גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר דגים מוטנטיים באמצעות טרנספוזיציה שוברת גנים על וקטורים עם GAL 4, VP 16 כמדווח מלכודת הגנים העיקרי. זה מושג על ידי הזרקה משותפת ראשונה של וקטור מלכודת הגנים יחד עם שני טרנספוזיציות גבוהות לעוברים של דג זברה. עוברים מוזרקים נבדקים לפלואורסצנטיות GFP שלושה ימים לאחר ההפריה וכ-30% מהעוברים הבהירים ביותר נבחרים כדי ליצור את מאגר F zero.

לאחר מכן, דגי ה-F zero חוצים לקו הבודק U-A-S-M-R-F-P כדי לסנן העברת קו נבט של אירועי מלכודת גנים. השלב האחרון הוא לחצות את ה-F1 כדי לבסס את דור ה-F השני וליצור עוברים לאפיון מולקולרי של אירועי מלכודת גנים על ידי PCR הפוך וחמישה גזעים ראשוניים. בסופו של דבר, בערך אחד מכל 10 דגי F אפס שנבדקו אמור לייצר צאצאים של מלכודת גנים.

טרנספוזיונים שוברי גנים תוכננו לא לייצר מוטציות עם אינטגרציה בכניסות של גנים מקודדי חלבון. וקטורי ה-GBT שלנו משתמשים ב-G four P 16 כמדווח מלכודת הגנים העיקרי. שינוי זה מגביר את הרגישות לגנים המתבטאים ברמות נמוכות ומאפשר לנו להשתמש במוטציות מלכודות גנים מבלי להימנע יתר על המידה מפנוטיפים כמניעי G 4 לביטוי ספציפי לרקמה של טרנסגנים אחרים.

אנו מאמינים שצוואר הבקבוק העיקרי של השיטה שלנו הוא בהשגת שיעורים גבוהים מספיק של אינטגרציה גנטית בקו הנבט של דגי F אפס. בהדגמה זו, נסקור מספר שלבים קריטיים, הכנת DNA, מיקרו-הזרקה ובדיקת F zero. וקטור מלכודת הגנים GBTB one משתמש ב-GAL 4 VP 16 כמדווח מלכודת הגנים העיקרי.

שני טרנספוזיציות גבוהות מינימליות בקצוות משמשות לשילוב מלכודות גנים. אירועי מלכודת גנים מזוהים ישירות על ידי מדווח EGFP בשליטת 14 X GAL ארבעה כטב"מים. כל קלטת מלכודת הגנים מוקפת באתרי P של מנעולים ישירים.

זה הופך את אירועי מלכודת הגנים להפיכים על ידי ביטוי של מסרקי קרי לביסוס הוכחה לקשר סיבתי בין שילוב מלכודת גנים ספציפי לפנוטיפ נצפה. בנוסף, קלטת ה-U-A-S-E-G-F-P מוקפת באתרי FRT ישירים. הזרקת mRNA של מסרקי היפוך תוביל לכריתת קלטת U-A-S-E-G-F-P, ותשאיר את מוטציית מלכודת הגנים ללא סימן על ידי פלואורסצנטיות EGFP ותאפשר את השימוש בה בקווים טרנסגניים המסמנים רקמות ספציפיות או אירועים התפתחותיים על ידי פלואורסצנטיות GFP לפני הזרקת מיקרו

הכן את הטרנספוזיציה על DNA ומחליף mRNA. הכן את ה- DNA וקטור מלכודת גנים אחד GBTB. באמצעות ערכת הכנה מיני סטנדרטית ובהתאם לפרוטוקול היצרן, חיוני לכלול את שלב שטיפת ה-PB בעת הכנת ה-DNA.

אחרת, ה-DNA המיני של ההכנה יזדהם על ידי RNAs, A מה שיוביל לפירוק הטרנספוזיציות Mr.NA, לדלל את ה-DNA במים חופשיים של RNA ל-10 ננוגרם למיקרוליטר. כדי להכין את השניים הגבוהים, mRNA מחליף תחילה PT ליניארי שלוש TS T שניים באמצעות xbo one. לאחר מכן, תמלל את ה-DNA הליניארי באמצעות מכונת הודעות M T שלוש ערכת שעתוק במבחנה עם שינוי אחד.

הוסף 0.5 מיקרוליטר של מעכב RNA נעילת צלעות לאחר שלב הטיפול של ה-DNA לטהר את ה-mRNA באמצעות ערכה סטנדרטית ולהעריך את איכות ה-mRNA המתועתק במבחנה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוס. יש לדלל את ה-mRNA במים חופשיים של RNA ל-40 ננוגרם למיקרוליטר ולאחסן כשני מיקרו-ליטר בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס ממש לפני הזרקת המיקרו. הכן את תערובת ההזרקה על ידי הוספת שמונה מיקרוליטרים של טרנספוזיציה מדוללת על ה-DNA ל-2 מיקרוליטר של mRNA טרנספוזיציה.

להזריק שלושה ננוליטרים של תערובת D-N-A-R-N-A לחלמון של עוברי דגי זברה חד-תאיים באמצעות טכניקות מיקרו-הזרקה סטנדרטיות המכוונות לממשק חילול הקודש של החלמון לאחר ההזרקה הפעל חמישה מיקרוליטרים של שאריות תמיסת הזרקה על ג'ל 1% aros לבקרת איכות כדי להבטיח שה-mRNA הטרנספוזיטיבי לא הושפל כשש עד שמונה שעות לאחר ההזרקה. הסר עוברים לא מופרים ומתים וחלק את העוברים ל-60 עד 80 לכל צלחת פטרי של 100 מילימטר. עוברים חריגים ומתים מוסרים יום אחד לאחר ההפריה, יומיים לאחר ההפריה ושלושה ימים לאחר ההפריה בשלושה ימים לאחר ההפריה תחת מיקרוסקופ סטריאו המצויד בפלואורסצנציה או מיקרוסקופ זקוף.

סנן את העוברים והסר עוברים חריגים. סנן את העוברים הנותרים ללא פגמים גלויים. עבור פלואורסצנטיות GFP, בחר את העוברים הבהירים ביותר F zero וגדל אותם באמצעות הליכי גידול סטנדרטיים של דג זברה במעבדה זו.

GBTs מוזרקים בדרך כלל לקווים עם דפוסי פיגמנטציה מסוג בר או נמר. סביר לצפות ש-20 עד 30% מהעוברים המוזרקים שנבחרו לגידול ישרדו עד לבגרותם. שילוב של וקטור מלכודת גנים אחד GBTB יכול להוביל לביטוי EGFP על ידי שני מנגנונים שונים.

הראשון הוא אירוע מלכודת גנים אמיתי. הווקטור משתלב בגן תעתיק היתוך בין חמשת הראשוניים של אותו תעתיק גן אנדוגני לבין ה-GAL 4 VP 16 נוצר ומתורגם לחלבון היתוך המכיל את הקצה הסופי של החלבון ומצופה על ידי הגן המוטנטי ו-GAL 4, VP 16. חלבון היתוך זה נקשר ל-14 XUAS ומפעיל שעתוק של EGFP.

האירוע השני הפחות רצוי הוא מלכודת משפר. המקדם המינימלי מול EGFP נמצא תחת שליטת משפר ליד אתר האינטגרציה המוביל לייצור EGFP בהיעדר GAL 4, VP 16. כדי להבחין בין שני סוגי האירועים הללו, נוצר קו טרנסגני של 14 X-U-A-S-M-R-F-P המסומן על ידי GFP גביש גמא ספציפי לעדשה.

אירועי מלכודת גנים מאומתים על ידי הכלאה של דגים שהוזרקו GBT עם דגי U-A-S-M-R-F-P הומוזיגוטיים וסינון לביטוי משותף של GFP ו-RFP, מה שאפשרי רק אם GAL 4, VP 16 נוצר ומפעיל את U-A-S-M-R-F-P בטרנס כדי להתחיל בהליך לבדיקת דגי F אפס חוצים את הפרט F אפס עם דגי U-A-S-M-R-F-P הומוזיגוטיים. מכיוון שלדגים שהוזרקו GBT יש דפוסי פיגמנטציה מסוג בר או נמר וקו ה-U-A-S-M-R-F-P ההומוזיגוטי הוא על רקע פליז, ניתן להבחין בקלות בין דגי F zero לבין דגי U-A-S-M-R-F-P מה שמבטל את הצורך לרשום אם ה-F zero שנבדק היה זכר או נקבה, כמו גם טעויות פוטנציאליות הנובעות מטעויות ברישום ו/או בקביעת המין של כל דג. למחרת.

החזירו את דגי הפליז U-A-S-M-R-F-P למיכל שלהם. הניחו את דג ה-F zero שנתן עוברים למכלים סטטיים בודדים בזמן שהעוברים נאספים לסינון, ניקוי, והעבירו את העוברים שנאספו לצלחות פטרי חדשות בשעות אחר הצהריים של יום האפס. עוברי סקר עבור GFP ו-RFP פלואורסצנטי יום אחד לאחר ההפריה ושלושה ימים לאחר ההפריה.

שלוף עוברים חיוביים הן עבור GFP והן עבור RFP מיין אותם לפי דפוס ביטוי G-F-P-R-F-P. אם נצפה יותר מדפוס אחד במצמד והרם אותם כדי לבסס את דור ה-F1. שימו לב שעוברי PF תלת מימדיים שהם חיוביים ל-GFP אך לא ל-RFP אינם נשלפים מכיוון שהם מייצגים אירועי מלכודת משפרים.

חצו שוב את דג ה-F אפס שהניב צאצאים חיוביים G-F-P-R-F-P כדי לקבל מנה שנייה של חיוביים. דגי F1 עוברים סינון כדי להקים שתי משפחות F כדי לתעד את דפוס ביטוי הגנים ולהקפיא קבוצות של עוברים לזיהוי מולקולרי של מיקומי מלכודת גנים תחילה חצו דגי F1 בודדים עם דגי U-A-S-M-R-F-P ההומוזיגוטיים למחרת. הנח את דג F1 שנתן עוברים למיכלים סטטיים בודדים בזמן שהעוברים נאספים להקרנה יום אחד לאחר ההפריה.

ייתכן שתווית ה-RFP עדיין לא עלתה, לכן סנן את העוברים עבור פלואורסצנטי GFP ושלף את העוברים החיוביים ל-GFP שלושה ימים לאחר ההפריה עבור פלואורסצנטי GFP ו-RFP ושלף את החיוביים הכפולים. לאחר מכן צלם את העוברים החיוביים הן ל-GFP והן ל-RFP בחמישה ימים לאחר ההפריה להקפיא קבוצות של 20 עוברים חיוביים G-F-P-R-F-P ו-20 עוברים שליליים G-F-P-R-F-P לזיהוי גנים מוטנטיים על ידי PCR הפוך וחמישה גזעים ראשוניים. לגדל את העוברים החיוביים הנותרים G-F-P-R-F-P כדי לבסס את דור ה-F 2 בהזרקה מוצלחת.

לפחות 80% מהעוברים שהוזרקו עם מלכודת הגנים DNA גבוה שני טרנספוזיציות תערובת mRNA יציגו מידה מסוימת של פלואורסצנטיות GFP. ביטוי GFP נמוך מעיד על הזרקה לא מוצלחת או פירוק של RNA טרנספוזיציות עקב זיהום RNA. כאשר העוברים החיוביים ל-GFP הבהירים ביותר נבחרים להקמת מאגר F אפס, בערך אחד מכל 10 דגי F אפס שנבדקו יניב צאצאים של מלכודת גנים בקרב דגי F zero שמהם מתאוששים אירועי מלכודת הגנים.

רובם מעבירים אירוע מלכודת גנים בודד בנוסף למספר טרנספוזיציות שאינן מבטאות באינטגרציות. מכיוון שכל קלטת מלכודת הגנים מוקפת באתרי P של מנעולים ישירים, כל מוטציה במלכודת גנים המוצגת בתרשים זה עם קופסאות כחולות המייצגות אקסונים של הגן המוטנטי ניתנת להפיכה על ידי ביטוי של מסרקי CRE. תמונות אלה מראות את הביטוי המשותף של GFP ו-RFP במערכת העצבים של הזרקת קו מלכודת הגנים NSF TP של Cree RNA לתוך שישה עוברים של N SF TP מובילה לאובדן ביטוי GFP ו-RFP.

שימו לב שאין הפחתה של ביטוי GFP בעדשה כצפוי. רוב ההליכים המתוארים כאן ישימים למסכי מלכודת גנים אחרים כמו גם לניסויי טרנסגנזה רגילים עם TOL 2 וטרנספוזונים אחרים עם הליך מלכודת הגנים המתואר כאן. הגדרת 20 עד 30 צלבים של אפס מעלות צלזיוס בשבוע אמורה לגרום לשחזור של מלכודת גנים אחת בשבוע.

עם זאת, ניתן להגדיל את ההליך בקלות.