אוסף, בידוד והעשרה של חיידקים המתרחשים באופן טבעי מMagnetotactic הסביבה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד חיידקי טקטיקת מגנטו מסביבת מים מתוקים. זה מושג על ידי איסוף דגימות משקעי מים מקצה נהר או אגם. השלב השני הוא לבודד חיידקי טקטיקת מגנטו הכלולים בדגימה הסביבתית באמצעות מגנט מוט.

לאחר מכן, חיידקי טקטיקת המגנטו מועשרים באמצעות מסלול מרוצים נימי זכוכית ומגנט. לבסוף, חיידקי טקטיקת המגנטו מאופיינים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית. בסופו של דבר, מיקרוסקופ אלקטרונים שידור משמש להצגת הגודל והצורה של החיידקים והמגנטיט שלהם המכילים אזורי מגנטו.

שיטה זו עוזרת לנו להבין שאלות מפתח, מיקרוביולוגיה סביבתית, כגון כיצד מגנטו התפתח על פני כדור הארץ, וכיצד חיידקי טקטיקת מגנטו סינתזו מגנטים בגודל ננומטר. מי שידגים את ההליך היום יהיה זכארי סטרייקר. זכארי הוא מועמד לדוקטורט במעבדה שלי.

הוא עובד עם אחי ואני כאן באוניברסיטת אוהיו. כאשר מחליטים על אתר מים מתוקים לאיסוף חיידקי טקטיקת מגנטו או MTB, לרוב עדיף להתחיל עם בריכה או נחל איטי שיש בו שכבת משקעים בוצית רכה. בהדגמה הזו, אספנו דגימה בקצה נהר אולנד טאנגי בקמפוס של אוניברסיטת אוהיו סטייט בקולומבוס, אוהיו.

מצאו מיקום שבו עומק המים הוא בין 10 ל-100 סנטימטרים, ובעזרת מיכל עליון שקוף מלאו את המיכל בשכבת המשקעים העליונה ביותר ואת החלל הנותר במים, כסו את המיכל מתחת למים בחזרה במעבדה, שחררו את המכסה והשאירו אותו מכסה את המיכל כדי להפחית את האידוי ואחסנו אותו בחושך למשך מספר שעות עד מספר ימים כדי לאפשר את המשקעים ולמצוא חלקיקים להתיישב. ליצור מסלולי מירוצים להעשרת MTB. התחל בשימוש בעט או קובץ יהלום כדי לחתוך את החלק העליון של פיפטה מזכוכית בגודל 5.75 אינץ', מה שמאפשר מספיק מקום למיליליטר אחד עד שניים של מים.

לאחר מכן, השתמש במבער כדי לאטום את חיטוי הקצה. כמה מהם מגביהים מסילות יחד עם כותנה ומחטי מתכת ארוכות. כאשר מוכנים לבודד MTB, הניחו מגנטים בצידי מיכל הפלסטיק, כסנטימטר אחד מעל ממשק מי המשקעים עם הקוטב הדרומי והצפוני בצדדים מנוגדים של המיכל.

הקפד לא להפריע למשקעים. המתן 30 דקות עד מספר שעות עד שהחיידקים ישחו למגנט. לאחר מכן, השתמש במזרק כדי להסיר נוזל ממיכל הדגימה ליד ממשק מי המשקעים.

חבר פילטר למזרק ומחט מתכת למסנן, ולאחר מכן וודא שאין בועות בנימים. השתמש במחט כדי להוסיף את מי הדגימה המסוננים למסלול מרוצים חיטוי עם כותנה סטרילית ומחט המתכת. חבר את מסלול המירוצים על ידי דחיפת הכותנה בתוך הנימים למרחק של 0.5 עד סנטימטר אחד מהקצה האטום.

בעזרת פיפטה סטרילית, הסר את חיידקי טקטיקת המגנטו מהמיכל שבו הם מקובצים ליד הקוטב הדרומי של המגנט, והוסף את ה-MTB המכיל מים לקצה הפתוח של מסלול המירוצים. לאחר שמסלול המירוצים מתמלא בנוזל דגימה, הניחו אותו על צדו על משטח אופקי והניחו את הקוטב הדרומי של מגנט מוט ליד קצה החותם של מסלול המירוצים. המתן חמש עד 30 דקות עד שה-MTB יעבור דרך הכותנה.

השתמש בסכין יהלום כדי לשרוט בעדינות ליד פקק הכותנה ולנתק את קצה מסלול המירוצים. השתמש במזרק של מיליליטר אחד עם מחט צרה כדי להסיר את הנוזל המועשר ב-MTB מקצה מסלול המירוצים. כדי לצפות ב-MTB במיקרוסקופ אור, הנח טיפה של הדגימה המועשרת על פתק כיסוי.

הנח את החלקת הכיסוי על טבעת O המונחת על מגלשת זכוכית. זה נקרא טיפה תלויה. טבעת ה-O צריכה להיות בקוטר מעט קטן יותר מהחלקת הכיסוי.

לאחר מכן, הנח את השקופית על במת מיקרוסקופ אור והתמקד בקצה אחד של הטיפה. לאחר מכן כדי למשוך את ה-MTB לצד אחד של הטיפה, הנח את הקצה הדרומי של מגנט מוט קרוב לצד זה תוך מספר דקות, MTB רבים צריכים להיות בקצה הטיפה. כדי לצפות ב-MTB על ידי TEM, הנח רשת נחושת 200 רשת מיוצבת ומצופה פחמן על טיפת החיידקים המועשרים ואפשר לדגימה להתיישב למשך 10 דקות.

לאחר שטיפת הדגימה על טיפת מים למשך 30 שניות, הנח אותה על טיפה של 2% אצטט משתנה למשך 30 שניות עד חמש דקות, ולאחר מכן השתמש בפיסת נייר סינון לייבוש מלא לנתח את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב-200 קילו-וולט. מוצגת כאן תמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור של חיידק טקטיקת מגנטו יחיד המועשר מדגימת משקעים סביבתיים. הספירלה והמורפולוגיה של אזורי התא והמגנטו נראים בבירור יחד עם פלגל יחיד.

לאחר איסוף חיידקי טקטיקת המגנטו מהסביבה, טכניקת ההפרדה המגנטית תארך כשלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח RNA ריבוזומלי 16 s, שיענו על שאלות נוספות כמו, מה הקשר הפילוגנטי של חיידקי טקטיקת המגנטו שהתגלו לאחרונה לאחרים, למיקרואורגניזמים אחרים.