הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע ולהעריך ניסויים בהעברת גנים באמצעות ננו-חלקיקים פולימריים לא ויראליים. זה מושג על ידי טרנסקטציה ראשונה של תאים עם חלקיקי העברת גנים. לאחר מכן מוערכת יעילות הטרנספקציה על ידי מיקרוסקופיה וניתוח ציטומטריית זרימה בתפוקה גבוהה.

לאחר מכן, ריכוז התפלגות גודל הננו-חלקיקים והפלסמידים לחלקיק נקבעים באמצעות מכשיר ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. בסופו של דבר, שיטה זו מאפשרת אפיון גודל ננו-חלקיקים, ויעילות טרנספקציה באמצעות ננו-חלקיקים. היתרון העיקרי בשימוש בננו-חלקיקים פולימריים מתכלים להעברת גנים הוא שהם יכולים להיות בטוחים ויעילים יותר משיטות העברת גנים אחרות.

היתרון העיקרי של ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים על פני שיטות קיימות כמו פיזור אור דינמי הוא שניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים נותן ישירות את ההתפלגות הממוצעת של המספר ואת ריכוז החלקיקים. שיטה זו תעזור לענות על שאלות מפתח בתחום העברת הגנים הלא ויראליים, כגון מספר הפלסמידים לחלקיק, החשוב למחקרי ביטוי משותף. הפרוטוקול הבא מודגם באמצעות תאי אנדותל רשתית אנושיים או hre כתאי מודל ואסטרי אמינו פולי בטא או PBA AEs כפולימרים מודלים.

שימו לב שייתכן שיהיה צורך להתאים את תנאי התרבית והממיסים בהתאם לתאים ולפולימרים שבהם נעשה שימוש 24 שעות לפני כן. טרנספקציה. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לזרוע ארנבת לתוך תרבית רקמה שקופה שטופלה שטוחה. צלחות באר תחתונות 96 בריכוז של 25 עד 50 תאים למיקרוליטר.

זה ייתן 70 עד 80% שטף ביום ההעברה, הכינו ותתייג תרבית ברורה שאינה רקמה מטופלת. 96 צלחות באר שישמשו כצלחות מאסטר להכנה ודילול ה- PBA וה- DNA. יוכנו שתי צלחות זהות.

אחד להערכת רעילות ואחד להערכת יעילות הטרנספקציה. עקוב אחר פולי בטא אמינו אסטר או פולימר PVAE ופתרונות מלאי P-E-G-F-P-N 1D NA בטמפרטורת החדר. לאחר הגידול, השתמש בפיפטה של 12 תעלות להכנת באר המכילה 50 מיקרוליטר של 0.06 מיליגרם למיליליטר DNA במאגר נתרן אצטט של 25 מילי-מולרי לכל מצב.

לאחר מכן באותה צלחת, יש לדלל את פולימרי ה-PBAE ל-10 מיליגרם למיליליטר במאגר נתרן אצטט. לאחר מכן יש לדלל עוד יותר את פולימרי ה-PBAE ליחסי משקל פולימר למשקל DNA של 30 ו-60 ו-50 מיקרוליטר של מאגר נתרן אצטט. להיווצרות ננו-חלקיקים, השתמש בפיפטה של 12 ערוצים כדי לשלב את 50 המיקרוליטרים של PBA מדולל עם 50 מיקרוליטר של DNA פלזמה מדולל מעורבב במרץ על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

לאחר מכן הניחו לתערובת לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר הרכבה עצמית. לאחר הרכבה עצמית, השתמש בפיפטה של 12 ערוצים כדי להוסיף 20 מיקרוליטר של תמיסת הננו-חלקיקים טיפתית לכל באר של התאים הזרעים המכילים ארבע בארות בינוניות לכל מצב כפי שמוצג בתרשים זה. עבור כל צלחת, שמור לפחות ארבע בארות לכל אחד מהבקרות השליליות והחיוביות.

בקרה שלילית מורכבת מתאים לא מטופלים ובקרות חיוביות, מורכבות מתאים שהועברו עם מגיב זמין מסחרי כגון lipo 2000 או Fuge hd. דגרו את הצלחות עם התאים המועברים ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לאחר הדגירה, השתמשו בפיפטה של 12 תעלות כדי להסיר את המדיום מהתאים ולהחליף אותו ב-100 מיקרוליטר לבאר של ארנבת טרייה. דגירה בינונית למשך 24 עד 48 שעות נוספות.

למחרת, הוציאו צלחת אחת מהחממה. העריכו טרנספקציה ורעילות תאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, וכימו את רעילות התא באמצעות טיטר התא 96 מימי מבחן אחד כמתואר בטקסט הנלווה. לאחר 48 שעות, הוציאו את הצלחת השנייה מהחממה.

להעריך את יעילות הטרנספקציה על ידי פלואורסצנטיות, מיקרוסקופיה וזרימה ציטומטרית כמתואר בטקסט הנלווה. השתמש בנתוני הרעילות והטרנספקציה שנרכשו כאן כדי לקבוע את הריכוזים האופטימליים של PBAs לשימוש בניסויים עתידיים. אתר הננו NS 500 הוא מכשיר לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים שיכול לספק מידע על התפלגות הגודל של דגימת ננו-חלקיקים על ידי מעקב אחר הדיפוזיה של ננו-חלקיקים בודדים לפני השימוש במערכת הנוזלית של אתר הננו בצינור מיקרו צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר.

הכן את ה-PBA וה-DNA של הפלזמה לניתוח כמו קודם באותם ריכוזים ששימשו בחלק הקודם של סרטון זה. לאחר הרכבה עצמית, יש לדלל את תמיסת הננו-חלקיקים פי 100 ב-PBS בשפופרת חדשה של 1.5 מיליליטר כדי לקבל נפח סופי של לפחות 500 מיקרוליטר. זה יניב ריכוז ננו-חלקיקים בטווח המתאים לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים.

לאחר מכן, טען את הדגימה לאתר הננו. הקפד לא להכניס בועות אוויר שנבדקו ויזואלית כדי לוודא שיש בין 20 ל -100 חלקיקים על המסך. מספר אידיאלי למעקב אחר ננו-חלקיקים הוא כ-50 חלקיקים.

אם יש יותר מדי או מעט מדי, שטוף את ה-NS 500, כוונן את הדילול ל-PBS וטען מחדש את הדגימה. אם מספר החלקיקים על המסך הוא בין 20 ל -100 צלם סרטונים. לאחר צילום הסרטונים, המשך לשלב העיבוד על ידי פתיחת קובץ וידאו באותה תוכנה.

לאחר מכן, לאחר פתיחת הקובץ, הגדל את רווח המסך. בחר את ההתאמה האוטומטית לפרמטרי התמונה בלחיצה על התיבות המתאימות. אם חלקיק על המסך מזוהה על ידי התוכנה, הוא יסומן בצלב אדום.

לאחר סימון כל החלקיקים, לחץ על כפתור התהליך בתוכנה כדי לעבד את קובץ הווידאו. לאחר מכן יוצגו גודל החלקיקים, ממוצעי גודל ההתפלגות וריכוז החלקיקים כדי לוודא שספירת החלקיקים מדויקת. חזור על הליך זה באמצעות אותה דגימה מדוללת בשניים x וארבע.

מט"ח ב- PBS apre הועבר עם ננו-חלקיקי E-G-F-P-P-B-A-E כפי שמוצג בסרטון זה. כדי להעריך חזותית את יעילות הטרנספקציה, בוצעה הדמיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תמונות אלה מציגות את שדה הבהירות הקרינה והתמונות הממוזגות של התאים הטרנספטנטיים כפי שניתן לראות בתמונה הממוזגת, רוב התאים מבטאים EGFP ושומרים על מורפולוגיה תקינה.

כדי לכמת את יעילות הטרנספקציה בוצעה ציטומטריית זרימה כפי שניתן לראות באיור זה לאחר שער על האוכלוסייה החיה. האוכלוסייה שלא נכרתה לא הכילה תאים חיוביים ל-EGFP. עם זאת, 71.6% מהתאים שטופלו היו חיוביים לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים באתר EGFP שימש לאחר מכן לקביעת התפלגות וריכוז גודל הננו-חלקיקים.

לצורך ניתוח זה, חשוב שהתפלגות גודל החלקיקים תהיה פיזור מונו. באמצעות מידע זה, ניתן לחשב את המספר הממוצע של פלסמידים לחלקיק על ידי חלוקת ריכוז הפלסמידים בתמיסה בריכוז החלקיקים שנקבע על ידי NS 500. מספר הפלסמידים לחלקיק הוא התפלגות המשקפת את התפלגות גודל החלקיקים.

בתוך הדגימה, יהיו חלקיקים גדולים יותר עם הפלסמידים לערך חלקיק גדול מהממוצע, כמו גם חלקיקים קטנים יותר עם הפלסמידים הנמוכים יותר לערך חלקיק מהממוצע. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לאפשר לפולימרים מתכלים להישאר בממס מימי זמן רב מדי לפני הוספת ננו-חלקיקים לתאים לשימוש ב-ncy, להתאים את הדילול המתאים לגודל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר סוגי תאי היצמדות עם פולימרים להעברת גנים לא ויראליים, כמו גם למדוד את יעילות הטרנספקציה, כמו גם את התפלגות גודל החלקיקים.

אל תשכח שעבודה עם תאים אנושיים היא מסוכנת ביולוגית. ללבוש תמיד ציוד מגן אישי ועבוד בארון בטיחות ביולוגית בזמן ביצוע הליך זה.