מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

ניסוי זה עוקב אחר קרע VA שנגרם על ידי פתוגנים תוך-תאיים בתאים בודדים. ראשית טען את התאים בצבע CCF 4:00 AM, שנבקע על ידי אסטרזות תאיות. לאחר מכן הכינו ויישמו את חיידקי העצב FL על ה-CCF ארבעה תאים טעונים דוגרים על התאים ב-37 מעלות צלזיוס לפלישת חיידקים לתאי המארח.

לאחר מכן קבע את יחס העוצמות הנפלטות בערוצים של 450 ננומטר ו-535 ננומטר. התוצאות מראות נוכחות של פתוגנים בציטוזול בגלל יכולת ההסתגלות שלו לתפוקה גבוהה. טכניקה זו מקלה על זיהוי אנטיביוטיקה חדשה על ידי טיפול בבעיה מרכזית של לוקליזציה תת-תאית של חיידקים במהלך אינטראקציות פתוגנים מארחים.

יחד עם עמיתי טראן ונו, היינו מעוניינים לפתח גישות להתבוננות בפתוגנים תוך-תאיים עם רזולוציה גבוהה של זמן. זה הוביל להקמת בדיקת קרע קולרי רגיל של CCF ארבע בטא-לקטמאז. כיום, גישה זו תוצג באופן ניסיוני על ידי שתי סטודנטיות לתארים מתקדמים במעבדה, נורה מלו ושרלוט קלר חיסון זני החיידקים מסוג הבר והמוטנטי בשמונה מיליליטר של TCSB המכילים 50 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין ממקמים את התרביות בשייקר של 37 מעלות צלזיוס שזרעו כעת חמש פעמים 10 עד תאי ההלה השלישיים לבאר.

ב-100 מיקרוליטר של DMEM המכילים תרבית סטרפטומיצין 10% סרום עגל עוברי 1% פניצילין, התאים באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני למחרת תת-תרבית החיידקים בדילול 100 ב-TCSB בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין גדלים בשייקר ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים וחצי. עכשיו להעמסת תאי ההלה מכינים CCF 4:00 AM צבע במאגר em שוטפים את התאים פעם אחת עם PBS. לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטר של CCF 4:00 AM תערובת טעינה לבאר בטמפרטורת החדר בחושך למשך שעתיים ו-30 דקות כדי להכין את החיידקים לזיהום גלולה אחת של מיליליטר תרבית על ידי צנטריפוגה לאחר שטיפה אחת עם 500 מיקרוליטר PBS Resus, השעו את החיידקים ב-500 מיקרוליטר PBS בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר פוליאול ליזין ו-40 מיקרוגרם למיליליטר בטא-לקטמז.

דגירה למשך 10 על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר, ואז שטפו פעם אחת עם 500 מיקרוליטר PBS והשעו מחדש כל כדור חיידקי ב-500 מיקרוליטר של מילי-מולרית אחת Probenecid במאגר EM שטפו את התאים פעם אחת עם 150 מיקרוליטר של מילי-מולרית אחת במאגר EM. לאחר מכן, יש לדלל 10 מיקרוליטר של חיידקים ב-100 מיקרוליטר של תמיסה נבדקת מילי-מולרית אחת ולהפיץ אותה לכל באר של תאי הלה. לאחר 15 דקות דגירה בחושך בטמפרטורת החדר, העבירו את הצלחת ל -37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

יש לשטוף פעם אחת עם 150 מיקרוליטר של תמיסת פרוביט מילי-מולרית אחת. לאחר מכן תקן דגימות עם 50 מיקרוליטר של 4% אלדהיד פרפורמי בתמיסת Pro מילי-מולרית אחת למשך 10 דקות בחושך לאחר שטיפה אחת עם תמיסת Probenecid, הוסף 30 מיקרוליטר של 10 צבע גרעיני מיקרו-מולרי דראק חמש לפילוח תאים אופטימלי. דגרו על התאים למשך 30 דקות, שטפו פעם אחת והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסה מילי-מולרית אחת כדי לקבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי הפוך.

השתמש באורך גל עירור ב-405 ננומטר. זיהוי פליטה באמצעות מסננים של 450 ננומטר ו-535 ננומטר באמצעות זמני חשיפה של חמש אלפיות השנייה לאור מועבר. 1000 מילישניות ל-535 ננומטר ו-500 מילישניות ל-450 ננומטר.

השימוש במכשיר כיול מיקוד בשילוב עם מיקרוסקופיה אוטומטית מאפשר רכישה בו זמנית של עשרות מיקומים שונים במספר בארות. אם אתה משתמש במיקרוסקופ קונפוקלי, השתמש בזמני חשיפה של 240 מילישניות ב-450 ננומטר, 360 מילישניות ב-535 ננומטר עבור לייזר 405 ננומטר ו-640 מילישניות עבור לייזר 640 ננומטר. נתח נתונים על ידי אלגוריתם ממוחשב המאפשר ניקוד אוטומטי של האות הפלואורסצנטי עבור כל תא בודד.

לדוגמה, השתמש בתוכנות כגון Metamorph ו-acapella כדי ליצור סקריפט למדידת היחס בין אותות הפליטה של 450 ננומטר ל-535 ננומטר. לצורך בדיקה זו, התחל תרבית HELOC עם פעמיים כפול 10 עד חמישית תאים בנפח סופי של שני מיליליטר. הכן את החיידקים לזיהום והעמיס את תאי ההלה עם CCF 4:00 בבוקר סדר מיקרוסקופ קונבו עם מטרת אוויר בתוכנית N בתוך תא חימום של 37 מעלות צלזיוס.

הגדר את הלייזר והפליטה של 405 ננומטר באמצעות מסננים של 450 ננומטר ו-535 ננומטר. הזן גם זמני חשיפה של חמש אלפיות השנייה לאור מועבר. 200 מילישניות ל-535 ננומטר ו-100 אלפיות שנייה ל-450 ננומטר.

הגדר רכישת נתונים עבור כל 90 שניות במשך 60 דקות. כעת שטפו את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר של תמיסת Probenecid מילי-מולרית אחת. הוסף שני מיליליטר של מילי-מולרית אחת במאגר em.

לאחר מכן הרכיב את המנה על במת המיקרוסקופ והתחל ברכישה לאחר שש דקות. הקפאת הרכישה. הוסף 250 מיקרוליטר של חיידקים על גבי התאים והפעל מחדש את הרכישה לניתוח שלאחר הרכישה.

דמיין סרטים באמצעות מטמורף מהירות או תמונה J.השג יחסי עוצמה של 450 עד 535 ננומטר עבור כל תא בודד. גישת CCF 4:00 AM בטא-לקטמז היא שיטה חזקה ורגישה למעקב אחר קרע אולרי של פתוגנים תוך-תאיים כגון ג'ל פלקסנרי לאחר זיהום בתאי HELOC. עם הזן הלא פולשני BS 176 AFA אחד למשך שעה, בדיקת ה-CCF ארבע שריגים נשארת שלמה ופולטת אות ירוק.

לעומת זאת, הזן האלים M 90 TFA I מעביר את האות לכיוון כחול התואם את מחשוף הבדיקה בציטוזול לקביעת האות המטרי של היחס. פיתחנו סקריפט לתוכנת המטמורף והאקפלה כדי להפוך את זיהוי התאים לאוטומטי ומדידות בערוצים של 535 ו-450 ננומטר. גרעינים וציטוזול של תאים מפולחים באמצעות ערוץ DR five.

אז האלגוריתם מסוגל לזהות ולכמת את אוכלוסיות התאים החיוביות של 450 ננומטר ו-535 ננומטר. היחסים הממוצעים המחושבים נמוכים עבור הזן המוטנטי וגבוהים עבור הזן האלים. ניתן לבצע ניסויים על סוגים שונים של תאים אנושיים כמו תאי אפיתל גילה ו-THP תאים דמויי מקרופאג אחד.

שני סוגי התאים מגיבים לזן האלים M 90 T AFA one cha על ידי החלפת האות הנפלט מירוק לכחול תחת זיהום. עם הזן הלא פולשני, האות הירוק ממשיך לכמת באמצעות סקריפט שפותח בתוכנת מטמורף ומאקרו שפותח באקסל מציג היסטוגרמות של קרע אולרי כפונקציה של התפלגות התאים. ניתן להתאים את השיטה בהצלחה להבנת הדבקה של חיידקים שונים.

לדוגמה, מערך נתונים זה מציג מיקובקטריום בוביס. BCG שוכן בפאגוזום במשך כל מהלך הניסוי כפי שמוצג על ידי האות הירוק המתמשך. לעומת זאת, מיקובקטריום טוברקולוזיס מעורר קרע בקרום הנרתיק במקרופאגים THP 1 לאחר שבעה ימים של הדבקה, כפי שמודגש על ידי הופעת אות של 450 ננומטר לאחר שבעה ימי הדבקה באמצעות אותו אלגוריתם.

באשר לחקר קרע הוולאר על ידי אלה, מצאנו שתאים נגועים ב-Mycobacterium tuberculosis מציגים יחס גבוה יותר של 450 עד 535 ננומטר מאשר Mycobacterium bovis BCG לאחר שבעה ימים של הדבקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור קרע על ידי פתוגנים עם בדיקת CCL ארבע בטא-לקטמז לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה תוך ארבע שעות, אך זכור, עליך להוסיף פרוסה בכל מאגר לאורך כל הפרוטוקול. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים או פיצול ממברנה, הוא שניתן לבצע אותה בזמן אמת ללא טיפולים ביוכימיים.

ניתן לבצע ניתוח נוסף כמו תיוג אקטין או בדיקת הגנה על גנטמיצין על מנת להעריך את הספיגה וההתפשטות של החיידקים בתאי המארח.