Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג תת-קבוצות ספציפיות של נוירונים במוח האחורי של הגוזל ולעקוב אחר המסלולים והמטרות האקסונליות שלהם. זה מושג על ידי פתיחת חלון סגלגל קטן במרכז יום עוברי.2.75. פלסמידים של ה-DNA הבא של הביצה מוזרקים לתוך המוח האחורי לומן.

לאחר מכן המוח האחורי עובר אלקטרופוטציה חד צדדית כדי לאפשר ביטוי של המבנים בקבוצת הנוירונים הרצויה והביצים מודגרות. לבסוף, גזע המוח מנותח מהעובר כולו לצורך הכנת הרכבה שטוחה או חתך רקמות. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות הקרנות אקסונליות ומטרות סינפטיות בחלק האחורי, המוח והמוח הקטן בשלבי התפתחות שונים באמצעות צביעה אימונו-פלואורסצנטית וניתוח מיקרוסקופיה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה ההתפתחותית, כגון כיצד תאים עצביים ספציפיים מקרינים את האקסונים שלהם ויוצרים קשרים סינפטיים במהלך ההתפתחות העוברית. כדי להתכונן לאלקטרופורציה, דגרו אותם בטמפרטורה של 37 עד 38 וחצי מעלות צלזיוס למשך 65 עד 70 שעות עד שהם מגיעים לשלב 16 עד 17. בזמן שהביצים דוגרות, נימי זכוכית משיכה מחברים אלקטרודות זהב כפופות בצורת L עם מחזיק מתאם למספר הדופק.

הגדר את פרמטרי האלקטרופורציה ל-25 וולט, חמישה מספרי פולסים, אורך פולס של 45 אלפיות השנייה ומרווחי פולסים של 300. הכן פיפטה לפה, מזרק 10 מיליליטר, רצועות פרפורם, מברשת רכה, מספריים חדים לניתוח ו -25 מיליליטר PBS סטרילי. הכינו תערובת נאותה של פלסמידים של DNA והוסיפו צבע ירוק מהיר כדי לדמיין את ה-DNA המוזרק.

כאשר הביצים הגיעו לשלב ההתפתחותי הנכון, הוציאו אותן מהאינקובטור ושמרו אותן במצב אופקי. השתמש ב-70% אתנול לניקוי קליפות הביצים. טפל בביצה אחת בכל פעם כדי למזער את החשיפה העוברית.

הגיע הזמן לשדר עם קצות המספריים. יוצרים חור בקוטב הביצה ובעזרת המזרק מסירים שלושה עד ארבעה מיליליטר אלבומין. בעזרת המספריים המנתחים, פתח חלון סגלגל קטן בקוטב האופקי העליון של קליפת הביצה.

במהלך כל התהליך יש לטפטף כמה טיפות PBS על גבי העובר כדי למנוע יובש. בעזרת פיפטה פה טען כמות קטנה מתערובת ה-DNA לתוך נימי הזכוכית. לאחר מכן, הניחו את העובר עם הקצה האחורי שלו מבט עקיף.

לאחר מכן החזיקו את הנימים בכ-45 מעלות, חדרו למוח האחורי של הפינוק. אל תסיר שום קרום מסביב לעובר מבלי ליצור בועות אוויר. נשפו בזהירות כדי להזריק את תמיסת ה-DNA לתוך המוח האחורי לומן.

התמיסה תתפשט מלפנים מיד לאחר הזרקת ה-DNA. מקם את האלקטרודות המקבילות במיקומים האחוריים הממוקדים המדויקים של AP ו-DV. מבלי לגעת בלב, דחפו את האלקטרודות מעט לכיוון הגחון ודופקו את האלקטרו.

יש לכסות את האלקטרודות בבועות כדי להצביע על מוליכות חשמלית, להסיר בזהירות את האלקטרודות ולטפטף כמה טיפות PBS כדי לקרר את העובר ולהסיר בועות. השתמש ברצועת פיל כדי לאטום את פתח הביצה כראוי כדי למנוע ייבוש במהלך הדגירה בעזרת מברשת רכה ו-PBS שוטפים את האלקטרודות, מניחים את הביצה בחממה למשך הזמן הרצוי. הישרדות העוברים היא כ-90% יומיים עד שלושה ימים לאחר האלקטרופורציה ופוחתת עד 50%12 ימים לאחר האלקטרופורציה.

כדי להכין תכשירים שטוחים של המוח האחורי, נתחו בזהירות את העובר, והפרידו אותו מהממברנות וכלי הדם שמסביב. מניחים את העובר בצלחת פטרי קטנה מצופה סיליקון המכילה PBS כשהעובר פונה לגב. השתמש בסיכות טונגסטן כדי לחבר אותו למנה.

ואז באמצעות נימי זכוכית חדים. צור חריץ גבי בצלחת הגג האחורית של המוח בעזרת פינצטה חדה ומספריים מיקרו. החזק את החלק העליון של הראש ומשוך את רקמת המוח האחורית בזהירות רבה מרוסטרל לפעוט.

לאחר הפרדת המוח האחורי, הסר את רקמות הגחון הנותרות. דגרו את המוח האחורי בתמיסת אלדהיד 4% פרפורמים או PFA למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו אותו עם PBT כדי להסיר את ה-PFA.

לאחר ביצוע ההכנה האימונופלואורסצנטית המתוארת בפרוטוקול הטקסט, הנח את המוח האחורי עם הפנים לגב על מגלשת זכוכית. הוסף מדיום הרכבה פלואורסצנטי על המוח האחורי והשתמש בנימי זכוכית או מחטי טונגסטן כדי לשטח את המוח האחורי על המגלשה. הוסף כמות קטנה של שומן בכל פינה כדי למנוע סחיטת הרקמה על ידי החלקת הכיסוי.

הנח בזהירות פתק כיסוי על גבי המוח האחורי והימנע מבועות אוויר להיצמדות. הוסף לק לקצוות זכוכית הכיסוי. ניתן לבצע קטעי קריו של גזע המוח בכל שלב התפתחותי אך לאחר E 6.5.

הם צריכים להיות השיטה המועדפת בשל הקושי לדמיין אקסונים בעובר הרכוב השטוח, שהופך לעבה מאוד. יתר על כן, הדגמה של סינפסה דורשת חתך של הרקמה ותצוגת הגדלה גבוהה תחת מיקרוסקופ. להכנת דגימה לחתך קריו, נתחו את העובר והסירו את כל הרקמות המקיפות את המוח.

שוטפים עם PBS. לאחר מכן השתמש במספריים מיקרו ובפינצטה חדה כדי לחתוך את העובר באזור הקיפוד של המדולה. בצע חתך רחב בין המוח הקטן למוח התיכון והסר את כל גזע המוח.

הרקמה צריכה להכיל את פונס המדולה והמוח הקטן. בדוגמה הבאה, אלמנט משפר המתבטא בתת-קבוצה אחת של נוירונים בין-נוירונים במוח האחורי שובט במעלה הזרם של Cree recombinase וקו-אלקטרופוטציה עם פלסמיד מדווח GFP ציטופלזמי תלוי Cree. הכנת הרכבה שטוחה בשלב E 4.5 חושפת שני דפוסי הקרנה אקסונליים עולים נגדיים למיפוי ההקרנות האקסונליות של נוירונים בין נוירונים DA אחד בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות.

קלטת כתב GFP ללא תנאי לפני הונאה שובטה בין שתי זרועות חזיר, יחד עם משפר קרין אחד A TOH ווקטור טרנספוזיציה. באמצעות אסטרטגיה זו, ה-Electroporated C precon conditional MG FP משולב בכרומוזומי הגוזל וכתוצאה מכך, קלטת העצירה מוסרת רק בתאי עצב D one ומאפשרת ביטוי ממושך של GFP. ב- DA תא אחד.

הצורה המסולסלת של ה-GFP קושרת אותו לממברנה כך שהוא ממוקם לאורך הממברנה האקסונלית במקום להיות מדולל בציטופלזמה. בגבעולי מוח שנאספו ב-E 13.5 ונותחו בחתכים סגיטליים. נמצא כי אקסונים DA one מצטברים במוח הקטן ומתרחבים לעבר השכבה הגרגירית החיצונית או EGL, המסומנת על ידי תאים חיוביים של ZI אחד.

מטרות סינפטיות של אקסונים D אחד במוח הקטן נותחו גם כן. עוברי E 2.75 עברו אלקטרופוטציה עם חלבון שלפוחית סינפטי שני פלסמיד מדווח, יחד עם משפר H אחד Cree וטרנספוזיציה של חזיר. שיטה זו מאפשרת את הביטוי של מדווח ה-GFP ב-DA הפרה-סינפטי טרמיני אקסונלי אחד.

המוח הקטן נחתך ב-E 13.5 וצבוע בסמן הקדם-סינפטי הכללי טמאן סינפטי, כמו גם בקלבינדין המסמן את שכבת הביקיני. תצוגה בהגדלה גבוהה של הקטע מדגימה SV שתי שלפוחיות סינפטיות חיוביות GFP במספר אזורי מוח, כולל שכבת הביקיני. תוצאה זו חושפת את הקשרים הסינפטיים של DA מוח אחורי אחד בין נוירונים במוח הקטן.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להפעיל את ה-DNA החשמלי לתוך היין העופות ביום העוברי השני נקודה 75 על מנת לתייג באופן ספציפי תת-קבוצה של תאים עצביים. הליך זה מאפשר לעקוב אחר ההקרנות האקסונליות והקשרים הסינפטיים של תאי העצב המסומנים בשלבי התפתחות מרובים.