In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

שינויים מולקולריים תלויים מנוסים בתאי עצב חיוניים ליכולת המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים. מתוארת כאן שיטת הדמיה של שני פוטונים in vivo המאפשרת מעקב אחר שינויים מולקולריים כאלה בתאי עצב בודדים בקליפת המוח באמצעות מדווחים מקודדים גנטית. אחד הגנים התלויים המנוסים המבוססים הוא חלבון או קשת הקשורים לפעילות ציטוסקלטלית.

השעתוק של ARC מושרה במהירות ובעוצמה על ידי פעילות עצבית מוגברת כדי לאפשר בחינה של ביטוי קשת בנוירונים חיים על ידי שתי מיקרוסקופיות צילום, אנו עושים שימוש בקו עכבר נוקין בו מדווח GFP ממוקם תחת שליטת מקדם הקשת האנדוגני. פרוטוקול זה מתאר את ההכנות הכירורגיות והליכי ההדמיה למעקב אחר דפוסי ביטוי GFP תלויים בקשת חווים בהרכבים עצביים בבעל חיים חי. ראשית, נתאר את הכנת בעלי החיים הדרושה לטכניקה זו.

חיית GFP קשת תעבור ניתוח חלון גולגולת ותתאושש מהניתוח למשך כשבועיים. לאחר מכן נבדקת איכות חלון הגולגולת ואם ניתן לדמות דרכו נוירונים, החיה ממוקמת בסביבה דומה עד לתחילת ניסויי הדמיה התנהגותיים ושני פוטונים. בעלי חיים אלה מצולמים שוב ושוב על ידי שני מיקרוסקופ צילום.

לאחר השלמת הפרדיגמות ההתנהגותיות הרצויות במהלך מספר ימים, יש לנקות את כל הכלים במעקר חרוזים חם. לפני ניתוח אספטי, יש לנקות את מקום הניתוח עם אתנול 70% ולהניח מטליות טיפות נקיות. להרדים את החיה עם תמיסת אברטון של 1.2% ניתנת ב-0.02 מיליליטר לגרם תוך-צפק.

בדוק את רמת ההרדמה באמצעות צביטות זנב או בוהן כדי להבטיח טשטוש מלא. יש לכסות את עיני החיה במשחת עיניים סטרילית ולהזריק דקסמתזון 0.2 מיליגרם לק"ג וקרפרופן חמישה מיליגרם לק"ג תת עורי. גלחו את השיער מעל הגולגולת בין האוזניים ועקרו את העור עם קרצוף בטדין ושלוש ספוגיות לסירוגין של 70% אתנול הרכיבו את החיה בשלב ניתוח סטריאוטקסי עם מוטות אוזניים עם כרית חימום לזרימת מים מתחת לבעל החיים המוגדר ל-37 מעלות.

בדקו באופן קבוע את רמות ההרדמה של בעל החיים והשלימו את מנת ההרדמה המקורית לפי הצורך. יש להזריק 200 מיקרוליטר של 0.5% מרקאין מתחת לעור הקרקפת כדי להקהות את האזור, לחתוך את העור ולהסיר את דש העור מעל הגולגולת. הסר את הפריאוסטאום וייבש את האזור בעזרת צמר גפן נקי.

השתמש במקדחה דנטלית במהירות גבוהה עם קוץ של 0.5 מילימטר כדי לשרטט בעדינות עיגול בקוטר של שלושה עד חמישה מילימטרים מעל אזור המוח המעניין בהתאם לצרכים שלך. הרטיבו מעת לעת את אתר הקידוח במי מלח סטריליים של 0.9% ונקו אבק עצמות בעזרת צמר גפן נקי. אם העצם מדממת, השתמש בקצף ג'ל ספוג מראש במי מלח סטריליים כדי למחוק את הדימום ולחכות שהוא ייפסק.

כאשר מגיעים לשכבת העצם האחרונה, הרם והסר את אי העצם בעזרת מלקחיים עדינים. אתה עלול להיתקל בחיבורים דוראליים למדף התחתון של העצם. אם החלון שלך חוצה תפר עצם, יש להסיר אותם בעדינות.

כאשר דש העצם מורם, גלגלו בעדינות קצף לחות וג'ל על הדורה החשופה כדי לנקות את פני השטח שלה והמתינו עד שהדימום הדוראלי ייפסק. אם אזור העניין שלך נמצא מתחת למיקום עם דורה עבה במיוחד, ייתכן שיהיה צורך להסיר את הדורה מעליו. אם זה המקרה, הפרד בעדינות את הדורה מה-PIA למטה בעזרת מלקחיים עדינים מאוד.

בצע חתך קטן בדורה המורמת עם זוג נוסף של מלקחיים עדינים. לאחר מכן תפסו את הקצוות החתוכים ופצלו בעדינות את הדורה. הדורה דקה אך חזקה, לכן היזהרו לא לחתוך את המוח עם הקצוות השלמים של הדורה.

כשאתה עובד אחורה והרחק מאזור העניין שלך, שטוף את האזור בנדיבות עם CSF סטרילי או מי מלח סטריליים. אם הגולגולת שמסביב מתעקלת באופן משמעותי סביב הדורה או הפיה החשופים, השתמש בדבק תאים מהיר כדי למלא חללים שלא יגרמו למגע קרוב עם החלקת מכסה החלון באזורים שלא יצולמו. לאחר מכן הניחו כיסוי זכוכית סטרילי החליקו בעדינות מעל הדורה או הפיה.

השתמש בג'ל אקרילי של סנו כדי לכסות את דבק האלסטומר ואת קצוות הזכוכית. תעודת כיסוי. מכסים את כל הגולגולת החשופה בג'ל סנו ציאנואקרילט או בדבק מטורף ותערובת צמנט דנטלית.

הטמע מוט קיבוע ראש מתכת בהתאמה אישית בקצה הנגדי של הגולגולת. החזר את החיה לתא התאוששות חם לאחר הזרקה תוך-צפקית של קטופרופן חמישה מיליגרם לק"ג לטיפול בכאב. המשיכו את משכך הכאבים במשך יומיים לאחר הניתוח.

לאחר שבועיים של התאוששות לאחר הניתוח, יש להרדים את בעל החיים עם ISO פלואור. 5% לזירוז, 1.5% לתחזוקה. הרכיבו אותו בבמת מיקרוסקופ בהתאמה אישית עם מסגרת קיבוע ראש ובדקו את חלון הגולגולת לבהירות אופטית.

תחת תאורה עם אור כחול משטח המוח בהירות כלי הדם מעידה מאוד על איכות חלון הגולגולת. אם הקצוות שלהם מוגדרים בחדות, סביר להניח שהחלון יהיה שמיש. לפני תחילת פרוטוקול התנהגותי, יש להחזיק את בעל החיים בסביבת כלוב ביתית עקבית כדי למזער את השונות היומיומית.

בקשת הבסיס, רמות ביטוי GFP מתחילות אימון התנהגותי או פרדיגמות גירוי סביבתי בהתאם לאזור המוח המעניין. לדוגמה, בעלי חיים יכולים להיחשף לסביבות חזותיות שונות במשך ימים רצופים כדי לדמות אוכלוסיות ייחודיות של נוירונים בקשת קליפת המוח הראייה, פלואורסצנטיות GFP בתאי עצב מגיעה בדרך כלל לרמת השיא שלה שעתיים לאחר הגירוי. ציר הזמן של הניסוי עשוי להיות אופטימלי כדי להקל על זיהוי ביטוי ARC GFP בתאי עצב ברמות השיא הקרינה שלהם.

לאחר השלמת אימון התנהגותי או גירוי סביבתי, יש להרדים את בעל החיים עם ISO פלואור 5% לאינדוקציה, 1.5% לתחזוקה. הרכיב את החיה בשלב המיקרוסקופ בהתאמה אישית עם מסגרת קיבוע ראש. תחת מיקרוסקופ שני הפוטונים, מיקום הראש של החיה מקובע למסגרת קיבוע הראש המתחברת ישירות לבמה באמצעות מוט המתכת המושתל על הגולגולת.

ISO פלואור וחמצן מסופקים באופן רציף לעכבר דרך חרוט אף. טמפרטורת הגוף נשמרת באמצעות כרית חימום. ודא שגלאי המיקרוסקופ מוגנים מפני אור הסביבה.

על ידי ביצוע סריקת לייזר שני פוטונים בחדר חשוך, השתמש בעדשת טבילה במים עם צמצם מספרי של 20 x או 25 x 1.05 להדמיה. ראשית, תחת תאורת אפי פלואורסצנטית, רכשו תמונה של דפוסי כלי הדם על פני השטח של אזור המוח המעניין באמצעות מצלמת CCD. ליישור תמונה עתידי, התחל סריקת לייזר של שני פוטונים כדי לרכוש ערימת תמונות תלת מימדית.

אורך גל העירור של שני לייזר הפוטונים מוגדר על 920 ננומטר וההספק מוגדר על כ-50. פלואורסצנציה הנפלטת מילי-וואט מזוהה בו זמנית בקשת תעלה ירוקה ואדומה. פלואורסצנטיות GFP מופיעה רק בערוץ הירוק, ואילו אוטופלואורסצנטיות של רקמות מופיעה בשני הערוצים.

לערימות תמונות טיפוסיות יש מידות של כ-320 על 300, 20 על 100 מיקרומטר, רזולוציה אופקית של 0.5 מיקרומטר לפיקסל ורזולוציה אנכית של שלושה מיקרומטר לפיקסל. לאחר רכישת ערימת התמונות, החזירו את החיה לכלוב הביתי שלה. אל תפריע לבעל החיים עד לפגישת ההתנהגות וההדמיה הבאה.

חזור על הליך ההתנהגות וההדמיה לאורך ימים כרצונך. השתמש בתמונת כלי הדם שנרכשה בעבר על פני המוח כדי להתמצא בחזרה לאותו מיקום הדמיה. כוחה של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בחינה של שינויים בביטוי גנים בקשת באותה קבוצת נוירונים במשך מספר ימים.

בבעל החיים החי. שיטות היסטוכימיות סטנדרטיות יכולות להשיג רזולוציה של תא בודד, אך אינן יכולות לעקוב אחר שינויים בביטוי גנים באותם נוירונים במשך מספר ימים. טכניקות הדמיה אחרות כגון תהודה מגנטית או שיטות הדמיה גרעיניות חסרות את הרזולוציה להדמיית נוירונים בודדים.

ככזה, אף שיטה קיימת אחרת למדידת שינויים בביטוי גנים אינה יכולה להתאים הן לרזולוציה המרחבית והן לכיסוי הזמני של שיטת ההדמיה המתוארת כאן. שלב קריטי בהליך זה הוא ניתוח חלון הגולגולת. יש לבצע אותו בזהירות יתרה כדי למנוע טראומה למוח או השארת דם מתחת לכיסוי הזכוכית.

ניתן להסיר את הדורה במידת הצורך. זכור כי עומק ההדמיה המרבי במוח באמצעות הליך זה יהיה תלוי בבהירות חלון הגולגולת, במערך המיקרוסקופ ובבהירות המדווחים הפלואורסצנטיים. פרוטוקול הדמיה in vivo זה הוא שיטה יעילה ורב-תכליתית להשגת מידע על דינמיקה מולקולרית הקשורה לנוירופלסטיות בתאי עצב בודדים בתגובה לחוויות התנהגותיות שונות, וסביר להניח שיהיה ישים באופן כללי לעכברים טרנסגניים הנושאים מדווחים פלואורסצנטיים עבור גנים מווסתים מנוסים אחרים.