Name: דור של שורות תאים אנושיות יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) shRNA או ביטוי cDNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: למד ליצור שורות תאים אנושיות יציבות עם ביטוי אינדוקציבי של shRNA או cDNA בשליטת טטרציקלין. שיטה זו מאפשרת מניפולציה גנטית הפיכה בקווי תאים קשים לשינוי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל החברים במעבדה שלנו לדיונים מועילים. אנו מודים ג&#39;ואנה Lisztwan וכריסטינה Gewinner לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק BBSRC BB/I021248/1 וקרן Wellcome מענק 090090/Z/09/ZAH היא עמית קרן Wellcome מחקר פיתוח קריירה בUCL מכון הסרטן.

1. שיבוט של pcDNA6_TetR_IRES_blast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שמודגם באיור 3, לבצע עיכול חלקי של pcDNA6/TR פלסמיד (V1025-20, Invitrogen) עם הגבלת אנזימי Xba אני והמש&quot;ק להסיר את גן TetR והאמרגן של התנגדות blasticidin (BlastR) הגן. לבודד את בר 4.6 קילו הווקטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את רצף polyadenylation מגן TetR, להציג באמצעות PCR אני אתר Xho מייד לאחר קודון העצירה של TetR cDNA תוך שימור Xba האתר ב5&#39;end של cDNA. Subclone בר שנוצר לpMigR1 17 באמצעות אנזימי ההגבלה Xba ואני Xho לייצר pMigR1_TetR פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את וקטור pMigR1_TetR עם הגבלת אנזימי Xba ואני מש&quot;ק לשחרר בר TetR_IRES. לבודד את בר 1.25 הק&quot;ג להוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור 4.6 הק&quot;ג pcDNA6/TR ו1.25 ברי kb TetR_IRES. Transform מוצר הקשירה לE.coli המוסמך ולזהות את מבנה pcDNA6_TetR_IRES_blast הרצוי באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולריות סטנדרטיות. </li></ol> 2. הדור של שורות תאי יציבות הבעת TetR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 ביום, זרעי 1x10 6 תאים לכל צלחת תרבית רקמה 10-סנטימטר באמצעות מדיום הגידול הרגיל שלך (למשל DMEM בתוספת 10% FCS). זרעי שתי צלחות, אחת לtransfection עם pcDNA6_TetR_IRES_blast ואחרות כמו שליטה שלילית לבחירת blasticidin. ודא להשתמש מעבר הנמוך ביותר האפשרי ומדיום גידול המומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, transfect צלחת אחת עם 2 מיקרוגרם של pcDNA6_TetR_IRES_blast באמצעות 6 Fugene (E2691, Promega) בעקבות הוראות היצרן. אל transfect הצלחת השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להוסיף מדיום גידול המכיל סטנדרטי blasticidin 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​לשתי הצלחות. שים לב שריכוז הבחירה האופטימלית עשוי להשתנות בהתאם לקו תא נתון ואולי need שייקבע מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, לפצל את התאים ב 1/5, 1/25, 1/50 ו1 / 100 באמצעות צלחות 10-סנטימטר ובינוני צמיחה סטנדרטית המכילים 5 מ&quot;ג / המ&quot;ל blasticidin. הקפד לתייג צלחות המכילות תאי untransfected או transfected כראוי. הכן שתי צלחות לצעד דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו תאים יומיים, ולהבטיח כי כל התאים שעל צלחות untransfected מתו בתוך השבוע הראשון. שינוי תקשורת בחירה כל 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1-2 שבועות, מושבות blasticidin עמידות צריכות להתחיל להופיע. בחר צלחות המכילות 5-50 מושבות כדי להבטיח שמושבות בודדות יכולות להיות הרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהגיעו למושבות בקוטר של כ 5 מ&quot;מ (או גדול), לבודד לפחות 12 שיבוטים עצמאיים באמצעות צילינדרי שיבוט להרים מושבות בודדות. העבר כל שיבוט לתוך באר נפרד מצלחת תרבית רקמה 24 כן. כשמתלכד, לפצל את התאים מכל אחד ואחד גם לתוך היטב של צלחת תרבית רקמה 6-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך CL של התרבותאלה בתקשורת בחירה. כאשר, תאי confluent מפוצל מכל טובה לשתי בארות בודדות של צלחת תרבית רקמה 6-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שיבוט להיבדק, להקפיא באר אחת של תאים ותאי confluent קטיף ובשני לבדיקה הבאה על ידי immunoblotting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי TetR ידי מערב סופג באמצעות נוגדן חד השבטי העכבר אנטי TET02 (MoBiTec GmbH). זכור לכלול lysate של שורת תאים ההוריות כביקורת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 3 שיבוטים עם ביטוי TetR הגבוה ביותר ולהרחיב כל תרבות משובטת. הקפא מניות של כל שיבוט מבטיח בהקדם האפשרי. לבסוף, לבחון את הפרמטרים הביולוגיים המולקולריים ותא של עניין על ידי השוואה בין שורות תאים ההוריות עם שיבוטי TetR מבטאים-. בחר השיבוט &quot;הכי הטוב&quot; עם ביטוי TetR הגבוה ביותר שלא מציג את כל שינויים בפרמטרים הביולוגיים המולקולריים ותא של עניין. </li></ol> 3. בדיקת פיילוט של pTER וPT-Rex DEST30 וקטורים בטאing shRNA או cDNAs, בהתאמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור pTER פלסמיד עם מוסיף shRNA כמתואר 12. לבנות PT-רקס DEST30 וקטור (12301-016, Invitrogen) המכיל cDNA של ריבית באמצעות טכנולוגית Gateway (Invitrogen). במקרה של ביטוי cDNA, תוספת של תג לcDNA יהיה מאוחר להקל זיהוי של חלבון בטא exogenously. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transiently transfect קו תא המטרה ההורית עם pTER או PT-רקס DEST30 פלסמידים (להביע או shRNAs או cDNAs עניין) באמצעות מגיב transfection של בחירה. לבדיקה של פלסמידים ביטוי shRNA, להבטיח יעילות transfection גבוהה יכולה להיות מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר transfected תאים ותהליך לimmunoblotting באמצעות הנוגדנים המתאימים, מצפה לגילוי דלדול או ביטוי יתר של הגן של עניין שלך. </li></ol> 4. דור של שורות תאי יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) ביטוי של shRNAs או cDNAs שימוש pTER או PT-Rex DEST30 וקטורים </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 ביום, 1x10 6 תאי זרע של TetR-להביע השיבוט &#39;הטוב ביותר&#39; לצלחת 10-סנטימטר באמצעות מדיום הגידול הרגיל שלך להשלים עם סרום מוסמך טטרציקלין חינם (לדוגמה מFBS Invitrogen; 16000-014). צלחת זרע אחד לtransfection עם pTER (או PT-רקס DEST30), וצלחת אחת כשליטה שלילית לבחירה כפולה. הקפד להשתמש במעבר הנמוך ביותר האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, transfect צלחת אחת עם 2 מיקרוגרם של pTER (או PT-רקס DEST30) באמצעות 6 Fugene. אל transfect הצלחת השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להוסיף מדיום גידול סטנדרטי המכיל 5 מיקרוגרם / המ&quot;ל blasticidin ו500 מיקרוגרם / המ&quot;ל zeocin (או 1 מ&quot;ג / המ&quot;ל G418). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, לפצל את התאים ב 1/5, 1/25, 1/50 ו1 / 100 באמצעות צלחות 10-סנטימטר ובינוני צמיחה סטנדרטית המכילות 5 מיקרוגרם / המ&quot;ל blasticidin ו500 מיקרוגרם / המ&quot;ל zeocin (או 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל G418). הכן שתי צלחות לצעד דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את התאים יומיים, ולוודא כי בתוך השבוע הראשון כל התאים שעל צלחות untransfected מתו.לשנות את מדיום גידול המכיל blasticidin הסטנדרטי וzeocin (או G418) כל 3-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2-3 שבועות, blasticidin / zeocin (או blasticidin/G418) מושבות כפולות עמידות צריכות להתחיל להופיע. בחר צלחות המכילות 5-50 מושבות להרים מושבות בודדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשהגיעו למושבות בקוטר של כ 5 מ&quot;מ (או גדול), השתמש צילינדרי שיבוט להרים מושבות בודדות. מבודד לפחות 24 שיבוטים בודדים. העבר כל שיבוט לתוך באר נפרד מצלחת תרבית רקמה 24 כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוטי תרבות בריכוזי תחזוקה המכילים בינוניים של blasticidin (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) וzeocin (250 מיקרוגרם / מ&quot;ל) [או G418 (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל)]. כשמתלכד, לפצל את התאים מכל אחד ואחד גם לתוך היטב של צלחת תרבית רקמה 6-כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שיבוט להיבדק, מתחלק באחד מתלכד היטב של צלחת 6-טובה לשלוש בארות בודדות של צלחת 6-כן. כשמתלכד, להקפיא תאים מטיפוס אחד המוכר היטב. השתמש בשתי הבארות שנותרו לבדיקת tetracyclinביטוי דואר מושרה. הוסף טטרציקלין בריכוז של מיקרוגרם 1 / מ&quot;ל ​​לטיפוס אחד המוכר היטב, תוך השארת טטרציקלין גם השנייה בחינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 24-96 שעות של דגירה עם טטרציקלין, תאי קציר ותהליך לimmunoblotting באמצעות נוגדנים מתאימים. זמני דגירת טטרציקלין קצרים מומלצים כאשר מיון לאינדוקציה של ביטוי cDNA, בעוד טיפולי טטרציקלין ארוכים יותר יהיו צורך לקבוע דלדול shRNA בתיווך של חלבונים אנדוגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר לפחות שני שיבוטים עם הדלדול הרצוי / ביטוי יתר ולהרחיב כל תרבות. הקפא מניות של כל שיבוט מבטיח בהקדם האפשרי. כשגדל ט בשיבוטים לניסויים תמיד הקפד להשתמש באמצעי תקשורת בתוספת סרום טטרציקלין ללא אנטיביוטיקה ואת הבחירה המתאימה בריכוזי תחזוקה. </li></ol>

<ol><li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Gossen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+activation+by+tetracyclines+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells.</a> Science. 268, 1766-1769 (1995).</li>
<li>Elbashir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNAs+%28shRNAs%29+induce+sequence-specific+silencing+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.</a> Genes Dev. 16, 948-958 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Sui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+by+expression+of+short-interfering+RNAs+and+hairpin+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated%2C+inducible+small-interfering-RNA+vector%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li>
<li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li>
<li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NDR%2FLATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li>
<li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A%2FMST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li>
<li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

אנו מאמינים כי ט במערכות להקל על הניתוח של תפקוד הגן באופן משמעותי, במיוחד במערכות תא שקשה לתמרן ו / או כאשר גן המניפולציות הוא חיוני להישרדות תא. יתר על כן, היכולת לשלוט על ביטוי גנים על ידי ט במערכות מאוד ספציפיות מציעה את ההזדמנות ללמוד פונקציות גנטיות בשלבים שונים (לדוגמה במהלך התקדמות מחזור תא או תהליכי התמיינות מוגדרות היטב). השיטה שהוצגה כאן תאפשר לחוקרים להפיק רצוי יציב ט בשורות תאים בתוך מסגרת זמן סבירה (בדרך כלל 3-6 חודשים, במידה רבה בהתאם למידה של אפיון ביולוגי מולקולרי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> עוברי בסרום שור (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> בדוק ט החופשי </td></tr><tr><td> Blasticidin </td><td> Invivogen </td><td> נמלה-BL-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invivogen </td><td> נמלי Zn-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> מעבדות Paa </td><td> P31-011 </td><td> 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​בתקשורת </td></tr><tr><td> אנטי TET02 </td><td> MoBiTec GmbH </td><td> TET02 </td><td> השתמש ב1 / 1000 עד 1/2000 WB </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> Invitrogen </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> PT-רקס DEST30 </td><td> Invitrogen </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> טטרציקלין </td><td> סיגמא </td><td> 87128 </td><td> 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​באתנול </td></tr><tr><td> דוקסיציקלין </td><td> סיגמא </td><td> D9891 </td><td> 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​במים </td></tr><tr><td> צילינדרי שיבוט </td><td> Bellco הזכוכית בע&quot;מ </td><td> 2090-00808 </td><td> מחדש שמיש </td></tr></tbody></table>

דור של שורות תאים אנושיות יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) shrna או ביטוי cdna

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

גישה מרכזית בתחום הביולוגיה של תא יונקת היא המניפולציה של הביטוי של גנים של עניין שורות תאים נבחרות, במטרה לחשוף את אחד או כמה מתפקודו של הגן (ות) באמצעות ביטוי יתר או מציאה חולף / יציב של הגן של עניין. למרבה הצער, לחקירות ביולוגיות תאים שונות גישה זו אינה מתאימה כאשר תוצאת מניפולציות של ביטוי גנים בתאי פגמי צמיחה / שגשוג או התמיינות תאים לא רצויה. לכן, חוקרים התאימו את החלבון המדכא טטרציקלין (TetR), נלקח מE. coli התנגדות טטרציקלין 1 אופרון, לייצר מערכות ויסות יעילות מאוד וחזקות להביע cDNAs בתאי יונקי 2,3. בקיצור, TetR שונתה כדי או (1) ייזום בלוק של שעתוק באמצעות קשירה למפעיל ט (TO) באזור המקדם על תוספת של טטרציקלין (שמכונה מערכה ט הכבוי) או (2) לאגד ל לאהוא היעדר טטרציקלין (מכונה ט במערכת) (איור 1). בהתחשב באי הנוחות שהמערכה ט הפעמי דורשת נוכחות הרציפה של טטרציקלין (שבו יש זמן מחצית חיים של כ 24 שעות במדיום תרבית תאי רקמה) ט במערכת כבר מותאם באופן נרחב יותר, וכתוצאה מכך להתפתחות מאוד הדוק ומערכות וקטור יעילות לביטוי cDNA משמשות כאן. זמן קצר לאחר הקמתה של התערבות RNA (RNAi) למציאת גנים בתאי יונקים 4, וקטורים המבטאים RNAs-מכבנה קצרה (shRNAs) תוארה שפונקציה דומה מאוד לsiRNAs 5-11. עם זאת, גישות מציאת shRNA בתיווך אלה יש להם מגבלה כאסטרטגיות נוקאאוט קונבנציונליות, שכן דלדול יציב הוא לא ריאלי כאשר מטרות גנים הן חיוניות להישרדות תאים. כדי להתגבר על מגבלה זו, ואן דה Wetering et al. שונים 12 shRNA ביטוי וקטור pSUPER 5 </su&gt; P על ידי החדרה לאזור האמרגן, שאפשר להם להפיק שורות תאי יציבות עם דלדול טטרציקלין-מושרה של גני מטרת עניין שלהם. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה להפקה יציבה אדם ט בשורות תאים שיניעו מהימן או ביטוי יתר מושרה או דלדול של הגן של עניין. באמצעות שיטה זו, יש לנו נוצרו בהצלחה ט בשורות תאים אשר הקלו באופן משמעותי על הניתוח של MST / hMOB / NDR המפל בcentrosome 13,14 ואפופטוזיס איתות 15,16. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים הווקטורים של בחירה שלנו, בנוסף לתיאור שני שלבי המניפולציה הרצופים הנדרשים ביעילות כדי ליצור אדם ט בשורות תאים (איור 2). יתר על כן, מלבד מתאר פרוטוקול עבור הדור של אדם ט בשורות תאים, נדונו היבטים קריטיים לגבי הנהלים הטכניים והאפיון של ט בתאים.

דוגמה לאפיון הראשוני של-1 RPE שורות תאי יציבות מבטאות TetR מוצגת באיור 4. שים לב כי כל שיבוטי רשתית-1 מביעים רמות שונות של TetR (השווה נתיבים 2 ו 5), ואילו קו התא ההורי (המשמש כשליטה שלילית) אינו מבטא את חלבון TetR אקסוגני (איור 4, 1 נתיב). וריאציה זו בביטוי TetR בין הרשתית-1 ט על שיבוטים סלולריים צפויה, שכן הביטוי של TetR להביע פלסמידים תלוי מאוד באתר האינטגרציה פלסמיד. האפיון י...

דרך מהירה ופשוטה ליצירת שורות תאים אנושיות עם מושרה וביטוי יתר הפיך cDNA או shRNA בתיווך עקום למטה של ​​הגן של עניין. שיטה זו מאפשרת לחוקרי שורות תאים ואמינים ביותר reproducibly מניפולציות שקשה לשנות בשיטות transfection חולפות או אסטרטגיות קונבנציונליות מציאה / נוקאאוט.

דור של שורות תאים אנושיות יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) shRNA או ביטוי cDNA

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ליצור שורות תאים אנושיות יציבות עם ביטוי של S-H-R-N-A או CDNA המושרה על ידי טטרהציקלין. ראשית, בצע טרנספקציה לתאי המטרה באמצעות פלסמיד הביטוי tatar ובצע סלקציה לעמידות לבלסטוצידין. לאחר מכן, בחר מושבות בודדות ובצע סריקה לאיתור תאים המבטאים באופן יציב את חלבון הדיכוי Tet.בשלב הבא, בצע טרנספקציה לשיבט המבטא את teta הטוב ביותר באמצעות פלסמידים שנועדו לווסת את ביטוי הגן מטרה תחת בקרת אלמנט התגובה של Tet בתרבית. לאחר ביצוע סלקציה כפולה לתאים שעברו טרנספקציה, בחר מושבות בודדות ובצע סריקה לאיתור שיבוטי Teton הרצויים באמצעות western blotting. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיבוטי Teton שהתקבלו כדי לבחון את השפעתם של מטרות ספציפיות על פרמטרים ביולוגיים נבחרים.הדגמה של הפרוצדורה תבוצע על ידי פוסט-דוקטורנט במעבדה, Marty Gomez Martinez. ייצר וקטור המניע ביטוי של ה-Tet Repressor ושל הגן לעמידות ל-Blain מאותו מקדם CMV. בשתי צלחות תרבית רקמה של 10 סנטימטר, זרע באופן מרכזי את התאים בתווך גידול סטנדרטי: צלחת אחת לטרנספקציה עם פלסמיד ביטוי של tatar, והשנייה כביקורת שלילית לברירה ל-Blain. למחרת, בצע טרנספקציה לאחת הצלחות עם 2 µg של פלסמיד ביטוי TTA באמצעות FU gene six.פעלו לפי הוראות היצרן, ולאחר מכן דגרו את התרבית למשך לילה לצד שתי הצלחות. לאחר 24 שעות, הוסיפו מצע גידול סטנדרטי המכיל את הריכוז האופטימלי של blastin עבור שורת התאים הניסיונית שבה נעשה שימוש; אספו את התאים, סמנו צלחות של 10 סנטימטר עבור דילול סדרתי, והמשיכו לפזר כפילויות של הדילול הסדרתי באמצעות מצע גידול סטנדרטי המכיל 5 µg/mL blastin. וודאו שסימנתם כראוי את הצלחות המכילות את התאים הלא-טרנספקטים או את התאים הטרנספקטים. עקבו אחר התאים, תוך שימת לב מיוחדת לכך שכל התאים בצלחות הלא-טרנספקטות מתו במהלך השבוע הראשון.יש להחליף את מצע הברירה מדי יומיים עד שלושה ימים לאחר שבוע עד שבועיים, כאשר מופיעות מושבות העמידות לבלסטרסוצין (blasticidin). יש לבחור צלחות המכילות בין חמש ל-50 מושבות, כדי להבטיח שניתן יהיה לבודד מושבות בודדות כאשר הן יגיעו לקוטר של כחמישה מילימטרים. יש לבודד לפחות 12 שיבוטים (clones) עצמאיים באמצעות צילינדרי שיבוט לבחירת מושבות בודדות.העבירו כל שיבט לבאר נפרדת בלוחית תרבית של 24 בארות וגדלו את התאים עד להגעה למצב של התלכדות (confluence). קצרו והעבירו את התאים מכל מושבה לבארות בודדות בלוחית תרבית רקמות של שש בארות. המשיכו לגדל את השיבטים במצע ברירה כאשר התרביות מגיעות למצב של התלכדות.חלקו את התאים מכל באר לשתי בארות בודדות בתוך פלטת תרבית רקמות בעלת שש בארות. עבור כל שיבט שייבדק, הקפיאו באר אחת של תאים שהגיעו למצב של התלכדות (confluence). אספו את התאים מהבאר השנייה, לצורך הערכת ביטוי של חלבון tatar.בצע וסטרן בלוט (western blot) על השיבטים תוך שימוש בליזט של שורת התאים ההורית כביקורת שלילית לצורך זיהוי חלבון tatar. השתמש בנוגדן monoclonal anti Tet zero two מעכבר. המשך להרחבת שלושת השיבטים בעלי ביטוי ה-testar הגבוה ביותר.הקפיאו מלאים של כל שיבט מבטיח בהקדם האפשרי. כעת התאים השיבטיים מוכנים לבחינת הפרמטרים המולקולריים והתאיים הרלוונטיים עבורכם. על ידי השוואת שורות התאים ההוריות לשיבטים המבטאים tatar, בחרו את השיבט הטוב ביותר עם ביטוי tatar הגבוה ביותר שאינו מראה שינויים כלשהם בפרמטרים המולקולריים והביולוגיים התאיים הרלוונטיים.ייצרו פלסמידי PTER עם מקטעי HRNA רלוונטיים. בנו בנוסף וקטור PT REX desk 30 המכיל את ה-CDNA הרלוונטי באמצעות טכנולוגיית gateway. בצעו טרנספקציה זמנית לשורת תאי המטרה ההורית עם פלסמידי PTER או P T-Rex S 30.השתמשו בריאגנטים לטרנספקציה לפי הבחירה. לאחר מכן, קצרו את התאים שעברו טרנספקציה והעריכו את ביטוי הגן מטרה באמצעות אימונו-בלוסינג (immuno blossoms). ביום הראשון, זרעו שתי צלחות של השיבט בעל ביטוי ה-tatar הטוב ביותר במצע גידול סטנדרטי בתוספת תרבית סרום מאושרת נטולת טטרציקלין למשך הלילה.ביום למחרת, בצע טרנספקציה של פלטה אחת בלבד עם two micrograms של פלסמיד ביטוי A-S-H-R-N-A או CDNA באמצעות FU gene six. ביום השלישי, הוסף מצע גידול סטנדרטי המכיל או five micrograms per milliliter blastin ו-500 micrograms per milliliter eosin, או blastin ו-G four 18. לאחר מכן, ביום הרביעי, פצל את התאים כדי ליצור פלטות כפולות של דילולות באמצעות מצע גידול סטנדרטי לצורך סלקציה כפולה.בדוק את התאים מדי יום כדי לעקוב אחר תגובת מוות של התאים לטיפול באנטיביוטיקה, והחלף את המצע כל שלושה עד ארבעה ימים. לאחר שבועיים עד שלושה שבועות, כאשר תתחיל להופיע מושבות עמידות כפולה ל-blaster aside in zein או ל-blaster aside in G four 18.יש לבחור את הצלחות המכילות בין 5 ל-50 מושבות כדי לבודד מושבות בודדות לתרבית, עד שהמושבות יגיעו לקוטר של כ-5 מילימטרים או יותר. באמצעות צילינדרי שיבוט, יש לבחור ולהעביר מושבות בודדות לבארים נפרדות של פלטת תרבית רקמות בעלת 24 בארות. יש לגדל את השיבוטים במצע המכיל ריכוזי תחזוקה של 5 µg/mL blaR, soin, ו-50 µg/mL.אוסין או blaster soin ו-G four 18. כאשר התאים מגיעים למספר גבוה (confluent), העבירו את התאים מכל באר לבאר אחת בצלחת תרבית רקמות של 6 בארות. כאשר התאים מגיעים למספר גבוה, פצלו את התאים לשלוש בארות בצלחת של 6 בארות כדי לגדלם עד להגעה ל-100% confluence.הקפיאו את התאים מבאר אחת לבדיקת ביטוי הניתן להשראה; הוסיפו 1 µg/mL tetracycline לבאר אחת והשאירו את הבאר השנייה של התאים ללא תוספת. דגרו ללא tetracycline למשך 24 עד 96 שעות, כאשר זמנים קצרים יותר ישמשו לסריקת השראה של ביטוי CD NA וזמנים ארוכים יותר לקביעת דילול של חלבונים אנדוגניים המתווך על ידי S-H-R-N-A. לאחר מכן, קצרו את התאים ועבדו אותם ל-immuno blossoming באמצעות הנוגדנים המתאימים.בחרו לפחות שני שיבוטים בעלי הדללה או ביטוי-יתר רצויים והרחיבו כל תרבית. זכרו להקפיא מאגרים (stocks) של כל שיבוט מבטיח בהקדם האפשרי. אפיון ראשוני זה של שורת תאי אפיתל רטינליים אנושיים לביטוי יציב של tatar מראה כי כל שיבוטי ה-RPE one מבטאים רמות משתנות של tatar.כמצופה, שלב התאים ההורי RPE one אינו מבטא את חלבון ה-tatar החיצוני. השונות בביטוי של Tet R בקרב שיבוטי תאי RPE one Teton משקפת את אתרי השילוב של הפלסמיד. ניסוי זה מאפיין שיבוטי תאי RPE one Teton יציבים המבטאים RNA המכוון נגד MST three kinase three; שלושה שיבוטי תאים נבחרו להמשך הניתוח.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק שורות תאים אנושיות יציבות עם ביטוי לא מווסת של ה-RNA או ה-CDNA הרלוונטי למחקרכם.

generation-stable-human-cell-lines-with-tetracycline-inducible-tet-on

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תרומתו של גורם שיפוץ הכרומטין ACF למוות של תאי E4orf4 מושרה נמדדה. הפרוטוקול כולל מבחר של שיבוטים של תאים שבם טיפול דוקסיציקלין גורם מציאה מותנית של ACF יחידות המשנה Acf1 וSNF2h, ולהשתמש של assay DAPI למדוד מות תאים E4orf4 מושרה בשורות התאים מושרות.

הכנה של קווים סלולריים למציאה מותנית של ביטוי גנים ומדידה של השפעות על מציאת מות תאי E4orf4-induced

סרטון זה מדגים את מערכת ביטוי הגנים טטרציקלין, או Tet-On, במודל עכבר. בנוכחות דוקסיציקלין, נגזרת טטרציקלין, מערכת טט-און המורכבת מחלבון טרנסאקטיבטור מבוקר טטרציקלין הפוך מופעלת ומביעה את הגן המעניין.

ביטוי גנים מבוסס מערכת מושרה Tet-On ב- Vivo: מערכת ביטוי גנים המושרה על ידי טטרציקלין להפעלת שעתוק גני מטרה במודל עכבר

סרטון זה מתאר את השיטה של ויסות ביטוי גנים בתאים בתרבית על ידי טרנספקציה עם פלסמיד המכיל גן מעניין ופלסמיד רגולטורי. הביטוי של פלסמיד זה יכול להיות נשלט על ידי טטרציקלין או אנלוגים סינתטיים שלה, מה שהופך את המערכת הזאת מודל שימושי ללמוד ביטוי גנים מוסדר.

Inducible Tet-Off Regulatable System: שיטה במבחנה לווסת ביטוי גנים בתאים בתרבית באמצעות מערכת טטרציקלין-אוף

כאן, אנו משתמשים התמרה retroviral וtransfection concatemeric כדי ליצור שורת תאים שיכולים לבטא את הרכיבים של וקטור lentiviral (LV) בהיעדר טטרציקלין. זה LV מקודד GFP וPseudotyped עם גליקופרוטאין, SVGmu, שהוא ספציפי לקולטן על תאים דנדריטים.

שורת תאי טטרציקלין מוסדר מייצרת וקטורי lentiviral גבוה כייל שמתמקדים תאי דנדריטים

בזאת אנו מתארים שיטה חדשנית להפקה לקולטנים המצויים בתאי T אנטיגן ספציפי (TCRs) על ידי התאמת TCRα או TCRβ של TCR קיים, שהוא בעל אנטיגן-הסגולי של עניין, עם hemichain המשלים של רפרטואר קולטן תא ההיקפי T. TCRs שנוצר דה נובו לשמר אנטיגן-סגולי עם משתנה זיקה.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

פרוטוקול זה משמש ערכה עבור הגדרת מערכת תפקודית ט-על שורות תאים סרטן והשימוש עוקבות, בפרט ללמוד את התפקיד של גידול נגזר התא חלבונים בגיוס ומונוציטים/מקרופאגים כדי microenvironment הגידול.

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפתח מערכת inducible דומיננטה-שלילי, שבו כל חלבון יכול להיות מותנה מומת על ידי הפיכה overexpressing גרסה מוטציה דומיננטית-שלילי של זה.

עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)

כאן, אנו מציגים כלי שניתן להשתמש בו כדי ללמוד את אפנון posttranscript של תעתיק בתאי אפיתל הראשי מכתשיים באמצעות מערכת ביטוי inducible בשילוב טכניקה אלקטרופורציה פיפטה.

יעיל טראנסקריפט מבוקרת פלמיד ביטוי מערכת לחקירת היציבות של התעתיקים mRNA בתוך הראשי מכתשי אפיתל תאים

בפרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת נוק-דאון מותנית ואסה היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד את ההשפעה של clusterin על הגבעול של GCSCs נגזר המטופל. הפרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות ללמוד הן במבחנה והן בתפקוד vivo של גנים הקשורים לגזע בסוגים שונים של CSCs.

נוק-דאון מותנה משולב ואסא היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד גן הקשורים לגזע של תאי גזע נגזר סרטן הקיבה נגזר

למד ליצור שורות תאים אנושיות יציבות עם ביטוי אינדוקציבי של shRNA או cDNA בשליטת טטרציקלין. שיטה זו מאפשרת מניפולציה גנטית הפיכה בקווי תאים קשים לשינוי.

דור של שורות תאים אנושיות יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) shRNA או ביטוי cDNA

גלה סרטונים נוספים