פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר קומפלקסים של חלבונים על ידי שימוש במערכת תאי החרקים של נגיף הבאולה הרב-גב. זה מושג על ידי יצירת המבנה הרב-גני הראשון, המקודד את קומפלקס החלבון הנבחר. השלב השני הוא ליצור נגיף באולה מרוכב המכיל את המבנה הרב-גנים על ידי שינוי תאי חיידקים וסינון לאמצע האחורי הנכון.

לאחר מכן, בודדו את הגנום הנגיפי של הבאולה והשתמשו בו כדי להדביק תאי חרקים בקנה מידה קטן בצלחת של שש בארות לאחר בדיקת ייצור חלבון. קומפלקס החלבון הנבחר מתבטא בקנה מידה גדול יותר ומטוהר. בסופו של דבר, קומפלקס החלבון המטוהר משמש לגילוי המבנה והתפקוד שלו ופוטנציאל לגילוי תרופות.

היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני מערכות אקו-וירוס קיימות הם כפולים. ניתן לייצר את מתחמי MultiPro ללא תקדים. כמו כן, החומר המיוצר הוא באיכות גבוהה בהרבה מכיוון שאנו מהנדסים את האקו-וירוס לייצור חלבון אופטימלי.

ההשלכות של טכניקה זו חורגות הרבה מעבר לשאלות ביולוגיות בסיסיות. פלטפורמת השקיות המרובות שלנו שימשה בהצלחה לייצור חלבונים המבטיחים מועמדים חדשים לחיסונים למגוון מחלות ולזרז את חקר הסרטן על ידי ייצור מכלולי חלבונים מרכזיים הגורמים לצמיחת גידולים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מעט עם התהליכים והצורך בסטריליות.

לכן עבדנו קשה מאוד כדי לקבוע נהלי הפעלה סטנדרטיים כדי להפוך את היישום של ריבוי בנקים לקל ככל האפשר עבור משתמשים שאינם מומחים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהשלבים הרובוטיים מובנים הרבה יותר בקלות כאשר התהליך מוצג בתנועה. אתה לא יכול לחלץ את זה רק על ידי התבוננות בפרוטוקולים שנכתבים לא משנה כמה מפורטים.

לפני תחילת הליך זה, חשוב לתכנן בקפידה את אסטרטגיית הביטוי המשותף. מומלץ לבצע תחילה הדמיה של הניסוי. בסיליקו.

יש להפיץ גנים על הפלסמידים המקבלים והתורמים. מה שעובד הכי טוב הוא לקבץ יחד תת-יחידות שעשויות ליצור תת-מודולים פיזיולוגיים. מכיוון שלקומפלקסים גדולים יש תת-יחידות חלבון רבות, גנים רבים צריכים להתבטא בו זמנית.

מערכת הרב-גב מפשטת מאוד את שיבוט הגנים על ידי שימוש בשגרות אוטומטיות כדי למקם גנים במולקולות אב DNA קטנות המכילות רצף DNA קצר הנקרא locks P המזוהה על ידי האנזים Cree recombinase. אבות אלה משולבים לאחר מכן בתגובה חד-שלבית על ידי הוספת פרה-רקומבינאז, המשרשרת את כל מה שיש לו אתר לוקס P לפלסמיד DNA אחד גדול. מבנה רב-גנים זה מוכנס לאחר מכן לגנום של נגיף הבולה הרב-אחורי.

אם יש ליצור מספר רב של מבנים, מומלץ להשתמש בסקריפטים רובוטיים ובתחנת עבודה לטיפול בנוזלים. עמדת העבודה מצוידת בשואב אבק להכנות מיני וניקוי PCR, EEL לטעינה אוטומטית של דגימות PCR. תרמו-סייקלר ל-PCR ודגירה מדרגן שייקר להחייאת תאים ובלוקים קרים.

עבור אנזימים, גנים מעניינים מוחדרים לתורמים ומקבלים נבחרים על ידי שימוש באנזימי הגבלה וליגאז או לחילופין, על ידי שימוש בשיטות בלתי תלויות בקשירה מאמתים את כל מבני התורם והמקבל, משובטים על ידי מיפוי הגבלה וריצוף. המשך בשילובי מקבלי תורמים מפוזרים על ידי רקומבינציה של CRE LAX P כדי ליצור את מבני הביטוי הרב-גנים הנבחרים. המבנים מרובי הגנים המורכבים מאומתים על ידי תגובות PCR אנליטיות עם סטים של פריימרים שתוכננו במיוחד.

תמונות של תהליך ה-TR בסיוע רובוט מוצגות כאן. הם כוללים הכנת תגובות PCR בצלחות מרובות בארות, אספקת תבנית DNA ופריימרים, הגברת PCR של DNA והכנת מבנים מרובי גנים הגדלים בתרבית חיידקים על ידי ליזה אלקליין בצלחות מרובות בארות. כדי להתחיל בהליך זה, שלב וקטורים של העברת גנים מרובים בגנום הנגיפי הרב-בולה על ידי הפיכה לתאי DH 10, המכילים את הגנום הנגיפי ואת הפונקציות הנדרשות לטרנספוזיציה של TN 7.

לאחר TN, שבעה תאי טרנספוזיציה עם נגיף בולה מרוכב המכילים את הגנים המעניינים נבחרים על ידי סינון לבן כחול, TN שבע טרנספוזיציה מוצלחת גורמת לאובדן השלמת אלפא של הבטא גלקטו. לכן מושבות עם טרנספוזיציה נכונה של TN 7 נשארות לבנות על APLs סלקטיביים המכילים xal. הכן תרביות חיידקים מהמושבות הלבנות ובודד את הגב על ידי ליזה אלקליין ומשקעי איזופרופנול אתנול.

לאחר מכן תאי חרקים טרנספקטים עם הגנום הנגיפי המטוהר של bao הפועלים במכסה מנוע סטרילי של תאי חרקים שלב לוג SF 21 בצלחת תרבית רקמות של שש בארות. לכל אחד מהם, הוסיפו היטב את הגנום הנגיפי המטוהר של באו ומגיב טרנספקציה מעורבב במצע תרבית. דגרו על התאים שעברו טרנספטקט בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס ללא תנועה למשך 48 עד 60 שעות.

לאחר 48 עד 60 שעות, קצרו את הנגיף הראשוני או V zero על ידי הסרת המדיה מתחדשים במדיה טרייה והחזירו את הצלחת לחממה יומיים-שלושה לאחר מכן, בדקו את ייצור החלבון. ואם קיים סמן YFP, בדוק אם יש פלואורסצנטיות להגברת הנגיף. השתמש ב-V zero, הנגיף הראשוני, כדי להדביק 25 עד 50 מיליליטר של תאים בשלב לוג בצלוחיות שייקר ארלנמאייר קטנות הנסערות על פלטפורמה מסלולית.

שייקר סופר את התאים ומפצל את התאים כל 24 שעות עד שהם מפסיקים להכפיל את עצמם. עקוב אחר ריבוי נמוך של זיהום או משטר MOI, התאים חייבים להכפיל את עצמם לפחות פעם אחת, אחרת חזור על הניסוי עם נפח קטן יותר של V אפס. התמונה משמאל מציגה תאי חרקים לא נגועים בעקבות זיהום בנגיף הבאולה הרב-גבי.

תאי חרקים נגועים הפסיקו להתרבות וגדלו בגודלם, כפי שמומחש בתמונה מימין. לאחר 48 עד 60 שעות, קצור נגיף V אחד על ידי כדורי תאים. הסר ואחסן את המדיה המכילה את הווירוס.

Resus תולה תאים עם מדיה טרייה ומעביר אותם בחזרה לבקבוק ארלנמאייר. הסר פעם אחת 10 לששת התאים כל 12 או 24 שעות על ידי גלולה ובדוק את ייצור החלבון ואות חלבון הסמן אם רוצים נפחי ביטוי גדולים יותר. הגבירו את הנגיף עוד יותר על ידי הדבקה של עד 400 מיליליטר תאים בצלוחיות שייקר של שני ליטר בנגיף V one.

בעקבות משטר ה-MOI הנמוך, אנו ממליצים בחום לאחסן את נגיף ה-V one כנגיף הייצור על ידי שימוש בתאי חרקים נגועים בנגיף האולרי או בשיטות VIC כדי למנוע שינויים בנגיף הרקומביננטי ולשמר רמות ביטוי גבוהות. 24 שעות לאחר התפשטות נצפה מעצר תאים נגועים בגלולה. בשלב זה, התאים מכילים חלקיקים נגיפיים שלמים רגע לפני שהם משתחררים לתקשורת.

הסר מדיה, השהה מחדש את כדור התא בתמיסת הקפאה ובצע הקפאה של BIIC בצינורות קריו לריצות ייצור חלבון. השתמש ב-V אחד, V, שניים או ב-BIC קפוא כדי להדביק תרביות תאים גדולות יותר. בדרך כלל 400 מיליליטר בצלוחיות של שני ליטר דבקים במשטר ה-MOI הנמוך.

התאמת נפח הנגיף המשמש להדבקה כך שהתרבית הנגועה תכפיל את עצמה לפחות פעם אחת. אם קיים חלבון סמן YFP, משוך אחת פעמים 10 לששת התאים במרווחים מוגדרים, סוניקאט וצנטריפוגה את התאים והעביר לצלחת 96 באר למדוד רמות YFP בקורא צלחות סטנדרטי של 96 בארות המסוגל להקליט אותות פלואורסצנטיים לעקוב אחר התפתחות אות ה-YFP עד להגעה לרמה, מצביע על ייצור מקסימלי של חלבון רקומביננטי. קצירת תאים בשלב זה, אחסון כדורי תאים במינוס 20 מעלות צלזיוס לטווח הקצר או מינוס 80 מעלות צלזיוס לטווח הארוך יש להניח את התאים בשיטה המותאמת לדרישות החלבון ולאחר מכן את הציטוזול והגרעינים.

חלבונים גרעיניים מפוצלים נמצאים בדרך כלל בגלולה הגרעינית. בעוד שחלבונים ציטוזוליים נשארים בציטוזול. טיהור החלבון מפושט מאוד על ידי פיצול.

מכיוון שניתן להסיר הרבה מזהמים בשלב צנטריפוגה יחיד. ניתן לטהר בנוחות קומפלקסים של חלבונים מתרביות תאים ראשוניות בקנה מידה קטן על ידי שימוש בשיטות טיהור ממוזערות כגון טיהור מבוסס בארות מרובות או מיקרו קצה. בשילוב עם מערכות כרומטוגרפיה בנפח קטן כגון ACTA micro, צעד עתידי יהיה למזער ולשלב את כל מערך הניסוי ליישום שולחני קטן המתממשק עם תחנת העבודה לשיבוט.

מוצג כאן רובוט האצווה בקנה מידה מיקרו הנמצא כעת בפיתוח, שישמש למטרה זו. ביטוי משותף חזק של חלבונים הטרולוגיים מושג על ידי מערכת הרב-גב כפי שמוצג כאן. ניתן להבחין בבירור באיסורי החלבון המופרזים בתמצית התא השלמה, WCE והליזאט הנקי.

Sn.האיכות והכמות של חומר החלבון המיוצר מספיקים לעתים קרובות. אפשר קביעה מובנית של קומפלקסים חלבונים כגון MCC קומפלקס מחסום מיטוטי המוצג בתרשים זה. לעתים קרובות התשואה של ריצות טיהור אנליטיות אלה מספיקה לניתוח המבנה והתפקוד של הקומפלקס המטוהר במגוון אמצעים, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים.

נהלי ההפעלה הסטנדרטיים שפיתחנו מאפשרים למשתמשים שאינם מומחים ליישם את הגישה שלנו בקלות וניתן להשתמש בטכנולוגיה שלנו במעבדות רבות המעוניינות בקומפלקסים גדולים של חלבונים, בדומה למצב כיום עבור חלבון קטן בניקולה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בשקיות מרובות על מנת לייצר את קומפלקסי החלבון המעניינים שלך בכמות ובאיכות ללא תחרות למטרות המחקר השאפתניות שלך. העבודה עם המערכות שלנו אינה דורשת תנאי בטיחות מיוחדים.

עם זאת, זכור שהנגיף ידביק אותך אם אתה מרושל, למרות שהוא לא ישתכפל בתאים שלך. לכן, טיפול זהיר במצבי הסטרואידים שלך הוא חובה בעת ביצוע הליך זה. השיטה שלנו הפכה פופולרית למדי כבר יותר מ-600 מעבדות ברחבי העולם.

השתמש בטכניקה שלנו. אנו מאמינים כי בעתיד, השיטה שלנו תהפוך לחלק בלתי נפרד ממאמצי גנומיקה מבנית בקנה מידה גדול המתייחסים לאזור המורכב האנושי. זה עשוי לעזור לחשוף את הבסיס למחלות ובטווח הארוך להוביל לתרופות וטיפולים חדשים וטובים יותר.