Name: חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך דרוזופילה עובר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: חקור דינמיקה של חיסול תאים אפופטוטיים בעוברי Drosophila באמצעות הדמיה חיה. השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר התנהגות תאי פגוציטים ותאים אפופטוטיים במיקרוסקופיית קונפוקל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מארי קירי Reintegration גרנט (IRG249084). אנו מודים לכל חברי המעבדה Kurant.

כדי לעקוב אחר הדינמיקה של אישור אפופטוטיים תא in vivo שתי אוכלוסיות של תאים חייבים להיות מתויגים: תאי phagocytic ותאים אפופטוטיים. כדי לסמן אוכלוסיות תאי phagocytic אנו משתמשים שורת דרוזופילה המכילים את הסמן Simu-cytGFP, אשר תוויות תאים באופן בלעדי phagocytic בעובר: מקרופאגים, גליה והאאקטודרם 8. אפשר להשתמש בסמנים שונים לתאי phagocytic, כולל שורות המכילות נהג Gal4 hemocyte ספציפי (CRQ-Gal4) או גליה ספציפי Gal4 נהג (repo-Gal4) וכתב ניאון מקודד גנטי תחת שליטת כטב&quot;מ (כטב&quot;מ-GFP). כדי לפקח על תאים אפופטוטיים במהלך פינוי תאים אפופטוטיים אנו משתמשים אפופטוזיס שונה / סמני פאגוציטוזיס. Annexin V (בדיקות מולקולריות) משמש כסמן מוקדם לתאים אפופטוטיים 10; Phiphilux (OncoImmunin) הוא caspase-3 מצע fluorogenic, המשמש כapopto מאוחר יותראחותי סמן, וLysotracker (בדיקות מולקולריות) עובד כסמן phagosome. אנו מזריקים חומרים כימיים אלה באמצעות מערכת microinjection PicoPump PV 820. 1. מתכונן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק heptane: לפרוש קלטת דו צדדית ולשים עד כמה שאתה יכול בבקבוקון נצנץ, למלא עם heptane, לאטום את הבקבוקון עם Parafilm, וסלע במשך 24 שעות. הוסף heptane אם הדבק עבה מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו מאפשרים את הזבובים להניח על צלחת מחוממת מראש מיץ ענבים אגר + שמרים להדביק לשעה 2, ולאחר מכן להעביר את הצלחת עד 25 מעלות צלזיוס במשך 10-12 שעות (תלוי בשלב הרצוי) לפני ההקלטות לשגות microinjection וזמן של עוברים מוזרקים. אנו אוספים עוברים מהצלחות אגר נשמרו על 25 מעלות צלזיוס, ובכך לספק עובר מן השלב 15 או 16 של פיתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מחט: כדי להכין את המחטים להזרקה, אנו משתמשים בחולץ המחט &#39;מכשיר סאטר&#39; וסיבי זכוכית חומה דקים (צינור נימי FHC). הטיפ של נימים ונקווה שברהn לקוטר של 0.5-2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip עם דבק: באמצעות קצה פיפטה לפזר טיפת דבק heptane בשורה אחת באמצע של coverslip. לתת לו להתייבש במשך כמה שניות. הכן כמה coverslips אלה. </li></ol> 2. הכנת עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עובר מצלחות אגר ולהעבירם למסננת תא (מדעי החיים SPL) באמצעות מברשת צבע נקי ומים זורמים. המסננת מתקיימת מעל כוס כדי לאסוף מים לבזבז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף עובר במסננת התא באמצעות מים עד שכל עיסת השמרים מוסרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את עודפי מים על ידי ניגוב מחוץ למסננת באמצעות Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מסננת התא בצלחת פטרי נקי ולהוסיף מספיק אקונומיקה 50% כדי לכסות את העוברים במסננת התא. Dechorionate את העוברים במשך 2 דקות מדי פעם (2-3 פעמים) ערבובם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מים בהרחבה עד שעוברים רופפים ריח אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מסננת התא לנקיצלחת פטרי ולכסות את העוברים עם מים כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל הגדרת עוברים, טען μl 1 של המגיב הרצוי לשתי מחטים (לפעמים יכולה להיות סתומה מחט). זה לוקח בערך 5 דקות לנוזל להגיע לקצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חתיכה מלבנית של אגר מיץ ענבים ולמקם אותו בשקופית מיקרוסקופ. העברה עובר dechorionated מצלחת פטרי לפיסה אגר באמצעות מברשת צבע נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתיחה בחר כראוי מבוימת עוברים המבטאים את סמן GFP באמצעות מברשת צבע רטובה ומניח את כל עובר בסמוך לקצה של החתיכה אגר בשורה אחד אחרי השני (איור 1 א). העוברים צריכים להיות ממוקמים עם צד גחונם לphagocytosis הדמיה על ידי גליה במערכת העצבים המרכזית (CNS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקים כ -10 עוברים בשורה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצרף את העוברים לcoverslip מצופה באמצע עם רצועת דבק heptane (איור 1 ב, ג </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את coverslip בתא ההתייבשות לכ -5 דקות (זה תלוי בלחות של החדר ואת הסכום להיות מוזרקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייבוש עד לכסות את העוברים עם שמן halocarbon 700 (Sigma), כדי למנוע התייבשות נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את coverslip בשקופית מיקרוסקופ עם העוברים פונים כלפי מעלה. אתה יכול לשים טיפת מים על השקופיות כדי למנוע ההעברה של coverslip. הם עוברים עכשיו הוא מוכן להזרקה. מיקום הזרקה הוא בדרך כלל בצד לרוחב באמצעו של העובר. </li></ol> 3. הזרקת עובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המחט לmicromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשבור את קצה המחט לשים את קצה coverslip בשדה הראייה ולהתאים את המחט לאותו מישור המוקד. מאוד להעביר בזהירות את coverslip עד שהוא פוגע בקצה המחט ושובר אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התמקדות בעוברים, למקם את המחט לתוך השמן ולוודא שאתה מקבל טיפת נוזל מהמחט. זה אומר שקצה המחט כברנשבר גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלי לגעת בבעל המחט להזיז את העובר לתוך המחט ולהזריק טיפה לעובר. להזיז את העובר משם ולהמשיך לשלב הבא עד שכל העוברים מוזרקים. </li></ol> 4. הדמיה אנחנו תמונה את העוברים במיקרוסקופ confocal הפוך עם מטרת 40X או 100X. אנחנו מחפשים עובר ממוקם יפה עם מערכת העצבים המרכזית באמצע, מה שמראה ביטוי של GFP חזק ותיוג טוב של תאים אפופטוטיים לאחר הזרקה. להקלטות זמן לשגות של עוברי חיות אנחנו בדרך כלל לבחור 5 או 6 פרוסות confocal (2 מיקרומטר עבה כל אחד). לאחר מכן, אנו עושים השלכה של 3 פרוסות (עובי מיקרומטר 6) על מנת לבחון תאים שלמים. אנו משתמשים בסמנים לתאים אפופטוטיים שהם יציבים ולא להלבין בקלות. כדי להימנע מהלבנת GFP לבצע הקלטות במרווחים של 60 שניות. במקרים מסוימים עובר עשוי להתחיל להתגלגלבזמן הקלטת וידאו. לכן, אנחנו נסתכל פעם בכמה זמן בהקלטה על מנת לעצור ולהתחיל מחדש במידת צורך.

<ol><li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+to+die+for%3A+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm%2C+fly+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+signaling%3A+you+can+touch%2C+but+you+can%27t+eat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li>
<li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li>
<li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+CNS+clear%3A+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li>
<li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li>
<li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

אישור תאים אפופטוטיים הוא שלב אחרון קריטי של אפופטוזיס, שהוא מאוד דינמי. לכן לימודים בזמן אמת של התהליך הם בעלי חשיבות עליונה. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר ניטור של אישור תאים אפופטוטיים בחיים עובר תסיסנית מתפתחים. בהליך זה, שתי אוכלוסיות של תאים חייבים להיות מסומנות באמצעות סמנים ספציפיים: תאים וphagocytes אפופטוטיים. כתב Simu-cytGFP מתאים לניטור מקרופאגים phagocytic, גליה והאאקטודרם בו זמנית באותו העובר, W hich מאפשר לעקוב אחר אוכלוסיות תאי phagocyti...

החיסול התקין של תאים לא רצויים או חריגים באמצעות אפופטוזיס וphagocytosis הבא הוא קריטי להתפתחות עוברית, כמו גם לאיזון רקמות במבוגר. Phagocytosis של תאים אפופטוטיים או סילוק תאים אפופטוטיים הוא תהליך דינמי מאוד אשר ממשיך בארבעה שלבים: (1) גיוס של phagocytes לתאים אפופטוטיים (&quot;למצוא אותי&quot;), (2) הכרה בתא כיעד לphagocytosis ( &#39;אוכל אותי&#39;) ו (3) היבלעות, ואחריו (4) הבשלת phagosome והשפלה של החלקיקים אפופטוטיים 1-5. ישנם שני סוגים של phagocytes: מקרופגים &quot;מקצועיים&quot; ותאים דנדריטיים, ולא בשלה &quot;הלא מקצועי&quot; תאים שכנים רקמת תושבים, שהם חיוניים לשחרור מתאים אפופטוטיים במהלך מטזואניים פיתוח 6,7. בפיתוח דרוזופילה, חיסול התאים מיותרים באמצעות אפופטוזיס מתרחש בשלושה מ &#39;שלבים ראשון בעין, באמצע לעובר מאוחר, ואז באמצע שנתי הגולם, ושוב בבוגרים המוקדמים. במהלך embryogenesis חלקיקים אפופטוטיים יוסרו על ידי phagocytes &quot;מקצועי&quot;, מקרופאגים, ועל ידי האאקטודרם וגליה 8,9 &quot;לא מקצועיים&quot;. בעבודה הקודמת שלנו שזיהינו קולט phagocytic, שישה מיקרונים-תחת (Simu), אשר בא לידי ביטוי אך ורק בתאים phagocytic במהלך embryogenesis. באמצעות אמרגן Simu נוצר סמן ספציפי לאוכלוסיות תאי phagocytic (Simu-cytGFP) אשר מאפשרת לנו לעקוב אחר מקרופאגים, האאקטודרם וגליה במקביל בעובר חי 8 בפיתוח. בנוסף לכך, על ידי שימוש בסמנים ספציפיים לתאים אפופטוטיים בשלבים של אפופטוזיס שונים, אנו מסוגלים לעקוב אחר הדינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>מגיב </חזק></td></tr><tr><td>Annexin V </td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A35108</td><td></td></tr><tr><td>PhiPhiLux G2D2</td><td>OncoImmunin</td><td>A304R2G-5</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>שמן הלוקרביון 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">< צינורות נימיים חזקים></חזקים></td></tr> <tr><td></td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>SPL</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>מברשת</td><td></td><td></td><td></td> צבע</tr></tbody></table>

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

החיסול התקין של תאים לא רצויים או חריגים באמצעות אפופטוזיס וphagocytosis שלאחר מכן (אישור תאים אפופטוטיים) הוא חיוני להתפתחות תקינה בכל היצורים מטזואניים. אישור תאים אפופטוטיים הוא תהליך דינמי מאוד קשר אינטימי עם מוות של תאים, תאים אפופטוטיים unengulfed נראים בקושי in vivo בתנאים רגילים. על מנת להבין את השלבים של אישור תאים אפופטוטיים השונים ולהשוות phagocytes &quot;מקצועי&quot; - מקרופגים ותאים דנדריטיים ל&quot; הלא מקצועי &quot;- תאים שכנים רקמת התושב, בהדמיה לחיות vivo של התהליך הוא יקר מאוד. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללימוד אישור תאים אפופטוטיים בעוברים תסיסנית חיים. כדי לעקוב אחר הדינמיקה של שלבים שונים בphagocytosis אנו משתמשים סמנים ספציפיים לתאים וphagocytes אפופטוטיים. בנוסף, אנו יכולים לעקוב אחר שתי מערכות תא בלען במקביל: מקרופאגים &#39;מקצועיים&#39; ו &#39;חצי profeגליה &#39;ssional במערכת העצבים המרכזית בפיתוח (CNS). השיטה המתוארת כאן מעסיקה את עובר דרוזופילה כמודל מצוין ללימודים בזמן אמת של פינוי תאים אפופטוטיים.

מסגרות נציג מסרט שבו תאים אפופטוטיים מסומנים עם Annexin V, וגליה, האאקטודרם ומקרופאגים מסומנים עם Simu-cytGFP מוצגות באיור 2. כל מסגרת היא השלכה של 3 פרוסות 2 מיקרומטר כל אחד. העובר של שלב 15 ממוקם כראוי מראה את מערכת עצבים העובריים באמצע עם גליה שכותרתו היטב (ז). המקרופאגים (מ &#39;), שהם בעיקר מחוץ למערכת העצבים המרכזית, מראים ביטוי של GFP cytoplasmic חזק. תאי ectodermal גם מסומנים עם ...

כאן אנו מתארים שיטה יעילה ללימוד דינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים<em&gt; In vivo</em&gt;. שיטה זו מעסיקה לחיות<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר כמודל רב עוצמה לphagocytosis הניטור של תאים אפופטוטיים באמצעות תיוג ספציפי של תאים וphagocytes אפופטוטיים.

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לעקוב אחר הדינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים בעובר הדרוזופילה. דבר זה מושג באמצעות זבובים טרנסגניים המכילים סמן GFP ציטופלזמי, המסמן אוכלוסיות של תאים פגוציטיים. עוברים עם סמן Simio GFP נאספים, נשטפים ומצופים. לאחר מכן, העוברים ממוקמים להזרקה, ולאחריה ניטור של ה-CNS.השלב השלישי הוא סימון של תאים אפופטוטיים על ידי הזרקת סמני פגוציטוזה של אפופטוזיס ספציפיים לעוברים, כגון X in five; השלב הסופי הוא ביצוע הקלטות time-lapse של מערכת העצבים המרכזית (CNS) העוברית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות את המיקום וההתנהגות של תאים אפופטוטיים ופגוציטים במהלך שלבים שונים של פינוי תאים אפופטוטיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אימונוהיסטוכימיה בעוברים מקובעים, הוא היכולת לעקוב אחר הדינמיקה של פינוי תאים אפופטוטיים.פינוי תאים אפופטוטיים הוא תהליך דינמי מאוד הכולל שלבים מגוונים. טכניקה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר השלבים השונים באמצעות סמנים ספציפיים לתאים אפופטוטיים ולפגוציטים. הפרוטוקול מתחיל בהכנת דבק מחומרים קונבנציונליים: פתחו סרט דביק דו-צדדי, ולאחר מכן גלגלו אותו בחזרה כדי שיתאים לבקבוק סינטילציה.מלאו את הבקבוק בהפטן ואטמו אותו עם param. לאחר מכן, חברו את הבקבוק ל-nut tater ונערנו אותו בעדינות למשך 24 שעות. בטמפרטורת החדר, למחרת, העבירו את הדבק שהוכן לבקבוק חדש.השתמש בפיפטת זכוכית כדי להעביר את הדבק שהוכן לבקבוקון חדש. לאחר ההכנה, השתמש בקצה פיפטה כדי למרוח את הדבק על זכוכיות כיסוי. פזר טיפה של דבק heptane בקו לאורך מרכז זכוכית הכיסוי.המתינו מספר שניות לייבוש הדבק. ניתן לאחסן את כיסויי ההחלקה בטמפרטורת החדר בתוך קופסה סגורה למשך עד חודש לאחר הרדמת הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני. רכזו כ-400 זבובים במיכל איסוף עם פלטת הטלה של מיץ ענבים מחוממת שהושרה ב-25 degrees Celsius למשך שעתיים. אספו את פלטת ההטלה של מיץ הענבים וכסו את המיכל בפלטה חדשה כדי לשמור על תנאים נוחים לזבובים.הצלחת האיסוף מכילה עוברים בני אפס עד שעתיים. החזירו את צלחת ההטלה עם מיץ הענבים והעוברים לאנקובטור בטמפרטורה של 25 degrees Celsius עד שיגיעו לנקודת הזמן הרצויה בהתפתחותם. בדוגמה זו, העוברים מדגירים בין 10 ל-12 שעות, כך שהם מגיעים לשלב 15 או 16 לאחר התפתחותם.השתמשו במי ברז ובמכחול נקי כדי להעביר את העוברים מהצלחת למסננת תאים. החזיקו את המסננת מעל מכל, כך שניתן יהיה לאסוף עוברים שעלולים להישפך. שטפו את העוברים שנאספו עד להסרה מלאה של משחת השמרים.לאחר מכן, ייבשו את עודפי המים על ידי ניגוב החלק החיצוני של המסננת. הניחו את מסננת התאים בתוך צלחת פטרי נקייה כדי להסיר את הדפנה (corion). הוסיפו 50% bleach עד לכיסוי העוברים במסננת התאים והמתינו שתי דקות, תוך ערבוב שלהם שתיים עד שלוש פעמים.בשלב הבא, שטפו את העוברים עד שלא יריחו יותר במלבן. העבירו את העוברים ממיכל התאים אל צלחת פטרי נקייה וכסו אותם במים כדי למנוע מהם להתייבש. לצורך הזרקת העוברים.הכינו מראש מחטי הזרקה באמצעות מושך מחטים (needle puller) וסיבי זכוכית בעלי דפנות דקות. טענו 1 µL מהריאגנט הרצוי לשתי מחטים, כאשר מחט אחת תשמש כגיבוי. סמן יציב שאינו דוהה בקלות, כגון X in five, מהווה ריאגנט מתאים.כעת הניחו פיסה מלבנית של אגר מיץ ענבים על מיקרוסקופ. החליקו והעבירו את העוברים מהמסננת אל האגר. באמצעות מברשת צבע נקייה תחת מיקרוסקופ דיסקציה פלואורסצנטי, בחרו עוברים בשלב התפתחותי מתאים להזרקה באמצעות סמן GFP.בעזרת מכחול רטוב, העבירו את העוברים שנבחרו לשורה של 10, כאשר הצד הוונטרלי שלהם פונה כלפי מעלה. מקמו את השורה בקצה של בלוק האגרו. ניתן לראות GFP במערכת העצבים המרכזית של העובר.כעת הצמידו את העוברים לזכוכית כיסוי באמצעות רצועה של דבק heptane. מיקומם הנכון של העוברים חשוב מאוד להצלחת ההזרקה. הקדישו לכך את הזמן הדרוש וודאו שהעוברים מסודרים בדיוק באוריינטציה המתאימה.בשלב הבא, הניחו את לביש 유리 (cover slip) בתא הייבוש למשך כחמש דקות. לאחר ייבוש העוברים, כסו אותם בשמן פחמן Hello carbon oil 700 כדי למנוע התייבשות נוספת. לבסוף, הניחו טיפת מים על זכוכית כיסוי של מיקרוסקופ.לאחר מכן, הניחו את שפת המכסה כאשר העוברים פונים כלפי מעלה על גבי זכוכית מיקרוסקופ רטובה. העוברים מוכנים כעת להזרקה. התחילו בחיבור מחט למיקרו-מניפולטור ולפיקו-פומפ.המשאבה שולטת בכמות הנוזל המוזרק על ידי דחיפת חנקן לתוך המחט. דוושה שולטת על הפליטה המבוקרת של החנקן תחת המיקרוסקופ. התמקדו בקצה המחט ומקמו אותו בקרבת קצה זכוכית הכיסוי, תוך התמקדות זהירה מאוד בקצה המחט ובזכוכית הכיסוי.הזז את לוחית הכיסוי עד שהיא תפגע בקצה המחט ותשבור אותו. קוטר הפתח צריך להיות בין חצי לשני מיקרומטרים. כעת התמקד בעוברים.הכניסו את המחט אל השמן. אם קצה המחט נשבר כראוי, צריכה להיות טיפת נוזל שדולפת אל השמן. כאשר לוחצים על הדוושה מבלי לגעת במחזיק המחט, הזיזו את הבמה כך שהדופן הצדית של העובר תיחדר על ידי המחט.הזריקו במהירות טיפה של תמיסה אל תוך העובר. הסיטו את העובר והמשיכו לעובר הבא עד שכל 10 העוברים יזריקו. דמיינו את העוברים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם עדשה של 40 x או 100 x.חפשו עובר הממוקם היטב עם ה-CNS במרכז, המראה ביטוי חזק של GFP וסימון של תאים אפופטוטיים. כדי לבצע הקלטות time-lapse, בחרו חמישה או שישה חתכי קונפוקאליים לקיבוע באמצעות micron stick במיקומים אלו. בצעו סריקה בכל 60 שניות, מרווח שבו הלבנת GFP לא אמורה להוות בעיה.לאחר מכן, בצעו השלכה של שלושה פרוסות בעובי 6 מיקרון כדי לצפות בתאים השלמים. במקרים מסוימים, עשוי להתחיל עובר להתגלגל במהלך זמן הקלטת הווידאו. לכן, עקבו אחר ההקלטה כדי שלא יבוזבז זמן על עוברים נעים.עוברי שלב 15 הממוקמים כראוי מראים את ה-CNS העוברי במרכז עם גליות המסומנות היטב על ידי g, ומקרופאגים M, הנמצאים לרוב מחוץ ל-CNS המוצג. ביטוי GFP ציטופלזמי חזק. תאי אקטודרמה E מסומנים גם הם ב-GFP ציטופלזמי.תמונות אלו מציגות תאים אפופטוטיים המסומנים ב-ex in five ואקטודרמה ומקרופגים המסומנים ב-cite GFP. כל פריים הוא היטל של שלושה שכבות, כאשר כל שכבה בעובי של two microns. תאים רבים חיוביים ל-an ex in five נמצאים בתוך ומחוץ למערכת העצבים המרכזית (CNS).האירוע המסוגר בריבוע מראה תא גליאלי הבולע חלקיק אפופטוטי. שימו לב להתנהגות הבדיקה של התא הגליאלי. הוא נוגע בחלקיק האפופטוטי מספר פעמים לפני שהוא ניגש לבליעת התא האפופטוטי לאחר התפתחותו.הטכניקה סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום פינוי תאים אפופטוטיים לבחון פגוציטוזה של תאים אפופטוטיים במהלך ההתפתחות. באמצעות טכניקה זו, נוכל לבחון את ההתנהגות הדינמית מאוד של פינוי תאים אפופטוטיים.

live-imaging-apoptotic-cell-clearance-during-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

סרטון זה מדגים טכניקת צביעה חיסונית כדי לדמיין בליעת תאים אפופטוטיים בתאים עובריים הומוגניים של Drosophila melanogaster. שיטה זו מספקת תובנות לגבי הפיזיולוגיה התאית על ידי קביעת מידת הבליעה של תאים אפופטוטיים.

בדיקת פגוציטוזיס: טכניקה של צביעה חיסונית כדי לדמיין בליעת תאים אפופטוטיים בתאים עובריים של Drosophila melanogaster

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

פרוטוקול זה מפרט שיטה יעילה המשמשת לביצוע הדמיה תא חי בהקשר של מוח זחל בשלמותה. גישות הדמיה תא חי הן לא יסולא בפז לחקר חלוקות תא גזע עצביים סימטריות כמו גם תהליכים עצביים והתפתחותיות אחרים, לחשוף באופן עקבי מנגנונים שהתעלמו בעבר.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

כדי לזהות תאים בריאים בחיות כולה המכילות רמות נמוכות של פעילות caspase, את biosensor הרגישות הגבוהה המיועד CaspaseTracker נוצרה עבור תסיסנית. Caspase-תלוי בפעילות biosensor מזוהית בתאים בריאים האריך ימים ברחבי האיברים הפנימיים של בעלי חיים בוגרים שגדלו בתנאים אופטימיזציה בהיעדר גירויי מוות.

In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

אנו כאן לתאר assay phagocytosis באמצעות תאים עובריים מפוזרים של תסיסנית . זה מאפשר לנו בקלות ובמדויק לכמת רמות phagocytosis vivo , וכדי לזהות מולקולות חדשות הנדרשות phagocytosis של תאים אפופטוטיים.

Assay Phagocytosis עבור תאים אפופטוטיים ב תסיסנית עוברים

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.

הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

חקור דינמיקה של חיסול תאים אפופטוטיים בעוברי Drosophila באמצעות הדמיה חיה. השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר התנהגות תאי פגוציטים ותאים אפופטוטיים במיקרוסקופיית קונפוקל.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך

גלה סרטונים נוספים