Name: ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: למדו לייצר חלבון RBP איכותי מפלזמה לניטור בזמן אמת של תעבורת רטינול דרך הקולטן STRA6. הפרוטוקול כולל ביטוי בחיידקים, קיפול מחדש עם רטינול וניקוי HPLC לחקר מנגנוני ויטמין A בתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות המענק R01EY018144.

1. ייצור, מקפלים, וטיהור HPLC של הולו-RBP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את BL-21cells עם וקטור pET3a מחסה cDNA לRBP האנושי עם 6x התג שלו על N-הסופי. לגדל את BL-21 התאים הפכו בייקר על 37 מעלות צלזיוס בתקשורת 40 מ&quot;ל LB עם carbenicillin עד OD ב 600 ננומטר מגיע 0.5. לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת RBP IPTG ל1mm. לגדל את החיידקים על 37 מעלות צלזיוס עוד 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RBP מיוצר בE.coli הוא בעיקר נוכח בגופי הכללה מסיסות. כדי להעשיר את גופי הכללה, תאי גלולה ב -10,000 XG במשך 20 דקות. אז sonicate את התאים על קרח ב5 המ&quot;ל PBS עם מעכבי פרוטאז, ואחרי 2 מחזורים של הקפאה והפשרה. גלולים במורד גופי ההכללה ב20000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. הסרת supernatant ולשמור על הקמצוץ על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize הכללת גוף הגלולה ידי sonication ב10 הידרוכלוריד מ&quot;ל 7.5 M guanidine. הוסף נפח 1/2 (5 מ&quot;ל) של 25 מ&quot;מ טריס חיץ, pH 9.0 וDTT לג סופיoncentration של 10 מ&quot;מ. מערבב נמרצות פתרון במיקסר מערבולת לילה בטמפרטורת חדר כדי להפחית באופן מלא ולפגל חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חלבון הפתרון להסיר חומר מסיס ב18000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. אחרי הספין, להעביר את supernatant לצינור חדש ולמקם את הצינור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ארבעה כרכים (60 מ&quot;ל) של חיץ refolding (25 mM טריס, pH 9.0, 0.3 mM ציסטין, ציסטאין mM 3.0, 1 mM EDTA). דגת חיץ refolding. גם להכין רטינול mM 600 μl 10 באתנול באור אדום עמום. שמור את זה בחושך על קרח. שניהם חיץ refolding ופתרון רטינול צריכים להיות טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרר גם פתרון החלבון וחיץ refolding על קרח במשך לפחות 30 דקות. טמפרטורה גבוהה יותר סבירה מפחיתה את האיכות קפלה מחדש RBP. הוסף פתרון 10 μl רטינול בתורו תוך פתרון חלבון מעורב נמרץ בכוס בקרח dropwise 1 מיליליטר חיץ וקפל שוב. חזור על פעולה זו עד שכל חיץ refolding ורטינולהם הוסיפו. ממשיך לערבב תגובה על קרח בחושך במשך 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה תגובת refolding ב24000 XG למשך 30 דקות ב 4 ° C. זה חיוני כדי להסיר אגרגטים מייד אחרי תגובת refolding. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז פתרון supernatant באמצעות 15 concentrator Ultra Amicon (MWCO 10 יא) לכ 10 מ&quot;ל. אל תתרכז פתרון קפל מחדש יותר מרמה זו. להתרכז יותר מדי יביא לצבירת חלבון ומוריד את התפוקה ואיכות הסופית של RBP המקופל בצורה נכונה. לדלל את הדגימה המרוכזת עם הקור PBS עד 100 מ&quot;ל. מטרת שלב זה היא כדי להסיר את הרכיבים בתגובת refolding שמפריע לטיהור ניקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הפתרון עוד פעם אחת ב24000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. חשוב להסיר כל משקע. העברת supernatant לשני צינורות 50 מ&quot;ל, כל 1 מ&quot;ל מכיל slurry Ni-נ.ת. ע שנשטף עם PBS. סובב את הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. דוגרי f תמיסה המדוללתאו 1 שעה יכולה לגרום למשקעים של חלבוני misfolded שצריך להסירו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה את הצינורות ב 500 XG ל3 דקות. הסרת supernatant בזהירות. צף דבר יש להסיר. הוסף הקר PBS עד 30 מ&quot;ל לכל צינור. ספין שוב להסיר את supernatant. חזור על תהליך זה עד שאתה לא רואה שום דבר, אלא חרוזים בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שרף Ni-נ.ת. ע לעמודה ריקה. שטוף את השרף עם 20 כרכי עמודה של 10 מ&quot;מימ imidazole, 500 המ&quot;מ NaCl ב PBS. Elute-RBP ב 5 כרכי טור של 100 המ&quot;מימ imidazole ב PBS. אל תאחסנו את הפתרון הזה לתקופה ממושכת של זמן, והקפאה מפחיתה את התפוקה ואיכות הסופית. לתוצאה הטובה ביותר, לטהר RBP על ידי HPLC באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיאליזה-RBP מטוהר משרף Ni-נ.ת. ע נגד 25 המ&quot;מ טריס, 8.4 pH, וmM NaCl 120. Concentrator יכול לשמש גם להחלפת בולם. דוגמאות ברורות לHPLC ידי צנטריפוגה XG ב 16000 עבור 10 דקות ב 4 ° C ממש לפני כל ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר הולוגרמות RBP על HPLC באמצעות יוניםחילופי העמודה AX-300 על ידי שיפוע צעד NaCl (220 מ&quot;מ 12 דקות, 15 דקות 360 מ&quot;מ, ו1000 mM 15 דקות) באמצעות 25 מ&quot;מ טריס, pH 8.4 כשלב נייד ב1 מ&quot;ל / דקה. ככל שעולה בריכוז NaCl, הולוגרמות-RBP הוא שוחרר תוך apo-RBP וmisfolded RBP להישאר מחויב לעמודה (איור 1). אם refolding RBP לא נעשה בצורה אופטימלית, misfolded RBP (למשל misfolded RBP-אני באיור 1) יכול לשלוט כל ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזר המקופל כראוי הולוגרמות RBP מהשברים בשיא 360 המ&quot;מ NaCl. זהירות לפקח על פרופיל elution של שלב בצורה נכונה וmisfolded-RBP. ב1000 mM NaCl, רובו misfolded-RBP יש לשחררו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברים המכילים הולוגרמות RBP הם נקווים, מרוכזים, ודיאליזה נגד PBS הלילה ב 4 ° C. בדקו את התשואה סופית ואיכות (330 nm/280 ננומטר) על ידי ספקטרופוטומטר. מוצר מקופל בצורה נכונה צריך להיות יחס של 330 ננומטר nm/280 מעט גבוה יותר מאשר 1 (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לproducדואר apo-RBP, מוסיף נפח שווה של heptane למטוהרי הולוגרמות RBP ומערבב בעדינות על ידי החלפה בין הלילה ב 4 ° C. צנטריפוגה ב16,000 גרמו עבור 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את השלב המימי התחתון בזהירות לצינור חדש (הימנעות המשקע בממשק). חזור על התהליך שלוש פעמים בדגירת 3 שעות לכל אחד. בדקו קליטה בספקטרופוטומטר Nanodrop לוודא שיא ננומטר 330 ירד לרמת הרקע. </li></ol> 2. ניטור בזמן אמת של STRA6-קטליזאטור רטינול השחרור וטוען רטינול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום Microfluor-2 לוח שחור 96-היטב (Thermo Scientific) עם 200 μl של החוסם קזאין (פירס) לילה ב 4 ° C כדי למנוע הידבקות ספציפית של הולוגרמות RBP לפלסטיק. החוסם קזאין נותן אפקט החסימה הטובה ביותר של כל פתרוני החסימה שבדקנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרומים טריים מתאים לבטא STRA6 או תאי בקרה נשטפים באמצעות PBS ועברו המילטון מזרק (Gastight # 1710) 6 פעמים כדי לייצר השעיה אחידה בPBS. אנחנו בדרך כלל להשתמש בקרומים הנגזרים מ1 / 100 עד 1/20 מתאים שגודלו בצלחת 100 מ&quot;מ לתגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות המצופות של צלחת Microfluor-2 פעם עם 200 μl של PBS. לקרר את הצלחת על קרח לפני תוספת של השעית קרום (50 μl לטוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניטור בזמן אמת של רטינול פלואורסצנטי נמדד באמצעות אופטיקה קרינה של POLARstar האומגה (BMG Labtech) עם 320ex מסנן העירור ופליטת מסנן 460-10. התכנית מוגדרת למצב קריאת Endpoint. מצב פלייט יכול גם לשמש למדידת זמן כמובן אם את מרווחי הזמן לא מגוונים. אות מכל נקודת זמן היא הממוצע של 10 מדידות (מיצוע מסלולית בקוטר של 2 מ&quot;מ) והרווח מוגדר ב1800. הצלחת מתערערת ל10 שניות ב 500 סל&quot;ד באמצעות טלטול כפול הקפה לפני כל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את assay השחרור רטינול, הבארות לקרוא פעם אחת באמצעות נקודתי קצה קריאה מ &#39;שיר הלל לפני הולוגרמות RBP (בדרך כלל ריכוז 1 מיקרומטר סופי) הוא הוסיף ב0 דקות. ברגע שהולוגרמות RBP הוא הוסיף, התגובה מנוטרת באופן רציף בכל 5-10 דקות ל1-3 שעות. כדי להפעיל את בדיקת העמסת רטינול, רטינול כל טרנס (בדרך כלל 1 מיקרומטר ריכוז סופי) הוא הוסיף לבארות תחת אור אדום עמום. הצלחת היא לקרוא פעם אחת לפני apo-RBP מתווספת ב0 דקות. ברגע שapo-RBP הוא הוסיף, התגובה מנוטרת באופן רציף בכל 5-10 דקות ל1-3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל המדידות נעשו, להוריד את הנתונים הגולמיים (לדוגמה שמוצגת באיור 2) מתוכנת ניתוח נתוני האומגה (BMG Labtech) ל-Microsoft Excel לניתוח נתונים. כל נקודת זמן יוצרת קובץ המכיל את הקריאה של כל תנאי הניסוי. לדוגמה, אם יש 20 נקודות זמן, לאחד 20 קבצים לתוך קובץ אחד Excel לצורך ניתוח נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניתוח נתונים, את אותות קרינה לפני התוספת של רטינול או הולוגרמות RBP ב0 דקות נחשבים אותות רקעד נוכה מאותות הקרינה הסופיים בכל נקודתי הזמן. למרות אותות הרקע נמוך בהשוואה לרטינול פלואורסצנטי בולוגרמות RBP, החסרת הרקע מבטל את ההשפעה הספציפית של פיזור אור על ידי הקרומים ומאפשר להתמקד בפלואורסצנטי רטינול של הולוגרמות RBP או רטינול הוסיף ב0 דקות. </li></ol> 3. ניטור בזמן אמת של תעבורת STRA6-קטליזאטור של רטינול מהולו-RBP לCRBP- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטינול-EGFP היא העברה חדשה פלואורסצנטי תהודה (סריג) זוג שלא מכבר הוקמה 41. תחבורת STRA6-קטליזאטור רטינול מהולוגרמות RBP לEGFP-CRBP-מנוטר בזמן אמת על ידי מדידת רטינול-EGFP סריג. חלבון היתוך EGFP-CRBP-עם 6XHis תג (EGFP-CRBP-I) מיוצר בתאי יונקים ומטוהר על שרף Ni-נ.ת. ע לפני הניסוי. EGFP-CRBP-אני יכול להיות מאוחסן בPBS עם מעכבי פרוטאז, לתקופה קצרה של זמן ב 4 ° C. לחלופין חלבון היתוכיs קפואה ב-80 מעלות צלזיוס בaliquots הקטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני התגובות, להכין Microfluor-2 צלחת וקרומים כמתוארים לעיל חסומה. לשטוף את הבארות המצופות של צלחת Microfluor-2 פעם עם 200 PBS μl לפני תוספת של השעית קרום (50 μl לטוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן האמת רטינול-EGFP סריג נמדד באמצעות POLARstar אומגה עם העירור 320ex הסינון ומסנני הפליטה ו460-10 510-10 באמצעות אופטיקה קרינת פליטה דו הקרב בו זמנית. התכנית מוגדרת למצב קריאת Endpoint. מצב פלייט יכול גם לשמש למדידת זמן כמובן אם את מרווחי הזמן לא מגוונים. אות מכל נקודת זמן היא הממוצע של 10 מדידות (מיצוע מסלולית בקוטר של 2 מ&quot;מ) והרווח מוגדר ב1800 לכל ערוץ. הצלחת מתערערת ל10 שניות ב 500 סל&quot;ד באמצעות טלטול כפול הקפה לפני כל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את התגובות, EGFP-CRBP-I (בדרך כלל ריכוז 1 מיקרומטר סופי) הוא הוסיף לבארות. הצלחת היא לקרוא עלce שימוש במצב קריאת Endpoint לפני הולוגרמות RBP מתווסף ב0 דקות. ברגע שהולוגרמות RBP הוא הוסיף, התגובה מנוטרת באופן רציף על ידי מדידה כל 5-10 דקות לשעות 1-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל המדידות נעשו, להוריד את הנתונים הגולמיים (דוגמה מוצגת באיור 3) מתוכנת ניתוח נתוני האומגה ל-Microsoft Excel לניתוח נתונים כמתוארים לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטינול-EGFP סריג מחושב על ידי השינוי הדינמי בשיעור של פסגות פליטת acceptor / תורם 47. המשוואה 41 לחישוב יחס זה היא [(510 לא -510 ב) / (460 לא -460 ב)], שבו 510 לא, 510 ב, 460 לא, ו460 ב מייצגים פליטה ב510 ננומטר לאחר תחילת התגובה ( t = נקודת זמן), ב510 ננומטר לפני רטינול או הולוגרמות RBP מתווסף (ב = רקע), ב460 ננומטר לאחר תחילת התגובה (= נקודת הזמן t), וב460 ננומטר לפני רטינול או הולוגרמות RBP נוסף (= רקע ב), בהתאמה. </li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו חולקים כאן פרוטוקול ייצור RBP אופטימלי בגלל תהליכי ייצור וטיהור RBP הם קריטיים ליצירת RBP מקופל בצורה נכונה. בהתחשב באפשרות של מיני RBP misfolded והנוכחות של כמויות זעירות של חלבונים חיידקיים אפילו בHPLC המטוהר חיידקים מיוצרים RBP, כדאי להשתמש RBP יליד מסרום כדי לאשר מסקנה הקשורה לRBP. RBP השתן, שהוא זמין באופן מסחרי, היא תערובת מורכבת של מינים רבים של RBP כולל apo-RBP והולוגרמות RBP 48,49. טכניקות...

ויטמין A היא מולקולה אורגנית שהיא חיוני להישרדות אנושית ותפקוד התקין של כמעט כל איברי האדם. ויטמין נגזר (רטינואידים) להשתתף באירועים ביוכימיים וסלולריים מגוונים כולל את החישה של אור ל1,2 חזון והרגולציה של ביטוי גנים ותרגום חלבונים במהלך התפתחות עוברית וברקמות בוגרות 3-6. למרות רטינול יש את היכולת לפזר מערכתי, האבולוציה באה עם חלבון פלזמת רטינול מחייב, חלבון נישא ספציפי לויטמין תחבורה בדם כדי להשיג יעילות וסגולית גבוהה ולהימנע מרעילויות קשורות דיפוזיה 7-10 אקראית. קולטן זיקה גבוהה שנקשר לRBP ולוקח ויטמין היה שיערות ב1970 11-13. למרות ראיות שהצטברו בשלושה עשורים על קיומו של הקולטן RBP 14-31, השערת הקולט נדונה במשך שנים רבות בשל existencדואר של הגדרה לא נכונה של הולוגרמות RBP. ההגדרה הנכונה של הולוגרמות RBP היא שזה מורכב 01:01 זיקה הגבוהה בין רטינול וRBP. שאיבה חוזרת של הולוגרמות RBP ידי ממס אורגני היא הכרחית כדי לייצר apo-RBP. הגדרה זו משמשת כמעט על ידי כל המעבדות הלומדות RBP 7,9,32-35 או קולט RBP 14-31,36-42. ההגדרה לא הנכונה של הולוגרמות RBP ששמשה להפריך את קיומו של הקולטן RBP היא התערובת החריפה של רטינול החופשי עם apo-RBP. מאז הפונקציה של הקולטן RBP בויטמין ספיגה מהולוגרמות RBP היא לשחרר רטינול מהולוגרמות RBP, קולט RBP היה לשחק שום תפקיד בספיגת רטינול אם רטינול הוא חופשי להתחיל עם (כפי שהוצע על ידי ההגדרה הנכונה של הולו RBP-). זיהוי האחרון של הקולטן RBP כחלבון תחום multitransmembrane נקרא STRA636 ותפקודו בספיגת הוויטמין מהולוגרמות RBP 36-43 חזקה טוען נגד ההשערה כי RBP לאצריך קולט לספק ניתוחים מדוקדקים ויטמין A. נמצאו כי STRA6 יש 9 תחומים הטרנסממברני עם N-הסופי ממוקמים extracellularly וC-Terminus ממוקמים intracellularly 40. ממוקם בין הטרנסממברני 6 ו 7 הוא תחום מחייב חיוני RBP 39. STRA6 מצמיד הן LRAT וCRBP-אני בויטמין ספיגה מהולוגרמות RBP, אך גם לא LRAT CRBP-אני דרוש לחלוטין לSTRA6 פעילות מוגברת 41. היכולת של STRA6 לזרז שחרור רטינול מהולוגרמות RBP היא המפתח לויטמינה פעילות ספיגה 41. על ידי הסתמכות על STRA6 לשחרר רטינול, ויטמין מסירה בRBP יכול להסיע ויטמין למקד את התאים ברקמות פריפריה עם סגוליות גבוהות ויעילות. החשיבות הקריטית של הגדרת הולוגרמות RBP והכנה מודגמת לא רק הדיון ההסטורי על קיומו של הקולטן RBP, אלא גם על ידי שלושה עיתונים האחרונים הבוסס על הולוגרמות RBP אונטערשייד הגדרותשונה שמפה מהגדרה המקורית ונכונה 44-46. העיתון הראשון השתמש בהגדרת הולוגרמות RBP ששמשה לפסול את קיומו של הקולטן RBP ללמוד RBP קולט 44. את המסמכים השניים ושלישיים באו עם הגדרה שלישית של הולוגרמות RBP שעשתה את זה אפילו פחות סביר לרטינול להיחקר כדי ליצור מורכבות נכונות עם RBP 45,46. מחקרים אלה הוכנו על ידי ערבוב 3 H-retinol/RBP הולוגרמות RBP (אפילו לא apo-RBP) עם 3 H-רטינול. מאז assay זה לא היה לי 3 H-retinol/RBP נוצר ולא להסיר המוגזם חופשי 3 H-רטינול 45,46, זה לא assay לספיגת H-3 מ 3 H-retinol/RBP רטינול, אבל הוא חופשי 3 assay דיפוזיה H-רטינול. זה כבר הראה בעבר כי STRA6 לא לשפר את ספיגת הסלולר של רטינול בחינם על ידי LRAT 38 או CRBP-41. כמעט כל רטינול חייב RBP בדם ואין להבחין freהדואר רטינול. פונקציה עיקרית של הקולטן RBP היא לזרז שחרור רטינול מהולוגרמות RBP במהלך ספיגת רטינול מהולוגרמות RBP 41. אם רטינול הוא שוחרר באופן מלאכותי, או בצורה החופשית להתחיל עם 45,46, קולט RBP אין צורך. התוצאות השונות באופן דרמטי המתקבלות מבדיקת דיפוזיה רטינול החופשית בהשוואה למבחנים הבוסס על הוכן כראוי הולוגרמות RBP להמחיש כי הכנה הנכונה של RBP הן קריטיות עבור המבחנים הפונקציונליים שלו. RBP יכול להיות מטוהר מסרום האדם 41, אך ההליך מורכב והתשואה היא נמוכה. גישה חלופית היא לייצר RBP בE. coli. בגלל E. coli אין יכולת כראוי לקפל חלבונים מופרשים יונקים עם יותר מזוג אחד של אג&quot;ח דיסולפיד כמו RBP, זה חיוני כדי לקפל RBP ולטהר את החלבון המקופל בצורה נכונה. חלבוני Misfolded לא מתנהגים בצורה שונה מרק RBP המקופל תוקן במבחנים שונים,אבל גם לגרום להצטברות חלבון במהלך האחסון. מאותה הסיבה, apo-RBP מיוצר רק מהאיכות גבוהה הולוגרמות RBP. אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימלי לייצר RBP איכות גבוהה 100% עמוסים רטינול דרך ביטוי חיידקים, מקפל, וטיהור HPLC. טיהור HPLC מסירה RBP מקופל באופן שגוי, אלא גם זיהום חיידקים משמעותי שיכול לגרום לממצאים חמורים אם RBP משמש במבחני העברת אותות לא רק. גם אנו מתארים שתי טכניקות בזמן אמת ניטור רגישים ללמוד תחבורת רטינול ידי STRA6. שני הטכניקות תלויות בRBP באיכות גבוהה. בשל מגבלות מקום, בטכניקות הקלסיות של ויטמין retinoid מבוסס וHPLC מבוסס רדיואקטיבי A מבחני ספיגה אינן מתוארות כאן.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> hydrochloride guanidine </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> ציסטין </td><td> סיגמא </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> ציסטאין </td><td> סיגמא </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> דיג </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> טריס </td><td> דיג </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> רטינול </td><td> סיגמא </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicillin </td><td> דיג </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> דיג </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-נ.ת. ע </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazole </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> heptane </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> החוסם קזאין </td><td> לנקב </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> 15 concentrator Ultra Amicon (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 צלחת </td><td> דיג </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> המילטון המזרק Gastight # 1710 </td><td> דיג </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

ויטמין A חיונית לראייה וגדילה / התמיינות של כמעט כל איברי האדם. החלבון מחייב רטינול פלזמה (RBP) הוא עקרוני ומוביל ספציפי של ויטמין בדם. כאן אנו מתארים טכניקת אופטימיזציה לייצר ולטהר הולוגרמות RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד את ההובלה של ויטמין על ידי הקולטן גבוהה זיקת RBP STRA6. הטכניקה הראשונה מאפשרת לייצר כמות גדולה באיכות גבוהה הולוגרמות RBP (100% טיעון עם רטינול) לויטמין A מבחני תחבורה. RBP איכות הגבוהה הוא חיוני למבחנים תפקודיים בגלל misfolded RBP משחרר ויטמין זיהום חיידקים בקלות והכנת RBP יכול לגרום לחפצים. טכניקות ניטור בזמן אמת כמו electrophysiology תרמו תרומה מכרעת למחקרים של תחבורת קרום. תחבורת רטינול הקולטן בתיווך RBP לא נתח בזמן אמת עד לאחרונה. הטכניקה השנייה שתוארה כאן היא פליליתניתוח L-עת שחרור STRA6-קטליזאטור רטינול או הטעינה. השיטה השלישית היא ניתוח בזמן אמת של STRA6-קטליזאטור תחבורת רטינול מהולוגרמות RBP לסלולרי רטינול חלבון אני מחייב (CRBP-I). טכניקות אלה מספקות רגישות ורזולוציה גבוהה בחשיפת מנגנון ספיגת הוויטמין של הקולטן RBP.

אנו מציגים כאן תוצאות יציגות לייצור הולוגרמות RBP וטיהור על ידי HPLC (איור 1), ניתוח בזמן האמת של STRA6-קטליזאטור שחרור רטינול מהולוגרמות RBP וטעינת רטינול לapo-RBP (איור 2) והניתוח בזמן אמת של תחבורת STRA6-קטליזאטור רטינול מהולוגרמות RBP לEGFP-CRBP-I (איור 3). ללא refolding, RBP מיוצר בחיידקים כמעט misfolded לחלוטין בשל נוכחותם של איגרות חוב דיסולפיד שגויות רבות...

כאן אנו מתארים טכניקה אופטימלית לייצור ויטמין איכותי מורכב / RBP ושתי טכניקות ניטור בזמן אמת כדי ללמוד ויטמין הובלה בSTRA6, קולט RBP.

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

פרוטוקול זה מציג ייצור של חלבון קושר רטינול פלזמה באיכות גבוהה המשמש לחקר הפעילות של קולטן חלבון קושר רטינול בזמן אמת. זה מושג על ידי שאיבה וטיהור של כמות גדולה של חלבון קושר רטינול מחיידקים. חלבון קשירת הרטינול המטוהר מפורק לחלוטין ומתקפל לאט לאט בנוכחות רטינול הליגנד שלו.לאחר מכן מטוהרים את חלבון קשירת הרטינול המקופל כהלכה באמצעות HPLC כדי להסיר חלבון ומזהמים חיידקיים מקופלים בצורה שגויה. לאחר קבלת חלבון קושר רטינול באיכות גבוהה, ניתן להשתמש בו כדי לחקור את הפעילות של קולטן הממברנה שלו בזירוז שחרור רטינול, העמסת רטינול או הובלת רטינול לחלבון קושר רטינול תאי 1. בזמן אמת.היום אדגים את הפרוטוקול המשופר שלנו לרפורמה וטיהור חיידקים המייצרים חלבון קושר רשתית. טכניקה זו יכולה לייצר חלבון קושר רשתית באיכות גבוהה, החיוני לבדיקות פונקציונליות. אדגים את הטכניקות החדשות שפותחו לחקר הקולטן לחלבון קושר רשתית.היתרון העיקרי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות כמו טכניקות מבוססות רדיואקטיביות או HPRC הוא בכך שהן מאפשרות לך לעקוב אחר התקדמות של תגובות מרובות בזמן אמת. החלק הקשה ביותר בהליך זה הוא ניכוי RVP, שיכול גם לקבוע את האיכות וגם את התשואה של RVP. אם החלבון אינו מיוצר כהלכה, לא ניתן להשתמש בתכשיר ה-RVP המתקבל לחומצות פונקציונליות.כאן אנו מציגים כמה שיפורים שפיתחנו במהלך השנים שיבטיחו הצלחה. ה

real-time-analyses-retinol-transport-membrane-receptor-plasma-retinol

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לאמת את שחזור של מודל במבחנה BBB מעורב syngeneic חולדה שיתוף תרבות של תאים והאסטרוציטים אנדותל. Monolayer תא אנדותל הציג Teer גבוה וחדירות LY נמוכות. ביטוי של חלבונים ספציפיים TJ, תגובות פונקציונליות לדלקת ופונקציונליות של מובילים וקולטנים הוערכו.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

המצב המטבולי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית האנושית (H-RPE) משקף את בריאותם ותפקודם. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לבחינת שטף מטבולי בזמן אמת של H-RPE באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

ניתוח בזמן אמת של ביואנרגטיקה בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

כאן, מתוארת שיטת כרומטוגרפיה נוזלית בשלב רגיל, בעלת ביצועים גבוהים כדי לזהות ולכמת רטינואידים קריטיים המעורבים בהקלה על תפקוד הראייה ברקמה עינית וסיסטמית כאחד, בהקשר של אספקת ויטמין A מערכתית ליצירת כרומופור רודופסין 11-cis-retinal רגיש לאור חיוני.

ניתוח כמותי של מטבוליטים תזונתיים של ויטמין A ברקמות עיניות ולא עיניות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים

במאמר זה אנו מתארים שתי שיטות כמותיות לחקר יחסי הגומלין בין חלבונים לליגנדים של קולטני קרום ויטמין A ואופסין פוטורצפטור עם הליגנדות הפיזיולוגיות שלהם.

מתודולוגיה לחקר אינטראקציות של קולטני קרום ויטמין A וחלבון אופסין עם הליגנדות שלהם ביצירת חלבון רטיניל

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לכמת את טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום התא של תאים על ידי cytometry הזרימה.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה

מרובה יעד האיתור הוא פיתח אלגוריתם ביתי למעקב אחר בנפרד מולקולות שכותרתו בתוך קרום הפלזמה של תאים חיים. יעיל באיתור, הערכה ואיתור מולקולות לאורך זמן בצפיפות גבוהה לספק ידידותי למשתמש, כלי מקיף לחקור הדינמיקה קרום ננומטריים.

מיפוי דיפוזיה מולקולרית בקרום פלזמה ידי מרובות יעד Tracing (MTT)

אנחנו מדגימים סריג בין polydiacetylene מצומדת פולימר (PDA) וfluorophore מחובר אל פני השטח של כף יד ליפוזומים את החישה של ביומולקולות. יפוזומים PDA הכילו גם מולקולות הקולטן על משטחיהם לביומולקולות כדי לשמש כחלליות. אינטראקציות יגנד רצפטור להוביל לשינויים ביעילות סריג בין fluorophore ומחשבי כף היד, שהוא הבסיס של מנגנון החישה.

ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

thermophoresis microscale (MST) יכול להיות בשימוש נרחב לקביעת זיקה מחייבת ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של החלבון ה-GFP-התמזגו, תמוגה תא שבאינו denaturing תנאים, וזיהוי של אות MST בנוכחות ריכוזים שונים של ליגנד.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

למדו לייצר חלבון RBP איכותי מפלזמה לניטור בזמן אמת של תעבורת רטינול דרך הקולטן STRA6. הפרוטוקול כולל ביטוי בחיידקים, קיפול מחדש עם רטינול וניקוי HPLC לחקר מנגנוני ויטמין A בתאים.

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

גלה סרטונים נוספים