Name: Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: חקור השפעות נוירולוגיות וקוגניטיביות של יתר-ביטוי microRNA בעכברים באמצעות הזרקת לנטיווירוס סטריאוטקטית לאזור CA1 בהיפוקמפוס. שיטה זו מאפשרת שליטה מרחבית וזמנית מלאה בביטוי הגן ובהערכת תפקודים קוגניטיביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מרכז אדמונד ולילי ספרא למדעי המוח (SB מלגה), התכנית המורשית ביו רפואית מדע השותפות של הקרן הלאומית למדע (מענק מס &#39;378/11, ל&quot;מ) וקרן גרמנית למדע מחקר ופיתוח (GIF) (גרנט 1093-32.2/2010 מס, לHS).

1. הכנת lentivirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי HEK-293FT למפגש 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של מדיום סלולארי שינוי transfection לסרום ללא DMEM בתוספת גלוטמין 1 מ&quot;מ ו -50 פניצילין, סטרפטומיצין מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף transfect התאים עם וקטור pLKO.1-Puro ועם פלסמידים קידוד לR8.2 הדלתא וVSV-G moieties ומירנה של עניין, באמצעות 10 μl של polyethylenimine 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל כנשא 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף lentiviruses ארוז ב24 שעות ו -48 שעות לאחר transfection, לסנן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את lentiviruses באמצעות ultracentrifugation ב70,000 XG, במשך שעה 2 ו -15 מעלות צלזיוס, aliquot ולאחסן ב -70 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל נגיף מידה על ידי הדבקה של תאי HEK-293T עם הכנות וירוס דילול סדרתי (1 עד 10 -6 מ&quot;ל של וקטור לכל טוב). כתוצאה כייל (מינימום של ~ 1 × 10 9 חלקיקים זיהומיות למ&quot;ל מומלץ) מוערך על ביטוי של gene של עניין, באמצעות בחירת puromycin וכימותים על ידי GFP להביע וירוסים באמצעות ספירת תאי ניאון. </li></ol> לפרוטוקול מפורט יותר של הכנת lentivirus לראות 10. 2. הכנת בעלי חיים לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבוש מנתחים צריך לכלול חלוק ניתוחים, כפפות סטריליות, כובע ומסכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את בעל החיים, ואז להרדים אותו עם ה-IP-הזרקה של תערובת קטמין, עם הנפח הפרופורציונלי למשקל החיה כמפורט עבור כל תרופה. לתערובת קטמין / Xylazine, טווח מינון של קטמין מ&quot;ג / ק&quot;ג 80-200 ו7-20 Xylazine מ&quot;ג / ק&quot;ג משמש בדרך כלל לעכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהחיה היא בהרדמה מלאה, ואז לבדוק לחוסר רפלקס נסיגה באיבר האחורי של החיה על ידי הארכת האיבר ולאחר מכן לחיצה עליו עם האצבע שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את החיה מתחת לעור עם Rimadyl, כמפורט בקופסה, להקלה על כאב. טווח מינון אופייני לRymadil הוא 5-10 מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף קבועה וללחלח את העיניים עם משחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את האזור שבין שתי האוזניים עם מכונת חיתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את העור עם בטאדין. </li></ol> 3. חשיפה של הגולגולת והקידוחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה בתוך stereotact על ידי התאמת המוטות לתוך הסדקים רק הקדמיים לאוזניים של בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל כדי לעשות חתך קדמי, אחורי של כ -1.5 ס&quot;מ בין האוזניים ולשמור אותו לפתוח עם מהדק ניתוח (serfines). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את פני השטח של הגולגולת עם מקלון צמר גפן עד לצומת שבין תפר העטרה ותפרי sagittal, כלומר גבחת וצומת בין תפרי העטרה וlambdoid, כלומר למבדה, גלויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הקצה של המזרק, שנערך על ידי stereotact, עד לנקודת שגבחת, בכל שלושת הצירים. רשום את הקואורדינטות. נקודה זו תיחשב כPO אפסint בכל שלושת הצירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את המזרק בציר האנכי, כך שתנועה מישוריים לא לשרוט את הגולגולת ולהזיז את ראש המזרק למיקום הנכון. זריקות CA1 בהיפוקמפוס דורשות הבא מרכז יחסית לגבחת במ&quot;מ: -2 בציר הקדמי / אחורי, ± 1.8 בציר הרוחב / המדיאלי ו-1.5 בציר הגב / הגחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את הקצה של המזרק עד שהוא נוגע בגולגולת ולסמן את המקום עם טוש. הוצא את המזרק בחזרה כדי להימנע מהדקירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חור רדוד, רק בעצמות הגולגולת באמצעות הקודח בסדר. החזק את הקודח יציב כדי שלא ימשיך לקדוח לתוך הרקמות הרכות שמתחת. ניתן למנוע זאת על ידי יד אחת מייצבת עם השני ועל ידי קידוח בפולסים קצרים. </li></ol> 4. הזרקה של Lentivirus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת 0.5 מ&quot;ל של פתרון lentivirus המרוכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המזרק מעל לחור ומוריד אותה לאט במאונך עד שזה פליליתצ &#39;ס את פני השטח של הגולגולת. להמשיך ולהפחית את המזרק לתוך המוח באיטיות רבה. בשלב זה, עלול לגרום לדימום שאינו מצביע בהכרח על חדירה נכשלה. אם דימום מתרחש לנגב אותו עם מקלון צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המשאבה הדיגיטלית ל0.02 מ&quot;ל / דקה (0.5 μl הייתי להיות מוזרק ב25 דקות) ולהתחיל עירוי. עירוי איטי מאפשר הפצה יעילה של הווירוס לתוך הרקמות ומונע חזרה לזרום. בחלק מסוגי המזרק לשקול החדרת המזרק לעומק נוסף של 0.5 מ&quot;מ לפני שנסוג לקואורדינטות ויציקה מקוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העירוי הושלם להמתין במשך 5 דקות נוספות כדי לאפשר את החומר להתפשט לתוך המוח במקום לסגת בחזרה לתוך התעלה שהוקמה על ידי המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את המזרק באיטיות רבה ולצפות לזורם בחזרה. אם זרימה לאחור הוא ציין בשלב זה, כל חלק של החומר המוזרק היה כנראה הולכים לאיבוד. </li></ol> 5. איטום פצע ושחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה חותםדואר פצע עם histoacryl. הקפד למנוע דליפה של histoacryl לתוך עיניו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק intraperitoneally בעלי החיים (IP) עם מי מלח 1 מ&quot;ל מחומם מראש, כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה בכלוב התאוששות שממוקמת על משטח לוהט. צפו בבעלי החיים בזמן שהוא מתאושש לשעה נוספת. </li></ol> במקרה של ירידה במשקל, inappetance, צריכה להתבצע חולשה / חוסר היכולת להשיג מזון או מים, מדינה גוססת או זיהום, המתת חסד של בעלי החיים. שיטות מקובלות להמתת חסד של מכרסמים הן כדורי שינה, הרדמה נשימתית, CO 2, CO, או אשלגן כלורי בשיתוף עם הרדמה כללית. לאחר 4 עד 6 שבועות, להעריך את זכרון הניווט של החיה מוערך במבוך המים של מוריס. Lentivirus בדרך כלל להדביק את רוב התאים בתוך מעגל ההזרקה. 6. הערכת התנהגות במבוך המים של מוריס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכשיר את בעלי החיים בMמבוך המים orris. לאימונים מדויק ופרוטוקול בדיקה לראות 11. אחרי כל ניסוי, לייבש את החיה עם מגבת יבשה, להחליף אותו בכלוב שלו ולרענן את המים במכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את בעלי החיים במבוך המים של מוריס במשך 3 ימים רצופים, 4 ניסויים בכל יום. בכל יום להכניס את בעל חיים לתוך המבוך בכל אחד 4 הכיוונים של המבוך (צפון, דרום, מזרח ומערב) בשינוי סדר, למשל יום אחד: ממזרח למערב, צפון לדרום, יום שני: ממערב לדרום -צפון מזרח. נגב את החיות אחרי כל משפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך בדיקת ניסויים לעקוב אחר בעלי החיים עם מערכת מעקב כגון מערכת מעקב Noldus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי משפט מבחן ה -12, הכנס את בעל החיים לתוך המכל המים ללא פלטפורמה לדקה אחת. זה יהיה להשתמש בו כדי לנתח את אסטרטגית חיפוש בעלי החיים הוא לוקחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים כפי שהוצע ב12. </li></ol>

<ol><li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li>
<li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li>
<li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors%3A+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li>
<li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li>
<li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A%2FB+in+Alzheimer%27s+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li>
<li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety%3A+the+case+of+amygdalar+miR-34%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li>
<li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li>
<li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+%26+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171(2012).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+Water+Maze+Experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897(2008).</li>
<li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920(2011).</li>
<li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הזרקת Stereotactic של lentivirus היא שיטה מהירה יחסית להערכה בvivo עבור שניהם למעלה או למטה רגולציה של גנים וmiRNAs שונים. החלופה העיקרית היא עכבר מהונדס גנטי אשר הוא טכניקה רב הרבה יותר מפרכת ושעה לאחר מכן זריקת lentivirus ישירה. בנוסף, הרגולציה למעלה, בהזרקת lentivirus, מתרחשת בזמן מסוים בעכבר הבוגר, ואינה כוללת כל אפשרות של דליפות במהלך פיתוח, כפי שהוא לרוב במקרה בעכברים המהונדסים גנטי שכוללים שליטה זמנית. שליטה מלאה זמנית היא חיונית בעת בחינת הרלוונטיות של גנים שונים ...

התפקיד של miRNAs מסוימת בתפקוד מערכת עצבים באחרונה לערער על ידי הזרקת lentiviral במספר מחקרים. MiRNAs כבר מצא להיות חיוני לשמירה ועיצוב מחדש מבנה סינפסה 1, 2 synaptogenesis ושיפוץ סינפסה ותחזוקה 3. מחקרים אלה ממליצים כי miRNAs עוסקות, דרך השפעות הרגולטוריות ריבוד בשניהם בעיצוב למעלה ובשמירה על התפוקה העיקרית של מערכת העצבים, תפקוד הקוגניטיבי. הזרקה של חלקיקי Stereotactic lentivirus לאזורים ספציפיים במוח המכרסם מאפשרת מחפשת שינויים במורפולוגיה סינפסה ופעילות עצבית, ושימש להקמת המשמעות התפקודית של תמלילי ביטוי יתר 4,5. זיהום ישיר של תאי עצב באזורי המוח מוגדרים היטב עם lentiviruses מירנה-להביע עשויה להיות מעורב במחקרים של הזדקנות, הפרעות במוח וניוון מוחיים, מחקרים של מירנהים בתחום של רגולציה התנהגותית 6-8 נמצא במצב הרבה פחות מתקדם, והזרקת stereotactic של מירנה-להביע חלקיקי lentivirus ואחרי בדיקות התנהגותיות עשוי להיות שימושי למטרות האמורות. שיטה הרבה יותר מייגע לגרימה מעל או מתחת, ביטוי כרוך בהנדסה גנטית עכברים בנוקאאוט דפיקה באו. מערכות גנטיות נוספות יכולות לאפשר לבקרה מותנית ובזמן על ביטוי (למשל Cre-קס, מערכות ט), אך אלה כמעט לא להציע סגוליות המרחבי של הליך ההזרקה וכמעט תמיד יש כמות מסוימת של דליפות. כמו כן, את הנהלים ההנדסיים אינם דורשים ניתוח, וניתן להשתמש בכל מעבדות עם שחזור טוב יחסית, עם זאת, שהם איטיים יותר ודורשים הרבה יותר כוח אדם ובמשאבים כספיים. בנוסף, השליטה הזמנית של מעל או מתחת הביטוי בעכברים שהוזרקו הוא הרבה יותר מדויק בהשוואה לעכברים מהונדסים גנטי.

<table><tbody><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>מכרסם משקל משקל</td><td>ברטונס (בריטניה)</td><td>115-455</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>FIRstTechnology</td> מכונת זמירה <td>DCT-25</td><td></td></tr><tr><td>Stoelting</td><td>51465</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סטריאוטאקט</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>אזמל ולהבים</td><td>קנט מדעי</td><td></td><td></td>INS500348</tr><tr><td>מזרק הרלנד</td><td>המילטון</td><td>7632-01</td><td></td></tr><tr><td>מקדח</td><td>Stoelting</td><td>51449</td><td></td></tr><tr><td>משאבה דיגיטלית</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>704507</td><td></td></tr><tr><td>מיכל מים ופלטפורמה</td><td>Stoelting</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ריאגנטים</חזק></td></tr><tr><td>קטמין </td><td>Vetoquinol (פיתוי צרפת)</td><td></td><td></td>3055503</tr><tr><td>דומיטור</td><td>אוריון פארמה</td><td>107140-10</td><td></td></tr><tr><td>רימאדיל</td><td>פייזר משחת לחות לבריאות בעלי חיים</td><td>24751</td><td></td></tr><tr><td>- Synthomycine 5%</td> <td>Rekah Pharmaceutical</td><td>195</td><td> </td></tr><tr><td>היסטואקריל</td><td>בראון</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>מלח</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D8662</td><td></td></tr></tbody></table>

lentiviruses הזרקת stereotactic של microrna-לבטא באזור ca1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

מיקרו RNA (miRNAs) הם מולקולות רגולטוריות קטנות חד גדילי RNA כ -22 נוקלאוטידים ארוכים שעשוי כל יעד תעתיקי mRNA רבים ומסלול כולו עמום ביטוי גנים על ידי הרס ו / או תרגום עיכוב של יעדים אלה ישכנעו. כמה miRNAs לשחק תפקיד מפתח בשמירה על מבנה ותפקוד עצביים ובתפקודי מוח ברמה גבוהה יותר, והם חיפשו שיטות לרמותיהם מניפולציה בשביל לחקור את הפונקציות האלה. כאן, אנו מציגים שיטה ישירה בvivo לבחינת ההשלכות הקוגניטיביות של miRNAs נאכפה עודפת בעכברים על ידי הזרקה של חלקיקי נגיף stereotactic מירנה קידוד. באופן ספציפי, בפרוטוקול הנוכחי כרוך בהזרקה לאזור CA1 בהיפוקמפוס, התורמת לגיבוש יונקים זיכרון, למידה, ותגובות לחץ, ומציע הזריקה נוחה. את הקואורדינטות נמדדות לפי גבחת העכבר וזלוף הווירוס נמצא בשליטה דיגיטלית ושמר איטיים מאוד.לאחר הזרקה, פצע הניתוח הוא חתום ואת בעלי החיים להתאושש. Lentiviruses קידוד משתיקי קול של מטרות mRNA המתאימות לשמש כדי לסבך את מירנה / יעד האינטראקציה הספציפית אחראית לאפקט הנצפה, עם עכברים נאיביים, עכברים שהוזרקו עם מי מלח ועכברים שהוזרקו עם וקטורי lentivirus &quot;ריקים&quot; כקבוצת ביקורת. חודש אחד לאחר ההזרקה, החיות נבחנות במבוך המים של מוריס (MWM) להערכת למידת הניווט שלהם ויכולות זיכרון. MWM הוא המכל עגול מלאים במים צבעוניים עם פלטפורמה קטנה שקועה 1 ס&quot;מ מתחת לפני המים. רמזים חזותיים יציבים סביב הטנק לאפשר ניווט המרחבי (קול והשדה המגנטי של כדור הארץ עשוי גם לסייע לבעלי החיים בניווט). ניטור מצלמת וידאו מאפשר מדידת מסלול השחייה ואת הזמן כדי למצוא ויסתכם בפלטפורמה. העכבר ראשון שלמד את ההרכבה הפלטפורמה הנסתרת מציעה מפלט מהחייה הכפויה, אלא לאחר מכן הוא נבדק על שימוש בבריחה וF זהinally, הפלטפורמה מוסרת ובדיקות בדיקה לבחון אם העכבר זוכר את מיקומו הקודם. בדיקות חוזרות ונשנות על פני כמה ימים רצופים להדגיש ביצועים משופרים של עכברים נבדקו בlatencies קצר יותר כדי למצוא ולהתקין את הפלטפורמה, ומסלולים כיותר ישירים כדי להגיע לפלטפורמה או מיקומו. כישלון להראות שיפור כזה מייצג לקוי למידה וזיכרון ו / או חרדה, אשר לאחר מכן ניתן לבחון באופן ספציפי (לדוגמה: במבוך בתוספת המוגבה). גישה זו מאפשרת אימות של miRNAs ספציפית ותמלילי היעד בהקוגניטיבית ו / או תהליכים הקשורים ללחץ למד.

הזרקה של 0.5 lentivirus μl לאזור CA1 בהיפוקמפוס העכבר, עם קצב הזרימה מצויינים בסעיף הפרוטוקול מניבה תחום נגוע של כ 1 מ&quot;מ בציר מקורי, הזנב, ועל 0.5 מ&quot;מ וברוחב המדיאלי-הקדמי צירים אחוריים-(איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> איור 1. נקודת גבחת ומכשירי הזרקה. (א) הוא מוצג מפה סכמטית של גבחת (צ...

יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך את<em&gt; In vivo</em&gt; השפעות של miRNAs ביטוי יתר של אזורים ספציפיים במוח.

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את ההשפעות הנוירולוגיות והקוגניטיביות של ביטוי יתר (overexpression) של micro RNA בעכברים. מטרה זו מושגת על ידי הכנת לנטיווירוס המבטא micro RNA כשלב שני. הלנטיווירוס מוזרק לאזור ספציפי במוח, מה שמאפשר ל-micro RNA להגיע לביטוי יתר ולבצע רגולציה על מטרותיו.התוצאות שהתקבלו מראות השפעות קוגניטיביות של ביטוי יתר של micro RNA כתוצאה מהחדרה ממוקדת אנטומית של הלנטיבירוס למוח העכבר. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הנדסה גנטית, הוא שהנדסה גנטית היא טכניקה עתירת עבודה וזמן הרבה יותר מאשר הזרקה ישירה של לנטיבירוס. בנוסף, הזרקת לנטיבירוס מאפשרת שליטה מרחבית וזמנית מלאה ומעקב אחר המולקולה המבטאת ביטוי יתר.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ה-miRNA העצבי, כגון מה תהיה ההשפעה של ביטוי יתר או תת-ביטוי של miRNA ספציפי על למידה וזיכרון כפי שניתן להעריכם באמצעות מבחנים התנהגותיים. המשמעויות של טכניקה זו נשמעות גם לטיפול במחלות ניוורו-דגנרטיביות, מכיוון ש-microRNAs ניתנים להתערבויות טיפוליות. דגרו תאי אריזה (packaging cells) בצלחות עד שיגיעו ל-90% confluence, לאחר מכן בצעו טרנספקציה, והחליפו את המצע שלהם למצע DMEM נטול סרום, מועשר ב-1 mM גלוטמין ו-50 mg/mL.הוסיפו פניצילין-סטרפטומייסין ולאחר מכן בצעו טרנספקציה משולבת (co-transfection) לתאים עם פלסמיד וקטור A-P-L-K-O 0.1 המקודד עבור יחידות delta R 8.2 ו-VSVG, ופלסמיד עם ה-micro RNA רצוי. השתמשו ב-10 µL של polyethaline בריכוז 1 mg/mL כנשאי תיווך בנקודות הזמן של 24 שעות ו-48 שעות. לאחר הטרנספקציה, אספו את הלנטי-וירוסים הארוזים וסננו אותם דרך מסנן של 0.45 µm.רכז את התסנן המכיל לנטי-וירוסים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה בטמפרטורה של 15 °C ובכוח של 70,000 Gs למשך שעתיים. השלף את הנוזל העליון ותלה את הלנטי-וירוס בכמות מינימלית של מים מזוקקים דאיוניים הדרושה להמסה מלאה של המשקע, כך שלא ייווצרו גושים נראים לעין. לאחר מכן, חלק את התרכיז לאליקוטות לאחסון בטמפרטורה של 70- °C.בשלב הבא, מדדו את תיתר הנגיף על ידי הדבקת תאי אריזה עם נגיף בדילולים סדרתיים. בפלטה של 12 בארות, השתמשו בכמות של ממיליליטר אחד של וקטור ועד למיליונית של מיליליטר של וקטור לכל בארה. התיתר המתקבל צריך להיות לפחות מיליארד חלקיקים מדבקים למיליליטר.שקלו את החיה והרדימו אותה באמצעות הזרקה IP של תערובת קטמין. השתמשו בנפח הפרופורציונלי למשקל החיה כפי שצוין עבור כל תרופה. המתינו עד שהחיה תהיה מורדמת לחלוטין.לאחר מכן, בדקו היעדר רפלקס נסיגה בגפה האחורית כאשר אין רפלקס. מזריקו לבעל החיים תת-עורית את משכך הכאבים IL כפי שמופיע על גבי האריזה. הניחו את בעל החיים תחת מנורת חימום או על משטח חימום והרטיבו את עיניו באמצעות משחה.לבסוף, גדלו את האזור שבין שתי האוזניים בעזרת מכונת גילוח וחטאו את העור עם 70% ethanol. מקמו את החיה בתוך ה-stereo T וכוונו את המוטות אל תוך החריצים, ממש לפני האוזניים של החיה. לאחר מכן, השתמשו בסכין מנתחים כדי לבצע חתך קדמי-אחורי באורך של כ-1.5 סנטימטרים בין האוזניים, והשאירו את החתך פתוח באמצעות תפסים כירורגיים.כעת, נקה את פני הגולגולת באמצעות מקלוני צמר גפן עד להופעת נקודת המפגש בין התפר הקורונלי (coronal suture) לבין התפרי הסגיטליים (sagittal sutures). זה כולל את ה-bgma ואת נקודת המפגש בין התפר הקורונלי לתפר הלמבדואיד (lambdoid sutures) או ה-lambda. כעת מקם את קצה המזרק המוחזק בסטריאוטקס (stereotype) בנקודת ה-bgma בכל שלושת הצירים, בדיוק לפי הקואורדינטות.אלו הן נקודות האפס. לאחר מכן, הרימו את המזרק בציר האנכי כדי שתנועה מישורית לא תשריט את הגולגולת מה-bgma. העבירו את המזרק למיקום הנדרש עבור hippocampal ca one, לדוגמה, שתי מילימטרים למטה בציר ה-AP, 1.8 מילימטרים למעלה ולמטה בציר ה-LM ו-1.5 מילימטרים למטה בציר ה-DV.בשלב הבא, הנמיכו את קצה המזרק עד שייגע בגולגולת. סמנו את הנקודה, ולאחר מכן הרחיקו את המזרק כדי לפנות מקום למקדח בנקודה זו. בעזרת מקדח עדין, צרו חור רדוד בעצם הגולגולת.החזיקו את המקדח בצורה יציבה והיזהרו לא לקדוח אל תוך הרקמה הרכה. קידוח בפולסים קצרים יכול לסייע במהלך העבודה. ודאו שאתם תומכים ביד אחת באמצעות היד השנייה, כדי שהקידוח דרך העצם לא יחדור עמוק יותר אל תוך הרקמה הרכה.שאיפה של חצי מיליליטר מהתמיסה המרוכזת של הלנטי-וירוס אל תוך המזרק. הנח את המזרק מעל החור והורד אותו לאט ובאופן אנכי עד שיגיע לפני השטח של הגולגולת. המשך להוריד את המזרק אל תוך המוח באיטיות רבה.כווננו את המשאבה הדיגיטלית ל-0.02 milliliters per minute כדי להזריק את הנפח באיטיות במשך 25 דקות. פעולה זו תמנע זרימה חוזרת ותבטיח פריסה מוצלחת. התחילו את ההזרקה בסוגי מזרקים מסוימים.שקלו להחדיר את המזרק חצי מילימטר נוסף לפני הנסיגה לקואורדינטות המקוריות ותחילת ההזרקה בזמן שהחומר מוזרק. הרטיבו את האזור החשוף ב-PBS כדי למנוע התייבשות של הרקמה. עם סיום הפעולה, המתינו חמש דקות לפני הוצאת המזרק.פעולה זו מאפשרת לחומר להתפזר בתוך המוח במקום לסגת בחזרה לנתיב המזרק. לאחר מכן, הוצא את המזרק באיטיות רבה ועקוב אחר זרימות חוזרות. אם נצפתה זרימה חוזרת, סביר להניח שחלק מהחומר המוזרק אבד.אטמו את הפצע באמצעות histo acron, תוך הקפדה שלא יזרם histo acron לעיני החיה. לאחר מכן, כדי למנוע התייבשות של החיה, מזריקו 1 mL של תמיסת מלח (saline) מחוממת באופן תוך-peritoneal. הניחו את החיה בכלוב התאוששות המונח על משטח חימום.עקבו אחר בעל החיים בעודו מתאושש במשך שעה אחת לאחר ארבעה עד שישה שבועות, והעריכו את זיכרון הניווט של בעל החיים כפי שנעשה במבוך המים של מוריס. הלנטי-וירוס כבר יהיה מדביק את רוב התאים המיועדים. עד זמן זה, יש להחדיר הזרקה של 0.5 µL של לנטי-וירוס לתוך ה-ca.אזור אחד של היפוקמפוס של עכבר הוכנה כפי שמתואר בפרוטוקול. לאחר מכן הוקרב בעל החיים, ונערכה אנליזה של פרוסות מוכנו של מוחו בעובי 40 micron. עבור ביטוי GFP, ניתן לראות צביעת DAPI בצבע אדום.לסיכום, הדבר הניב כדור מזוהם של כ-1 מילימטר בציר ה-rostral caudal וכ-0.5 מילימטרים בצירים ה-medial lateral וה-anterior posterior AEs. עכברים שהוזרק להם וקטור לנטיוירוס המקודד ל-micro RNA הושוו לקבוצות ביקורת במבוך המים של מוריס. לאחר שלושה ימי אימון, נתיבו של עכבר ביקורת מייצג אל הפלטפורמה השקועה, המוצג בירוק, היה קצר הרבה יותר מנתיבו של בעל חיים מקבוצת הניסוי, המוצג באדום.באופן כללי, לבעלי החיים בניסוי היה קושי רב יותר בלמידת המטלה מאשר לקבוצות הביקורת. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בערך ב-40 דקות עבור כל עכבר, כאשר קצב הזרימה הוא הגורם המגביל היחיד בעקבות הליך זה.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הזרקה סיסטמטית של אוליגנוקלאוטידים, כדי לענות על שאלות כגון באיזו מידה הליך זה משנה את התקשורת בין המוח לגוף. זכרו כי עבודה עם לנטי-וירוסים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להשתמש באמצעי זהירות כגון חלוק לבגדי מעבדה חד-פעמיים מ-Tyvac וכפפות ניטרליות. בנוסף, יש לחטא כלי זכוכית ופלסטיק המכילים פסולת נוזלית לפני השלכתם לשקית פסולת ביולוגית.

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

JoVE Journal

Behavior

התנהגות

סרטון זה מדגים עיכוב בתיווך מיקרו-רנ"א של זרמים סינפטיים מעוררים בפרוסות מוח של עכבר בהיפוקמפוס. תאי העצב CA3 היו נגועים בווקטור נגיפי רקומביננטי בעל מבנה להבעת כתב פלואורסצנטי, תעלת קרום המופעלת על ידי אור, ומיקרו-רנ"א המווסת את הביטוי של תעלות סידן מגודרות מתח. לאחר הנחת פרוסה בתא הקלטה ותיקון תא עצב CA1 עם פיפטת הקלטה, נעשה שימוש בפעימות אור כדי לעורר את התעלה המופעלת על ידי האור, וכתוצאה מכך זרם יונים וליצור פוטנציאל פעולה. היעדר תעלות סידן מגודרות מתח בנוירונים CA3 מעכב שחרור מוליכים...

עיכוב בתיווך מיקרו-רנ"א של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים בפרוסות היפוקמפוס עכבר

מקור: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Newborn Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את ההזרקה הסטריאוטקסית של וקטור ויראלי המקודד Cre recombinase וחלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP לתוך הסטריאטום של גור עכבר מהונדס גנטית כדי להשיג מניפולציה גנטית על ידי כריתת קלטת STOP עם אגף loxP, הפעלת חלבון פלואורסצנטי אדום או RFP כמדווח.

מיקרו-הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית בסטריאטום גור עכבר

מקור: Pereira, M. et al., In vivo Direct Reprogramming של תאי גליה תושבים לאינטרנוירונים על ידי הזרקה תוך מוחית של וקטורים ויראליים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים הזרקה סטריאוטקסית של נגיף הקשור לאדנו לקליפת המוח של עכבר טרנסגני כדי להעביר תכנות מחדש של עצבים תלויי Cre וגנים מדווחים פלואורסצנטיים לתאי גליה.

הזרקה סטריאוטקסית של וקטורים ויראליים לתכנות מחדש של תאי גליה במודל עכבר

מקור: Fricano-Kugler, C. J., et al. תכנון, אריזה ואספקה של CRISPR רטרו ולנטי-וירוסים עם טיטר גבוה באמצעות הזרקה סטריאוטקסית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה מדויקת של גנים עצביים במוח העכבר. הפרוטוקול מבטיח העברת וירוסים מדויקת לבליטה המשוננת, ומאפשר תיוג פלואורסצנטי ונוקאאוט גנים בתיווך CRISPR לחקור מעגלים עצביים, תפקוד גנים ומנגנוני מחלה in vivo.

הזרקה ויראלית סטריאוטקסית לעריכה גנטית עצבית ממוקדת במוח העכבר

מאמר זה מתאר כיצד microinject וקטורים ויראליים למוח עכבר ולאחר מכן לבדוק בפרדיגמה העדפת מקום ממוזגת הכוללת שלב רכישה, הכחדה והחזרה.

Microinjection Stereotaxic של וקטורים ויראליים הבעת Cre recombinase כדי ללמוד את התפקיד של גני מטרה בהעדפות מקום אוויר קוקאין

הזרקת stereotactic של lentiviruses להביע cDNAs או shRNAs יכול לווסת ביטוי גנים באזורים ספציפיים במוח של עכברים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשלב זריקות stereotactic עם משימות התנהגותיות, כגון מבחן להרחיב שדה (OFT) ומבחן הכפייה לשחות (FST).

יישום טכניקת הזרקת stereotactic לחקר השפעות גנטיות על התנהגות בעלי החיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לעירוי מוח סטריאוטקסי ישיר של עמילואיד-בטא. מתודולוגיה זו מספקת מודל עכבר in vivo חלופי לטיפול בהשפעות קצרות הטווח של עמילואיד-בטא על נוירונים במוח.

עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר

MicroRNAs ממלאים תפקידים מכריעים במוח ומהווים מטרות פוטנציאליות למידול ניוון עצבי. עם זאת, הפרעה ברמות ה-miRNA היא מאתגרת בשל האורך הקצר של ה-miRNA וחוסר הנגישות של רקמת המוח. סרטון זה מציג שיטה לעיצוב אנטגומיר והעברה ספציפית למוח באמצעות נוירופפטיד בעכברים.

חלופה פשוטה להזרקת stereotactic למציאה ספציפית המוח של מירנה

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

מאמר זה מדגים את הכנת חלון הדמיה בהתאמה אישית בתוספת קנולה עירוי והשתלתו על אזור CA1 של ההיפוקמפוס בעכברים.

הליך גולגולתי להדמיית פעילויות עצביות בהיפוקמפוס של עכברים מתנהגים

חקור השפעות נוירולוגיות וקוגניטיביות של יתר-ביטוי microRNA בעכברים באמצעות הזרקת לנטיווירוס סטריאוטקטית לאזור CA1 בהיפוקמפוס. שיטה זו מאפשרת שליטה מרחבית וזמנית מלאה בביטוי הגן ובהערכת תפקודים קוגניטיביים.

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

גלה סרטונים נוספים