrafish מוטנטים לצורך אנליזה פונקציונלית של גנים.
- להגברת הרגישות של זיהוי ביטוי גנים.
- לביסוס שיטת סריקה מהימנה לאירועי gene trap.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקה משותפת של וקטורי gene trap ו-mRNA של transposase לעוברים של דגי זברה.
- סריקה לזיהוי פלואורסצנציית GFP שלושה ימים לאחר ההפריה.
- הכלאה של דגי F0 עם קווי בדיקה של U-A-S-M-R-F-P לאימות העברה דרך תאי הנבט (germline transmission).
- הכלאה חיצונית (Outcrossing) של דגי F1 להקמת דור F2 לצורך אפיון מולקולרי.
תוצאים עיקריים
- כ-30% מהעוברים הזוהרים ביותר נבחרו להמשך ניתוח.
- בערך דג אחד מתוך עשרה מדור F0 הוליד צאצאים עם מלכודת גנים (gene trap).
- אירועי מלכודת גנים אושרו באמצעות ביטוי משותף של GFP ו-RFP.
- זוהו מנגנוני אינטגרציה, כולל אירועי מלכודת גנים אמיתית ומלכודת מחזק (enhancer trap).
מסקנות
- השיטה מייצרת ביעילות מוטנטים של דגי זברה למחקרי תפקוד גנים.
- שיעורים גבוהים של אינטגרציית מלכודת גנים (gene trap) חיוניים להשגת תוצאות מוצלחות.
- גישה זו מאפשרת סימון הפיך של אירועי מלכודת גנים לצורך מחקר נוסף.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מוטגנזה השבבנית באמצעות מלכודת גנים (Gene trap) בדגי zebrafish מאפשרת אנוטציה תפקודית של גנים במערכת של חרשון בקיבולת גבוהה, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. השימוש ב-Gal4-VP16 כדווח ראשוני מגביר את הרגישות עבור תמלילים בריכוז נמוך, ומאפשר לקווי מלכודת שהומרו לשמש כמניעים ספציפיים לרקמה עבור ביטוי טרנסגנים, מה שמקל על חקירת מסלולים וסינון פנוטיפי. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי על ידי קישור הגנוטיפ לפנוטיפים ספציפיים לרקמה ללא הסתמכות על פגמים התפתחותיים גלויים, דבר בעל ערך רב במיוחד עבור גנים בעלי תפקודי עודפות או תפקודים שאינם חיוניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מוטגנזה השבחה (insertional mutagenesis) המתייגת ביטוי של גנים אנדוגניים באמצעות Gal4-VP16 לצורך זיהוי רגיש.
- ערך תפעולי: יוצר מוטציות מסוג מלכודת גנים (gene trap) הפיכות באמצעות קסטות המוקפות באתרים של loxP, מה שמאפשר תיקוף סיבתי של קשרי פנוטיפ-גנוטיפ באמצעות כריתה המתווכת על ידי Cre.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי המרת לוקוסים נלכדים לדריברים של Gal4 להכוונת ביטוי של טרנס-גנים אפקטוריים ברקמות ספציפיות, ובכך מבהיר את תפקוד הגן בהקשרים רלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות של דו-דיווח (ביטוי משותף של GFP/RFP) כדי להבדיל בין אירועי מלכודת גנים (gene trap) אמיתיים לבין אירועי מלכודת מחזק (enhancer trap), ובכך משפר את ספציפיות הבדיקה.
- ערך תפעולי: מבסס תשתית ניתנת להרחבה להעברה דרך קו הנבט, שבה כ-10% מהמייסדים מדור F0 שנסרקו מניבים אללים של מלכודת גנים הניתנים להעברה, מה שתומך ביצירה עקבית של קווי מוטנטים.
- ערך מדעי: מאפשר הכנה של מערכות ביולוגיות מאומתות לסריקה המשכית על ידי הקפאת קבוצות של עוברי כפולים-חיוביים לצורך זיהוי מולקולרי של אתרי המלכודת באמצעות inverse PCR ו-5' RACE.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר זיהוי של מוטציות מלכוד (trap mutations) בגנים המקודדים לחלבונים גרעיניים, ציטופלזמיים וממברנתיים, ובכך מבטיח כיסוי רחב של מטרות ללא הטיה לכיבוי גרעיני.
- ערך תפעולי: מקדם רצף תרגומי על ידי אפשור הכלאות F2 לתיעוד דפוסי ביטוי והקפאת עוברים לצורך גנוטיפיקה, ובכך תומך בתהליכי תיקוף פרה-קליניים.
- ערך מדעי: מקדם הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי אפשור סימון הפיך של מוטציות, ובכך מבחין בין השתלת מלכוד גנים סיבתית לבין אפקטים מיקומיים בסריקות פנוטיפיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל ממוטגנזה מוקדמת ועד לזיהוי מולקולות מובילות (lead identification), כאשר קווי gene trap משמשים הן כאללים מוטנטיים והן כמניעי Gal4 לביטוי טרנסגנים ספציפיים למסלול, ובכך הם תומכים בתיקוף חוזר של מטרות ובדיוק של מערכי הבדיקה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובהבהרת מסלולים על ידי תיוג לוקוסים אנדוגניים עם Gal4-VP16 למעקב אחר דינמיקת ביטוי in vivo במהלך הפרעה כימית או גנטית.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה באמצעות דירוג co-expression של GFP/RFP, מה שמאפשר השוואה סטנדרטית בין תנאי מוטנט לסוג בר (wild-type) לאורך קמפיינים של סריקה.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות מולקולריות (inverse PCR, 5' RACE) המאפשרות זיהוי מדויק של גנים שנלכדו, ובכך תומכת בתעדוף מטרות מבוסס נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הגילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי שימור עובריים לצורך גנוטיפיינג וניתוח ביטוי, מה שמבטיח שתצפיות פנוטיפיות מקושרות לנגעים גנטיים מאומתים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הפיכה וניתנת להרחבה שבה ניתן לבצע הצלבה חוזרת של דגי מייסד (founder fish) ליצירת משפחות F2, ובכך תומכת במחקרים ארוכי טווח ובשיתוף ריאגנטים בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי על ידי שיפור הגילוי של גנים בעלי ביטוי נמוך ומאפשר ביטוי של טרנסגנים ספציפיים לרקמה ללא צורך בחדירה פנוטיפית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של יצירת מוטנטים באמצעות יחסי הזרקה מוגדרים, מיון מבוסס פלואורסצנציה ובדיקת העברה לשורש הגזע (germline transmission), ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכון ביולוגי בזיהוי מועמדים מובילים (lead identification) על ידי אספקת מודלים הפיכים וספציפיים לאלל לצורך תיקוף מטרה, ובכך ממזער תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מארטפקטים של השחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון באמצעות יצירת סדרות אלליות ודה-קונבולוציה פנוטיפית, ובכך תומך בהחלטות go/no-go המבוססות על ראיות מכניסטיות ולא על חומרת הפנוטיפ בלבד.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהזרקה מיקרוסקופית לדגי zebrafish, סריקה פלואורסצנטית ותחזוקה של קווים טרנסגניים.
- תלוי ב-mRNA פונקציונלי של transposase ובהכנת DNA ברמת טהרה גבוהה, כולל שלבי שטיפה ב-PB למניעת זיהום ב-RNA.
- מחייב תכניות הכלאה סטנדרטיות עם קווי דגם (reporter) מסוג UAS-mRFP כדי להבחין בין אירועי gene trap לאירועי enhancer trap באמצעות דירוג ביטוי משותף (co-expression scoring).
- כולל שיקולי התאמה עבור גנים המקודדים לחלבונים מופרשים או חלבונים ממברנליים, שכן איחויים ב-N-terminal עלולים לפגוע בלוקליזציה גרעינית של Gal4-VP16 ובפעילות התעתוקית.
- כפוף למגבלות מעשיות ביעילות ההעברה לקו הנבט (germline transmission), כאשר אופטימיזציה של סריקת F0 ותדירות ההכלאה החוצה (outcrossing) משפיעה על שיעורי התאוששות המוטנטים.
