שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה ( Schistocerca אמריקנה) מעגלי ריח
25 בינואר 2013
אנחנו מדגימים וריאציות של טכניקה רבת יחידת ההקלטה התאית לאפיין תגובות ריח מעורר בשלושת השלבים הראשונים של מסלול ההרחה חסר חוליות. טכניקות אלה יכולים בקלות להיות מותאמות לבחינת פעילות הרכב במערכות עצביות אחרות גם כן.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד פעילות עצבית מרובת יחידות שבוטלה מריח משלושת מרכזי עיבוד האותות הראשונים של מסלול הריח של החרקים. זה מושג על ידי ריסון הארבה בתא שתוכנן בהתאמה אישית וייצוב אחת האנטנות שלו להקלטות אלקטרופיזיולוגיות. השלב השני הוא לייצר מיקרו-אלקטרודה מזכוכית ולהכניס אותה לבסיס השמש כדי לנטר את התגובות המעוררות ריח.
הבא כדי לתעד את הפעילות העצבית ממוח הארבה. מתבצע הליך דיסקציה רב-שלבי כדי לחשוף את הרקמה העצבית, המעבדת את הקלט מנוירוני חוש הריח. השלב האחרון כולל מיקום מתאים של מערכי האלקטרודות מרובות כדי לתעד את הפעילות העצבית של אנסמבל מאונות הארבה והאנטנה ומגוף הפטרייה.
בסופו של דבר, שיטות ההקלטה החוץ-תאיות המודגמות כאן משמשות לאפיון תגובות מעוררות ריח בשלושת מרכזי העיבוד הראשונים לאורך מסלול הריח של החרקים. למרות ששיטה זו שימשה לאפיון התגובה העצבית המעוררת ריח במערכת ריח חסרת חוליות פשוטה יחסית, ניתן להתאים אותה גם לבחינת פעילות האנסמבל גם במערכות עצביות אחרות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה מאוד ללמוד כמה היבטים מרכזיים של הליך זה, כגון מיקום אלקטרודות וכמה שלבי דיסקציה.
בנוסף, השיטות הן בעיקר איכותיות ומעבדות שונות שיכללו אותה באופן שונה עם הזמן. כדי להתחיל בהליך זה, בחר ארבה בוגר צעיר משני המינים עם כנפיים בוגרות במלואן, אך לפני שלב ההזדווגות ממושבה צפופה. לאחר מכן, רסנו את הארבה על ידי קטיעת רגליו.
אטום את אתרי הקטיעה עם דבק רקמות. לאחר מכן הצמידו את הארבה לתא המעוצב בהתאמה אישית עם פיסת סרט חשמלי קטנה סביב בית החזה שלו. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, צור חריץ רדוד בפלטפורמת השעווה להצבת אנטנה.
הנח את האנטנה לתוך החריץ וייצב אותה באמצעות שעוות באטי בשני קצוות האנטנה. לאחר מכן, הכנס אלקטרודה קרקעית לבית החזה. השתמש בשעוות בטיק כדי לאטום את מקום החתך ולהחזיק את חוט ההארקה במקומו.
לאחר מכן, הנח את אנטנת הארבה המיוצבת מתחת למיקרוסקופ סטריאו על שולחן בידוד רעידות. חבר את קווי היציאה של בקבוקי הריח לצינור אספקת הריח. מקם את צינור אספקת הריח במרחק של כמה סנטימטרים מהאנטנה המועברת אדי ריח מוסרים על ידי משפך ואקום, הממוקם כ-10 סנטימטרים מאחורי אנטנת הארבה.
לאחר מכן לייצר אלקטרודות זכוכית באמצעות נימי זכוכית סיליקית עם מיקרו פיפטה קוטבית למלא את אלקטרודת הזכוכית במי מלח ארבה. לאחר מכן, הנח את אלקטרודת הזכוכית לתוך מחזיק מיקרו פיפט המחובר למניפולטור מיקרו ממונע. ודא שבסיס ההקלטה נראה בבירור מתחת למיקרוסקופ.
הכנס בעדינות את האלקטרודה לבסיס הסינכרון. לאחר מכן הגביר את האות 10, 000 פעמים. באמצעות AC ampחיים יותר.
סנן את האות בין 0.3 ל-10.0 קילו-הרץ ורכוש אותו בקצב דגימה של 15 קילו-הרץ. באמצעות מערכת איסוף נתונים, כאשר האלקטרודה ממוקמת כראוי, ניתן לזהות פעילות עצבית ספונטנית. ניתן לנטר תגובות מעוררות גירוי על ידי העברת דופק ריח דרך צינור העברת הריח.
ממוקם קרוב לאנטנה ועוקב אחר השינוי בפעילות החוץ-תאית, עקב אחר נהלי הריסון כפי שתוארו קודם לכן. מקם את הארבה בתא מעוצב בהתאמה אישית. התחל את תהליך הדיסקציה על ידי בניית שעווה סביב ראש הארבה.
בנה שני מגדלי שעווה משני צידי ראש הארבה, המגיעים עד לגובה האנטנות. לאחר מכן, הכנס כל אנטנה דרך חתיכה קטנה של צינור פוליאתילן המתאים היטב לאטם גומי. לאחר מכן חבר את האטמים למגדלי השעווה כך שצינורות הפלסטיק יוכלו להחליק בחופשיות לכיוון בסיס האנטנות או הרחק ממנו תוך מניעת תנועת האנטנות.
לאחר מכן, מתחת למיקרוסקופ, התחל לבנות שעווה סביב ראש הארבה כדי לאפשר זלוף מי מלח במהלך ואחרי הליך הדיסקציה. השעווה צריכה להתחיל ממש מעל חלקי הפה, להקיף את שני מגדלי השעווה ולהתרחב מעבר לעיניים המורכבות. לאחר שכוס השעווה נבנתה במלואה, חבר את בסיס האנטנות לקצה התחתון של צינור הפלסטיק באמצעות שרף אפוקסי.
זה יבטיח שהאנטנות יוחזקו במקומן גם לאחר הסרת הקוטיקולה שמסביב. שמור את השעווה מלאה בתמיסת מלח מנקודה זו ואילך. כעת, הסר את האזור המלבני המרכזי בין השניים.
אנטנה. לאחר מכן, הסר את הקוטיקולה באזורים הסמוכים מבלי להפריע לעיניים המורכבות או לציפורן בבסיס האנטנה. בעזרת מלקחיים עדינים, הסר בעדינות את שקי האוויר וגופי השומן המקיפים את המוח.
מוח הארבה אמור להיות גלוי כעת בבירור. אזורי המוח המעבדים את מידע הריח ממוקמים בין השניים. אנטנה מושכת בעדינות את המעי וחותכת אותו בעזרת מספריים עדינים.
לאחר מכן הסר את הכנפיים ובצע חתך קטן בבטן ממש מעל פי הטבעת. הסר את המעי על ידי משיכת המעי האחורי בעזרת מלקחיים גסים. שלב זה מבטיח שתנועת המעיים לא תערער את יציבות התכשיר.
למניעת דליפת מי מלח. קושרים את הבטן ממש לפני אתר החתך עם חוטי תפרים. לאחר מכן, השתמש בפלטפורמה קטנה העשויה מלולאת תיל דקה המצופה בשכבה דקה של שעווה כדי להעלות את המוח ולייצב אותו לאלקטרופיזיולוגיה.
הקלטת המוח מוגנת על ידי מעטפת שקופה למחצה, אותה יש להסיר לפני ההקלטות. כדי להחליש את הנדן, רוקנו חלקית את השעווה ופזרו בזהירות כמות קטנה של פרוטאז על פני המוח. לאחר כחמש עד 10 שניות של מריחת אנזימים, יש לשטוף את המוח היטב במי מלח.
לאחר מכן צבטו בעדינות רבה ומשכו את הנדן כלפי מעלה בעזרת מלקחיים עדינים במיוחד כדי לקרוע אותו ולחשוף את אתרי ההקלטה. בהליך זה, הנח את תכשיר הארבה מתחת למיקרוסקופ סטריאו על שולחן בידוד רעידות. שמור על קצב זלוף מלח קבוע של כ- 40 מיליליטר לשעה.
במהלך הניסוי, השתמש בחוט כסף כלוריד שקוע בכוס השעווה המלאה במי מלח כאלקטרודה הקרקעית. הכן את מערך אספקת הריח בדומה לניסוי הקלטת חיישן יחיד. לפני הניסוי, יש לצבוע את האלקטרודות בזהב כדי להשיג את העכבות בטווח של 200 עד 300 קילו.
השתמש בבדיקת סיליקון של 16 ערוצים להקלטות נוירונים ראשיים. מתחת למיקרוסקופ. מקם את האלקטרודה קרוב לפני השטח של אונת האנטנה והוכנס בעדינות לרקמה באמצעות מניפולטור מיקרום ידני באתר הקלטה אידיאלי, אותות חוץ-תאיים ייקלטו על ידי ערוצי הקלטה מרובים ויהיה להם יחס אות לרעש גבוה.
עבור הקלטות תאים של קניון, נעשה שימוש בטרו חוט מעוות בהתאמה אישית החשמלית את הטרו בעקבות ההליכים לציפוי אלקטרוני. לאחר מכן בדיקת הסיליקון מניחה את הטרו על פני גוף הפטרייה. מכיוון שהסמארה של התאים הקנייתיים מוגבלת לשכבה השטחית של אזור זה, ניתן לבצע גם הקלטות של תאים עיקריים וגם של תאים קנייתיים בו זמנית מאותו תכשיר ארבה.
לאחר זיהוי מיקום ההקלטה, המתן לפחות 15 דקות כדי לאפשר ייצוב של האלקטרודות. לאחר מכן רכוש את האות החוץ-תאי ב -15 קילו-הרץ. סנן אותו בין 0.3 לשישה קילו-הרץ והגביר אותו באמצעות מגבר AC 16 ערוצים, הן ספונטני והן מעורר
גירוי.ניתן לצפות בפעילות עצבית מרובת יחידות מנוירוני הקרנה באונה של אנטנה. עקבות מתח חוץ-תאיים גולמיים המראים תגובות של נוירון קולטן ריח לשני ריחות שונים. שני אתנול אוקטלי ואתנול H אחד מוצגים כאן.
עקבות חוץ-תאיים מייצגים מהקלטת אונת אנטנה מרובת יחידות מוצג כאן. ניתן לראות את פוטנציאל הפעולה או הקוצים של אמפליטודות משתנות שמקורן בנוירונים עיקריים שונים במעקב מתח זה. שימו לב שדופק ריח של ארבע שניות הופעל במהלך פרק הזמן שצוין על ידי הקופסה האפורה.
דוגמה להקלטה חוץ-תאית של גוף פטריות מוצגת כאן. בניגוד לתאי עצב של קולטני ריח ונוירונים עיקריים, לתאי קניון בגוף פטריית החרקים יש פעילות בסיסית נמוכה יותר ומגיבים לריחות בצורה דלילה וסלקטיבית. כדי לבודד תגובות יחידה בודדת מההקלטות מרובות היחידות הללו, אנו מבצעים הליך מיון ספייק באמצעות תוכנה שפורסמה באופן לא מקוון.
דוגמאות למיון נוירון עיקרי ותאי קניה מוצגות כאן לאחר צפייה בסרטון זה. צריך להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע הקלטות מרובות יחידות חוץ-תאיות כדי לאפיין את הפעילות העצבית של האנסמבל בשלושת מרכזי הריח הראשונים לאורך מסלול הריח של ההכנסה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים וריאציות של טכניקת ההקלטה הרב-יחידתית החוץ-תאית כדי לאפיין תגובות הנגרמות על ידי ריח בנתיב הריח ההפוך בחסרי חוליות. ניתן להתאים את השיטות כדי לבחון פעילות אנסמבל במערכות עצביות אחרות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי העצב
- אלקטרופיזיולוגיה
- עיבוד חוש הריח
רקע
- הבנת האופן שבו חרקים מעבדים מידע חוש הריח היא חיונית להבנה של מנגנונים עצביים.
- הקלטות רב-יחידתיות מאפשרות תצפית על פעילות עצבית בתגובה לגירויים.
- חרקים כמו ארבה משמשים מודלים יעילים לחקר נתיבי חוש הריח.
- מחקרים קודמים התמקדו בתגובות של נוירון יחיד, אך פעילות אנסמבל מספקת נקודת מבט רחבה יותר.
מטרת המחקר
- להקליט פעילות עצבית רב-יחידתית הנגרמת על ידי ריח מנתיב הריח של החרק.
- לחקור וריאציות בטכניקות ההקלטה לצורך רכישת נתונים טובה יותר.
- לספק מסגרת להתאמת טכניקות אלו למערכות עצביות אחרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הארבה מוגבל בתא מעוצב במיוחד ליציבות.
- מכשיר מיקרו-אלקטרודה מזכוכית מיוצר ומוחדר כדי לנטר תגובות.
- פעילות עצבית מוקלטת ממוח הארבה באמצעות מערכי אלקטרודות רבות.
- נוהל ניתוח חושף רקמת עצבים להקלטה יעילה.
תוצאות עיקריות
- הקלטה מוצלחת של תגובות הנגרמות על ידי ריח ממרכזי הריח של הארבה.
- הוכחת היתכנות השימוש בהקלטות רב-יחידתיות בהקשר זה.
- הספקת תובנות לגבי פעילות האנסמבל של עיבוד חוש הריח.
- הקמת מתודולוגיה שניתן להתאים למערכות עצביות אחרות.
מסקנות
- המחקר מקדם את ההבנה של עיבוד חוש הריח בחרקים.
- וריאציות של טכניקת ההקלטה יכולות לשפר את איסוף הנתונים במדעי העצב.
- מחקר עתידי יכול להתבסס על שיטות אלו כדי לחקור נתיבי עצב אחרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding neural ensemble dynamics in model systems provides foundational insights for target validation in neuroscience drug discovery. Multi-unit recording techniques enable mechanistic de-risking by characterizing circuit-level responses to sensory stimuli, supporting predictive confidence in early-stage target engagement studies. This approach aids in triaging therapeutic hypotheses by linking neural activity patterns to behavioral outputs in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through ensemble neural activity mapping in olfactory circuits.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying spatiotemporal firing patterns across principal neuron populations.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking odor-evoked responses to downstream processing in Kenyon cells.
Assay Development & Screening Readiness
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation via standardized extracellular recording.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through consistent electrode placement and signal acquisition protocols.
- Scalability: Facilitates platform reuse across neural systems with adapted microelectrode configurations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by characterizing ensemble activity in olfactory memory and learning pathways.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation via stable multi-unit recordings.
- Risk Mitigation: Supports predictive de-risking by isolating neural responses to controlled sensory stimuli.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing in sensory processing circuits, supporting lead identification through quantifiable neural readouts, and informing preclinical advancement decisions via ensemble activity profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by monitoring odor-evoked multi-unit responses in antennal lobe and mushroom body.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized 16-channel silicon probe and twisted wire tetrode recordings with high signal-to-noise ratio.
- Analytics: Enables quantitative comparison of neural responses via extracellular voltage trace acquisition at 15 kHz sampling and 0.3–6.0 kHz filtering.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by characterizing sparse, selective Kenyon cell responses linked to olfactory memory.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform adaptable to other neural systems beyond olfaction.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic de-risking of olfactory circuit engagement.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of multi-unit neural recordings.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reduced mechanistic ambiguity in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on ensemble neural response profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microsurgery, and neural tissue preparation.
- Dependent on vibration isolation tables, micro manipulators, and AC amplifiers with 10,000x gain.
- Necessitates cross-team standardization of electrode fabrication and saline perfusion protocols.
- Involves adaptation considerations for different model systems and brain region targeting.
- Limited by qualitative signal interpretation and lab-to-technique variability over time.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:11
Single Sensillum Preparation for Recording Odor-evoked Responses from Olfactory Receptor Neurons
4:47
Locust Dissection Procedure for Antennal Lobe and Mushroom Body Recordings
8:15
Multi-unit Recordings from the Antennal Lobe and the Mushroom Body
10:29
Results: Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Olfactory Circuits
11:50
Conclusion
