Name: בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: למדו לבודד קardiomyocytes פרוזדורים וחדרית מעכברים מהונדסים גנטית לצורך הקלטות patch clamp ומחקר אלקטרופיזיולוגי. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד ערוצי Kv ומנגנוני הפרעות קצב לבביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מForschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), פריץ תיסן-Stiftung וCharité / MDC.

1. הרדמת בעלי חיים וקצירת איברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכבר באמצעות זריקת intraperitoneal (IP) של קטמין (200 מ&quot;ג / קילו BW) וXylazine (20 מ&quot;ג / קילו BW). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לanticoagulate להזריק IP הפארין 250 יחב&quot;ל כדי למנוע היווצרות קרישי דם וקרישים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד ההרדמה עמוקה הוא הגיע, אשר מאופיינת על ידי areflexia. כדי לבדוק areflexia רפלקס, בדיקת קרנית על ידי נגיעה בקרנית או רפלקס טיסת ניסוי על ידי צביטת זנב בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכבר על שולחן ניתוחים ולתקן אותה במצב שכיבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך העור וקיר הבטן מתחת xiphoid ולבצע פתיחת בית חזה צדפה: הארך את הקיצוץ לשני הצדדים לאורך קשת costal ולאחר מכן לחתוך את הצלעות בקו בית השחי המדיאלי, להסיט את בית החזה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קרום לב, אתר כולים נהדרים. לחץ בעדינות על זנב לב טוב יותר כדי להציג את אב העורקים. מהדק את אב העורקים באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הלב בקעירות זוג של<html> cissors וינתח את כל כלי חיבור עם חתך אחד אחד. הקפד לשמור על חלק גדול מספיק של אב עורקים עולים לcannulation Langendorff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר מייד ללב שחוט צלחת פטרי מלא בקרח קר ופתרון מראש חומצן 1 (לפתרונות, ראה טבלת 1). </li></ol> 2. הכנת זלוף לב וLangendorff <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate אב העורקים עם צינורית פלדת 1.8F. הקפד להימנע מתסחיף אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבע אב עורקים בצינורית עם תפר כירורגית והתקפי לב, מפוצץ ב1 מ&quot;ל של פתרון 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורית עם מנגנון Langendorff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא זמן מפתיחת בית החזה לcannulation Langendorff אינה עולה על 120 שניות כדי למנוע פציעה ממושכת איסכמיה / reperfusion לשריר הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לב ינקב עם 10 מ&quot;ל של Ca 2 + ללא פתרון 2 (4 מ&quot;ל / דקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לב ינקב עם פתרון collagenase 3 דקות ל8 (4 מ&quot;ל / דקה). </li></ol>&quot;&gt; 3. מייקר דיסוציאציה le של הלב צ&#39;יימברס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לב העברה לתוך צלחת שחוממה מראש 100-מ&quot;מ פטרי המכיל Ca 2 הנמוך פתרון + 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את אב עורקים ורקמות אחרות שאינן לבביות עם מספריים והשליכו אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אטרייה נפרדת וחדרי לב ולהמשיך בכל תא בנפרד. שמור על תאים שקועים בפתרון 4. השתמש בכמויות קטנות (פחות מ 5 מ&quot;ל). </li></ol> 4. דיסוציאציה נוספת של cardiomyocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cardiomyocytes פרוזדורים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייחד cardiomyocytes פרוזדורים להעביר אטרייה לתוך צלחת תרבות נפרדת מראש מחוממת 100-מ&quot;מ ולנתק את הרקמה באמצעות משייכתו בעדינות אותו לגזרים עם מלקחיים עדינים. ודא ניתוק כמעט מוחלט של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 1 מ&quot;ל עם קצה מוגדל אש מלוטשת פיפטה פלסטיק להשעות את התאים ב1 מ&quot;ל של פתרון 5 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את התאים מפסולת באמצעות מסנן תא (200 מיקרומטר גודל רשת). </li> &lt;li&gt; הוסף פתרון 5 מ&quot;ל 5 עד השעית התא וצנטריפוגה עבור 2 דקות בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים פעלו תחת מכסה מנוע תרבית תאים. בטל supernatant מחדש הושעה-גלול ב 5 מ&quot;ל של פתרון 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שקיעה על ידי כוח הכביד למשך 10 דקות בצינור מ&quot;ל 15, סרכזת לדקות 1 בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר. הסר את supernatant. Re-להשעות התאים בהתאם לכמותם ב1-5 מ&quot;ל של פתרון 6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cardiomyocytes חדרית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את אזור החדר השמאלי של עניין עם מלקחיים עדינים ב5 מ&quot;ל של פתרון 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את תאים על ידי pipetting בעדינות עד שרוב התאים המופרדים. להעביר את פתרון התא לאחר הסינון (200 גודל רשת מיקרומטר) לתוך צינור מ&quot;ל 50, להוסיף נפח של 25 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עבור 2 דקות בגיל 16 XG בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים פעלו תחת מכסה מנוע תרבית תאים. הסרת supernatant, מחדש להשעות הגלולה ב 25 מ&quot;ל שלפתרון 6 ולאפשר שקיעה של התאים למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ולהסיר את supernatant, להוסיף 25 - 50 מיליליטר פתרון 6 בתאים. </li></ol></li></ol> 5. הכנת cardiomyocytes לאלקטרופיזיולוגיה הניידת, או אם מחקרים ביוכימיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללימודי electrophysiology, לשמור על myocytes בפתרון 6 בצינור מ&quot;ל 50 ומעכב את השקיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחקרים ביוכימיים, הדמית סיד למשל, myocytes צלחת על צלחת תרבות laminin מצופית תא (20 מיקרוגרם / המ&quot;ל laminin ב PBS ריכוז סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכתמת immunofluorescence להכין צלחת צלחת תרבית תאים עם תלושי כיסוי זכוכית ומצופית בפתרון laminin (ריכוז סופי 50 מיקרוגרם / המ&quot;ל laminin ב PBS). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון לפני myocytes ציפוי. פלייט התאים ולשלוט בצפיפות התאים באמצעות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן myocytes לדבוק לכסות להחליק לשעת 1 ב 37 ° C ב2% CO 2, להסיר את הפתרוןולהתחיל מייד בפרוטוקול הליך הכתמה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם מקבע, למשל 4% PFA ב PBS (pH 7.5) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ופעל עם שלושה שלבי כביסת PBS עבור 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לpermeabilize התאים ולעכב נוגדן מחייב נוקב דגירת myocytes עם סרום 10%, טריטון 0.3%, 0.2% BSA ב PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם הנוגדן הראשוני לשעה 1 ב 37 ° C ולשטוף כפי שתואר קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם הנוגדן המשני לשעה 1 בטמפרטורת חדר. לcounterstain גרעינים וα-actinin השימוש DAPI וphalloidin מצומדת fluorochrome (אלקסה פלואוריד 488, Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה, להעביר את כיסוי הזכוכית מחליק בזהירות על שקופיות מיקרוסקופ silane טופלו ותאים להטביע בהרכבה בינונית פלואורסצנטי. </li></ol></li></ol> 6. הנייד אלקטרופיזיולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הקלטות כל תא תיקון-מהדק בfreמבודד cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים shly בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת cardiomyocytes מופיע בריא לתא זלוף מלא בנפח מוגדר של פתרון אמבטיה תאית. 117 mM NaCl, 4 המ&quot;מ KCl, 1 mM KH 2 4 ת.ד., 4 המ&quot;מ 3 NaHCO, 1.7 המ&quot;מ MgCl 2, 3 המ&quot;מ CoCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ, גלוקוז 10 מ&quot;מימ, וTetrodotoxin 0.02 מ&quot;מ (TTX), (pH 7.4) . השתמש NaOH להתאמת ערך ה-pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בציוד מהדק תיקון ראוי (IX71 מיקרוסקופ כלומר הפוך, מגבר 700B Multiclamp, מערכת Digidata 1440A רכישה ומחשב עם pClamp10.3 תוכנה (התקנים מולקולריים)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipettes תיקון עם התנגדויות של 3-5 MΩ כאשר התמלא פתרון תאי המכיל 130 מ&quot;מ KCl, 2 המ&quot;מ MgCl 2, HEPES 11 מ&quot;מ, 11 המ&quot;מ EGTA, 5 המ&quot;מ Na 2 ATP, 0.4 המ&quot;מ Na 2 GTP, 5 מ&quot;מ Na 2 CP ו -4.9 mM CaCl 2 (pH 7.2). השתמש KOH להתאמת ערך ה-pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר החוצה K + זרמי duצעדי טבעת 4.5-sec מתח לבחון פוטנציאלים בין -60 ו50 mV במרווחי 10-MV מפוטנציאל החזקת -70 mV לאחר 20-msec prepulse לmV -40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא זרמי דליפה תמיד &lt;100 הרשות פלסטינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתיחה של K + זרמים השונות להשתמש במעכבים ספציפיים כמו 4-aminopyridine (4-AP: Biomedicals ICN, אירווין, קליפורניה, ארה&quot;ב), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) או Tetraethylammonium (תה; סיגמא). פתרוני מניות צריכים להיות מוכנים בפתרון אמבטיה תאי, ולהחיל ישירות על הסביבה הקרובה ביותר האפשרית של התא דרך microtip לאחר הקלטות &quot;בסיסיות&quot;. האיזון צריך להיות מותר ל2-3 דקות לפני הקלטות &quot;סמים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח לנרמל אמפליטודות נוכחית בתאים בודדים לגודל תא (קרום קיבול כל תאים). לנתח נתונים מחוברים באמצעות pClamp10.3 תוכנה (התקנים מולקולריים) או תוכנה דומה. </li></ol>

<ol><li>Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+all+voltage-gated+potassium+channels+use+MiRPs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs?</a> Circ. Res. 88, 981-983 (2001).</li>
<li>Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRP1+forms+IKr+potassium+channels+with+HERG+and+is+associated+with+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia.</a> Cell. 97, 175-187 (1999).</li>
<li>Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+voltage-gated+K%2B+channel+subunits+in+adult+rat+heart.+Relation+to+functional+K%2B+channels%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels?</a> Circ. Res. 77, 361-369 (1995).</li>
<li>Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+atrial+fibrillation+on+the+risk+of+death%3A+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study.</a> Circulation. 98, 946-952 (1998).</li>
<li>Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+the+calcium-independent%2C+depolarization-activated+K%2B+currents+in+rat+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).</li>
<li>Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atrial+ion+channel+and+transporter+subunit+gene-expression+remodeling+associated+with+valvular+heart+disease+and+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 471-481 (2005).</li>
<li>Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+transient+outward+K%2B+current+diversity+in+mouse+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).</li>
<li>Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNE3+mutation+V17M+identified+in+a+patient+with+lone+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation.</a> Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).</li>
<li>Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+KCNQ1+current+by+atrial+fibrillation-associated+KCNE4+%28145E%2FD%29+gene+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med.+J.+%28Engl.%29%22%5BJournal%5D)">Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism.</a> Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).</li>
<li>McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MinK-related+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The MinK-related peptides.</a> Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).</li>
<li>Pongs, O., Schwarz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancillary+subunits+associated+with+voltage-dependent+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels.</a> Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).</li>
<li>Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+of+function+in+IKs+secondary+to+a+mutation+in+KCNE5+associated+with+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation.</a> Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).</li>
<li>Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+97T+polymorphism+in+KCNE5+to+risk+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation.</a> Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).</li>
<li>Roepke, T. K., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetics+and+cardiac+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetics and cardiac ion channels.</a> Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).</li>
<li>Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+kcne2+impairs+ventricular+repolarization+via+disruption+of+I%28K%2Cslow1%29+and+I%28to%2Cf%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f).</a> FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).</li>
<li>Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+polymorphism+associated+with+antibiotic-induced+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).</li>
<li>Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+in+KCNE1-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation in KCNE1-null mice.</a> Circ. Res. 97, 62-69 (2005).</li>
<li>Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+KCNE2+gain-of-function+mutation+in+patients+with+familial+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation.</a> Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).</li>
<li>Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BThe+association+of+single+nucleotide+polymorphism+of+slow+delayed+rectifier+K%2B+channel+genes+with+atrial+fibrillation+in+Han+nationality+Chinese%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Xin.+Xue.+Guan.+Bing.+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">[The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese].</a> Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).</li>
<li>Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((minK-related+peptide+1+associates+with+Kv4.2+and+modulates+its+gating+function%3A+potential+role+as+beta+subunit+of+cardiac+transient+outward+channel%3F+Circ%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ.</a> Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

עם ההתפתחות הגוברת של זני עכבר מהונדס גנטי כדי ללמוד תפקוד לב ולב הפתולוגיה הקשור למחיקת גן יש גם עניין גובר בשיטות מיוחדות כדי ללמוד השפעות של מחיקת הגן הספציפית במבחנה. במעבדתנו אנו לומדים את התפקידים של משפחה של תת יחידות עזר ערוץ KV על repolarization לב. גני KCNE מהווים משפחה של 5 גנים (KCNE1-5) שממלאים תפקידים חשובים בחדרית האנושית וrepolarization פרוזדורי 11, 15. KCNEs הם יחידות בודדות הטרנסממברני תחום KV ערוץ עזר שאינו עוברים כ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td></tr><tr><td> Tetrodotoxin </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> 4-aminopyridine </td><td> Biomedicals ICN </td></tr><tr><td> Heteropodatoxin 2 </td><td> Alomone </td></tr><tr><td> Tetraethylammonium </td><td> כימיקלי סיגמה </td></tr><tr><td> סוג collagenase 2 </td><td> וורטינגטון </td></tr></tbody></table>

בידוד והקלטות בערוץ kv בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית murine

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

גני KCNE לקודד למשפחה קטנה של יחידות משנה נלווית ערוץ KV היוצרים קומפלקסי heteromeric עם יחידות משנת KV ערוץ אלפא לשנות את המאפיינים התפקודיים שלהם. מוטציות בגני KCNE כבר נמצא בחולים עם הפרעות בקצב לב, כגון תסמונת QT הארוכה ו / או פרפור פרוזדורים. עם זאת, הפתופיזיולוגיה המולקולרית המדויקת המובילה למחלות אלה נותרת חמקמקה. במחקרים קודמים את תכונות אלקטרו של המחלה גורמת למוטציות בגנים אלו בעיקר נחקרו במערכות ביטוי Heterologous ואנחנו לא יכולים להיות בטוחים אם ניתן לתרגם ישירות את ההשפעות שדווחו לcardiomyocytes ילידים. במעבדה שלנו ולכן אנו משתמשים בגישה שונה. אנחנו ישירות לחקור את ההשפעות של מחיקת גן KCNE בcardiomyocytes המבודד מעכברים בנוקאאוט על ידי סלולרי electrophysiology - טכניקה ייחודית שאנו מתארים בגיליון זה של כתב העת של ניסויים באופן חזותי. את הלב מGeneticaעכברים מהונדסים KCNE lly נכרתו במהירות ומותקן על גבי מכשיר Langendorff ידי cannulation אב עורקים. Ca 2 + חינם בשריר הלב, כבול בEGTA, וניתוק של myocytes הלב ואז הושג על ידי זלוף המדרדר של עורקים הכליליים עם התמחה נמוך Ca + 2 collagenase חיץ המכיל. אטרייה, קיר חופשי חדרית ימין והחדר השמאלי ואז יכולה להיות מופרדת על ידי טכניקות מייקרו. אז סיד חוזר ומוסיף לאט לcardiomyocytes המבודד בצעד מרובה הכולל הליך כביסה. cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים של מראה בריא ללא התכווצויות ספונטניות האז העביר מייד לניתוחים אלקטרופזיולוגים ידי טכניקת תיקון מהדק או ניתוחים ביוכימיים אחרים בתוך 6 השעות הראשונות שלאחר בידוד.

בידוד של cardiomyocytes Murine הבוגר מעכברים מהונדסים גנטי כדי ללמוד את התפקיד של גנים ספציפיים של עניין במבחנה הפך לכלי רב עצמה עוד יותר להבין פתופיזיולוגיה לב. שיטה זו משמשת כיום על ידי מספר קטן, אך גדל רק במעבדות מדע בסיסיות ברחבי העולם. עם זאת, בידוד של cardiomyocytes Murine חדרית בוגרים יכול להיות מסובך וצריך להיעשות ביסודיות ושוב ושוב על ידי ידות מנוסות. איור 1 מציג cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים מבודדי מופת טריה. לcardiomyocytes חדרית אנו ממליצים ...

Kv ערוץ התפקוד קשור הפרעות בקצב לב. על מנת לחקור את המנגנונים המולקולריים שיובילו להפרעות קצב כאלה אנו מנצלים פרוטוקול שיטתי לבידודה של cardiomyocytes פרוזדורים וחדרים מעכברי KV ערוץ נלווה למקטע בנוקאאוט. cardiomyocytes המבודד יכול מייד לאחר מכן לשמש למחקרים אלקטרו סלולריים, (IF) מבחנים ביוכימיים או immunofluorescence.

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי שריר לב (cardiomyocytes) חיים מהעליה ומהחדר של עכברים שעברו הנדסה גנטית, לצורך שימוש בהקלטות patch clamp של תא שלם ובניסויים אחרים. הדבר מושג תחילה על ידי כריתה זהירה אך מהירה של לב החיה המורדמת. השלב השני הוא חיבור הלב שנכרת ועבר קנולציה למכשיר ה-LOR.בשלב הבא, הלב עובר פרפוזיה רטרוגרדית נרחבת עם תמיסת קולגנאז. כדי לשחרר את רקמת החיבור, השלב הסופי הוא להפריד את הרקמה על ידי משיכה עדינה באמצעות פינצטה עדינה ולהעביר את התאים באמצעות טיפ של פיפטה פלסטית שעבר ליטוש באש (fire polished). לאחר מכן, התאים מוססים מחדש בשלבים עם תמיסה עשירה בסידן. לבסוף, נעשה שימוש בטכניקת whole cell patch clamp כדי להראות הבדלים בזרמים של תעלות פוטסיום תלויות-מתח.היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שתקבלו כמות טובה של cardiomyocytes מהלב ומהחדרים עם מאפיינים טובים לניסויים המשכיים. בדרך כלל, מדענים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקשו בתחילה, שכן נדרש תרגול רב כדי לבצע את הפרוצדורה במדויק ולהשיג תוצאות טובות באמת. אני, לאחר הזרקת חומרי ההרדמה ו-250 IU heparin, מוודא שהעכבר נמצא תחת הרדמה עמוקה על ידי צביטה של הזנב לבדיקת רפלקס הבריחה.בשלב הבא, העבירו את העכבר לשולחן הניתוח במצב שכיבה על הגב. לאחר מכן, בצעו חתך בעור ובדופן הבטן מתחת לעצם השטרנומית. זאת כדי לבצע תורקו 함께 (clamshell thoracotomy).הרחיבו את החתך לשני הצדדים לאורך קשת הצלעות. לאחר מכן, חתכו את הצלעות בקו הבתיח המדיאלי והסיטו את כלוב הצלעות כלפי מעלה. לאחר מכן, פתחו את פריקרד (קרום העטיפה של הלב) ואתרו את כלי הדם הגדולים.לחץ בעדינות על לב הדג מסוג coddle כדי להבליט טוב יותר את האורטה. לאחר מכן, תקפיץ את האורטה באמצעות פינצטה. הרם את הלב בזהירות, מקם מספריים מתחת ללב ובצע חיתוך יחיד להסרת כל כלי הדם המקשרים.יש לוודא ששימרתם חלק גדול מספיק מהעורק האורטה העולה לצורך קנוקציה של לור. לאחר מכן, העבירו מיד את הלב המוצא לצלחת פטרי מלאה בפתרון קרח, קר וקדם-1. בהליך זה, בצעו קנוקציה לאורטה באמצעות קנולה מפל במידה של 1.8 French, והקפידו למנוע תסביב אוויר.בשלב הבא, קבעו את האורטה לקנולה באמצעות תפר כירורגי. לאחר מכן, שטפו את העורקים הכליליים עם מיליליטר אחד של תמיסה. אחד. חברו את הקנולה למכשיר 랑גר (Langendorff) כדי למנוע פגיעת רפרפוזיה לאחר איסכמיה ממושכת של השריר הלבבי.הקפידו לבצע את הפעולות החל מהתורקוטומיה ועד לקנולציה של ה-L endorf בתוך 120 שניות. לאחר מכן, לאחר מילוי מוקדם של סליל החימום של מערכת ה-L endorf בתמיסה נטולת סידן,K perfuse את הלב עם 10 milliliters של תמיסה זו בקצב של 4 milliliters לדקה.לאחר מכן, בצעו פרפוזיה של הלב עם תמיסת קולגנאז. שלוש למשך שמונה דקות בקצב של ארבעה מיליליטר לדקה. כעת העבירו את הלב לצילחת פטרי של 100 מילימטר שחוממה מראש ומכילה תמיסת סידן נמוך. ארבע.הסר בזהירות את אבי העורקים ורקמות אחרות שאינן רקמות לב באמצעות מספריים. לאחר מכן, הפר את העליות ואת החדרים ושמור את רקמות העליות והחדרים טבולות בכמות קטנה של תמיסה. ארבע. כדי לבודד את התאי שריר הלב (cardiomyocytes) מהעליות, העבר את העליות לכלי תרבית נפרד בנפח 100 מ"מ שחומם מראש.הפרידו את הרקמה על ידי מתיחה עדינה בעזרת פינצטה עדינה, וודאו שהרקמה מופרדת כמעט לחלוטין. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה של מיליליטר אחד עם טיפ פלסטיק מורחב שעבר שריפה (fire polished) כדי להשעות את התאים ב-1 mL של תמיסה. ארבעה עבור תאי עליה וחמישה מיליליטרים של תמיסה.ארבע עבור תאי חדרים למשך חמש דקות. לאחר מכן, הפרד את התאים מהפסולת באמצעות מסנן תאים בעובי רשת של 200 micron. סבב את התאים בצנטריפוגה בתמיסה ארבע למשך דקה אחת עבור תאי עליות, ולמשך שתי דקות עבור תאי חדרים בטמפרטורת החדר במהירות של 16 ×g בתוך מabilis תרביות תאים, השלך את הנוזל העליון והשהה מחדש את המשקע בחמישה מיליליטר של תמיסה.חמישה עבור תאי העליה וכ-20 עד 25 מיליליטר. עבור תאי הפרוקיד, נעקע את המבחנה בעדינות כדי להמיס את משקע התאים ונצנטריפוג שוב למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ב-16 times G. לאחר הצנטריפוגה השנייה, נשפוך שוב את העלייה ונמיס את המשקע בחמישה מיליליטר של תמיסה. שישה עבור תאי העליה וכ-20 עד 25 מיליליטר עבור תאי הפרוקיד.לאחר מכן, המתן 10 דקות לשקיעת התאים. תחת מ nws-hood לתרבית תאים, הסר את הנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן ספור את התאים. עבור מחקרי אלקטרופיזיולוגיה, הוסף 25 עד 50 מיליליטר של תמיסה שש לתאים המיועדים למחקרי אלקטרופיזיולוגיה.שמרו את המיוציטים בתמיסה שש בתוך מבחנה של 50 מיליליטר ומנעו שקיעה. עבור צביעה אימונופלואורסצנטית, הכינו צלחת תרבית תאים עם כיסויי זכוכית מצופים בתמיסת למינאט בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם למיליליטר.דגרו את צלח תרבית התאים עם Laminin ב-PBS למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הסירו את תמיסת הלמינין. לפני זריעת המיוציטים תחת מיקרוסקופ, זרעו את התאים ובקרו את צפיפות התאים.אפשרו למיוציטים להיקשר לכיסוי הזכוכית למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C וב-2% CO2. לאחר שעה, הסירו את התמיסה והתחילו מיד בפרוטוקול הסטנדרטי של הליך הצביעה. לאחר מכן, דגרו את המיוציטים עם חומר מקבע.לדוגמה, 4% PFA ב-PBS ב-pH 7.5 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו שלושה שלבי שטיפה ב-PBS למשך חמש דקות כל אחד, כדי להחדיר את החומרים לתאים ולמנוע קשירה לא ספציפית של נוגדנים. דגרו את המיוציטים עם 10% serum, 0.3% Triton ו-0.2% BSA ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, דגרו אותם עם הנוגדן הראשוני למשך שעה אחת ב-37 °C ושטפו אותם כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, דגרו עם הנוגדן המשני למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר לצביעה נגדית של הגרעינים וה-alpha actinin. דגרו את הנוגדן המשני עם DPI ו-phin מצומד לפלואורוכרום למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר שטיפה, העבירו בזהירות את זכוכית הכסייה למשקופיות מיקרוסקופ שעובדו במי מלח. לאחר מכן, שקעו את התאים בתוך קיבוע פלואורסצנטי להקלטות patch clamp של תא שלם. העבירו את התאי השריר הלבבי (cardiomyocytes) הנראים בריאים לתא הפרפוזיה הממולא בנפח מוגדר של תמיסת רחצה חוץ-תאית.השתמשו בציוד patch clamp מתאים ובפיפטות patch בעלות התנגדות של שלושה עד חמישה mega ohms כאשר הן מלאות בתמיסה תוך-תאית. עבור הקלטות patch clamp סטנדרטיות, לאחר ביצוע patch לתא והשגת giga seal, השתמשו בפרוטוקול סטנדרטי למדידת זרמי האספיק (potassium currents) על ידי עירור זרמי אספיק יוצאים באמצעות מדרגות מתח של 4.5 שניות, מ-60- millivolts ל-50 millivolts במרווחים של 10 millivolts. ודאו שזרמי הדליפה (leak currents) תמיד קטנים מ-100 pico amps.כדי להבדיל בין זרמי אשלגן שונים, השתמש במעכבים ספציפיים כגון four amino paridine, hetero potto, toin או tetraethyl ammonium. יש להכין תמיסות מלאי בתמיסת אמבט חוץ-תאית ולהחדירן ישירות לסביבה הקרובה ביותר לתא באמצעות מיקרו-טיפ. לאחר הקלטות הבסיס.יש לאפשר זמן התאקלמות של שתי עד שלוש דקות לפני תחילת ההקלטות לאחר הגשת התרופה. בסיום, נתחו את הנתונים במצב לא מקוון (offline) באמצעות תוכנת P clamp 10.3 או תוכנה מקבילה. איור זה מציג תא שריר לבבתי (cardiomyocyte) פרוטיפטי שצבעו DPI ו-LOR 4 88 Phin. וכאן מוצגים עקומות לדוגמה של הקלטת patch clamp של תא שלם.איור זה מציג תא שריר לב (cardiomyocyte) אטריאלי לדוגמה, שצבעו DPI ו-phin המשולב עם פלואורוכרום. וכאן מוצגים עקומות לדוגמה של רישום patch clamp של התא השלם. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בערך כשעה וחצי, במידה והיא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים תאי שריר לב אטריאליים וונטריקולריים מעכברים מהונדסים גנטית.

isolation-kv-channel-recordings-murine-atrial-ventricular

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים את בידודו של myocytes פרוזדורי אדם אשר יכול לשמש לתאיים...

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

ידע הנוכחי על הבסיס התאי של מחלות לב בעיקר מסתמך על מחקרים במודלים של בעלי חיים. כאן אנו מתארים ולאמת שיטה חדשה להשיג cardiomyocytes קיימא אחת מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית האנושי. myocytes חדרית האנושי יכול לשמש למחקרי אלקטרו ובדיקות סמים.

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

כאן, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד cardiomyocytes פרפור ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר. תקנה ידנית בלחץ intraluminal של חללים לב מיושם להניב המתאימים עירור-התכווצות-מצמד לימודי תקין מבחינה פונקציונלית נייטרלים.

בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר

הפרוטוקול הזה משמש כדי לבודד פרפור לב בודד מהלב של העכבר המבוגר באמצעות הגישה העיכול קטע. גישה זו משמשת כדי לבודד את הפרפור הימני או השמאלי, שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את פרפור מיציט אלקטרופיזיולוגיה במחקרים הדבקת מהדק.

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (&lt;50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

פרוטוקול זה מתאר שינויים בשיטת לנגנדורף כולל עומק שינון אבי העורקים לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרזדורים חדריים מעכברים בוגרים.

שינויים בשיטת לנגנדורף לבידוד סימולטני של מיוציטים מפרשים בוגרים

למדו לבודד קardiomyocytes פרוזדורים וחדרית מעכברים מהונדסים גנטית לצורך הקלטות patch clamp ומחקר אלקטרופיזיולוגי. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד ערוצי Kv ומנגנוני הפרעות קצב לבביות.

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

גלה סרטונים נוספים