הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע ולהעריך ניסויי העברת גנים באמצעות ננו-חלקיקים פולימריים לא-ויראליים. זאת על ידי ביצוע טרנספקציה של תאים עם חלקיקי העברת גנים, ולאחר מכן הערכת יעילות הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופיה ואנליזה של ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) בעלת תפוקה גבוהה.

בשלב הבא, נקבעים פיזור הגדלים של הננו-חלקיקים, ריכוזם ומספר הפלסמידים לכל חלקיק באמצעות מכשיר לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (nanoparticle tracking analysis). בסופו של דבר, שיטה זו מאפשרת לאפיין את גודל הננו-חלקיקים ואת יעילות הטרנספקציה באמצעותם. היתרון המרכזי בשימוש בננו-חלקיקים פולימריים מתכלים ביולוגית להעברת גנים הוא שהם עשויים להיות בטוחים ויעילים יותר משיטות אחרות להעברת גנים.

היתרון המרכזי של ניתוח מעקב אחר ננוחלקיקים (nanoparticle tracking analysis) על פני שיטות קיימות כמו פיזור אור דינמי הוא שניתוח מעקב אחר ננוחלקיקים מספק באופן ישיר את התפלגות ממוצע המספר ואת ריכוז החלקיקים. שיטה זו תסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום העברה של גנים לא-ויראליים, כגון מספר הפלסמידים לכל חלקיק, דבר החשוב למחקרי ביטוי משותף (co-expression). הפרוטוקול הבא מודגם באמצעות תאי אנדותל של רשתית אנושית או hre כתאי מודל, ופולי בטא-אמינו אסטרים או PBA AEs כפולימרים מודל.

שימו לב כי ייתכן שיהיה צורך להתאים את תנאי התרבית ואת הממסים בהתאם לתאים ולפולימרים שנעשה בהם שימוש 24 שעות לפני הטרנספקציה. השתמשו בפיפט רב-ערוצי להזרעת התאים לתוך פלטות 96 באריגים בעלות תחתית שטוחה שעברו טיפול לתרביות רקמה, בריכוז של 25 עד 50 תאים ל-µL.

זה יניב 70% עד 80% נזילות (fluency) ביום הטרנספקציה; הכין וסמן פלטות שקופות של 96 בארות שאינן מטופלות לתרביות רקמה, שישמשו כפלטות מאסטר להכנה ודילול של ה-PBA וה-DNA. יש להכין שתי פלטות זהות.

אחד להערכת רעילות ואחד להערכת יעילות הטרנספקציה. השתמשו בתמיסות המלאי של הפולימר poly beta amino ester או PVAE ו-P-E-G-F-P-N 1D NA בטמפרטורת החדר. לאחר השקיקה, השתמשו בפיפט 12 ערוצים כדי להכין באר המכילה 50 µL של 0.06 mg/mL DNA בבופר sodium acetate בריכוז 25 mM עבור כל תנאי.

בשלב הבא באותו לוח, דללו את פולימרי ה-PBAE לריכוז של 10 milligrams per milliliter בבופר נתרן אצטט. לאחר מכן, דללו את פולימרי ה-PBAE ליחסים של משקל פולימר למשקל DNA של 30 ו-60, בתוך 50 microliters של בופר נתרן אצטט. ליצירת ננו-חלקיקים, השתמשו בפיפט עם 12 ערוצים כדי לשלב את 50 microliters של ה-PBA המדולל עם 50 microliters של DNA פלסמה מדולל, תוך ערבוב נמרץ על ידי פיפוט למעלה ולמטה.

לאחר מכן, יש להדגיר את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר הרכבה עצמית. לאחר ההרכבה העצמית, השתמשו בפיפטה של 12 ערוצים כדי להוסיף 20 µL של תמיסת הננו-חלקיקים בטיפות לכל באר של התאים הזרועים המכילה מצע גידול; טרנספקטו ארבע בארות עבור כל תנאי, כפי שמוצג בתרשים זה. עבור כל פלטה, שמרו לפחות ארבע בארות עבור כל אחד מהביקורות השליליות והחיוביות.

ביקורת שלילית מורכבת מתאים שאינם מטופלים, וביקורות חיוביות מורכבות מתאים שעברו טרנספקציה באמצעות ריאגנט זמין מסחרית כגון lipo 2000 או Fuge hd. דגרו את הפלטות עם התאים שעברו טרנספקציה בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה, השתמשו בפיפט רב-ערוצי (12 ערוצים) כדי להסיר את המצע מהתאים והחליפו אותו ב-100 µL למבבור של מצע hre טרי. דגרו למשך 24 עד 48 שעות נוספות.

ביום למחרת, הוצא פלטה אחת מהאינקובטור. העריך את יעילות הטרנספקציה של התאים ואת הרעילות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, וכמת את רעילות התאים באמצעות בדיקת cell titer 96 aqueous one כפי שמתואר בטקסט המצורף. לאחר 48 שעות, הוצא את הפלטה השנייה מהאינקובטור.

העריכו את יעילות הטרנספקציה באמצעות פלואורסצנציה, מיקרוסקופיה וציטומטריה של זרימה כפי שמתואר בטקסט הנלווה. השתמשו בנתוני הרעילות והטרנספקציה שהושגו כאן כדי לקבוע את הריכוזים האופטימליים של PBAs לשימוש בניסויים עתידיים. ה-nano site NS 500 הוא מכשיר לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (nanoparticle tracking analysis) שיכול לספק מידע על התפלגות הגדלים של דגימת ננו-חלקיקים על ידי מעקב אחר הדיפוזיה של ננו-חלקיקים בודדים; לפני השימוש, בצעו ה priming למערכת הפלואידית של ה-nano site בתוך מבחנה של micro centrifuge בנפח 0.5 milliliter.

הכינו את ה-PBA ואת ה-plasma DNA לאנליזה כפי שנעשה קודם לכן, בריכוזים ששימשו בחלק הקודם של סרטון זה. לאחר ההרכבה העצמית, דללו את תמיסת הננו-חלקיקים פי 100 ב-PBS בתוך מבחנה חדשה של 1.5 מיליליטר כדי להגיע לנפח סופי של לפחות 500 microliters. פעולה זו תביא לריכוז ננו-חלקיקים בטווח המתאים לניתוח מעקב ננו-חלקיקים.

כעת, טענו את הדגימה אל אתר הננו. הקפידו שלא להכניס בועות אוויר; בדקו חזותית שעל המסך מופיעים בין 20 ל-100 חלקיקים. מספר אידיאלי למעקב אחר ננו-חלקיקים הוא כ-50 חלקיקים.

אם ישנם יותר מדי או מעט מדי, שטפו את ה-NS 500, התאימו את הדילול ב-PBS וטענו מחדש את הדגימה. אם מספר החלקיקים על המסך הוא בין 20 ל-100, צלמו סרטוני וידאו. לאחר צילום הסרטונים, עברו לשלב העיבוד על ידי פתיחת קובץ וידאו באותה תוכנה.

לאחר פתיחת הקובץ, הגבירו את הגבר המסך (screen gain). בחרו בהתאמה אוטומטית של פרמטרי התמונה על ידי סימון התיבות המתאימות. אם התוכנה תזהה חלקיק על המסך, הוא יסומן בתוו X אדום.

לאחר שכל החלקיקים סומנו, לחצו על כפתור העיבוד (process) בתוכנה כדי לעבד את קובץ הווידאו. גודל החלקיקים, ממוצעי התפלגות הגדלים וריכוז החלקיקים יוצגו לאחר מכן כדי לוודא שספירת החלקיקים מדויקת. חזרו על הליך זה באמצעות אותה דגימה המדוללת פי שניים ופי ארבעה.

תאי Forex ב-PBS עברו טרנספקציה עם ננו-חלקיקי E-G-F-P-P-B-A-E כפי שמוצג בסרטון זה. כדי להעריך חזותית את יעילות הטרנספקציה, בוצע דימוי במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תמונות אלו מציגות את הדימויים הפלואורסצנטיים, בשדה בהיר (brightfield) והתמונות הממוזגות של התאים שעברו טרנספקציה; כפי שניתן לראות בתמונה הממוזגת, רוב התאים מבטאים EGFP ושומרים על מורפולוגיה תקינה.

כדי לכמת את יעילות הטרנספקציה, בוצעה ציטומטריית זרימה כפי שניתן לראות בדמות זו לאחר סינון (gating) של אוכלוסיית התאים החיים. האוכלוסייה שלא עברה השבחה לא הכילה תאים חיוביים ל-EGFP. עם זאת, 71.6% מהתאים המטופלים היו חיוביים ל-EGFP. לאחר מכן נעשה שימוש בניתוח מעקב ננו-חלקיקים (Nanoparticle tracking analysis) כדי לקבוע את התפלגות הגדלים ואת ריכוז הננו-חלקיקים.

עבור ניתוח זה, חשוב שההתפלגות של גודל החלקיקים תהיה מונו-דיספרסית. באמצעות מידע זה, ניתן לחשב את המספר הממוצע של פלסמידים לכל חלקיק על ידי חלוקת ריכוז הפלסמידים בתמיסה בריכוז החלקיקים שנקבע באמצעות ה-NS 500. מספר הפלסמידים לכל חלקיק הוא התפלגות המשקפת את התפלגות גודל החלקיקים.

בתוך הדגימה, יהיו חלקיקים גדולים יותר שערך הפלסמידים לכל חלקיק שלהם גבוה מהממוצע, וכן חלקיקים קטנים יותר שערך הפלסמידים לכל חלקיק שלהם נמוך מהממוצע. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שלא להשאיר פולימרים הניתנים לפירוק בממס מימי למשך זמן רב מדי לפני הוספת הננוחלקיקים לתאים; לצורך שימוש ב-ncy, התאימו את הדילול בהתאם לגודל החלקיקים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לבצע טרנספקציה לסוגי תאים נצמדים באמצעות פולימרים למסירת גנים לא-ויראלית, וכן כיצד למדוד את יעילות הטרנספקציה ואת התפלגות גודל החלקיקים.

זכרו כי עבודה עם תאים אנושיים כרוכה בסיכון ביולוגי. עליכם ללבוש תמיד ציוד מיגון אישי ולעבוד בתוך קבিনে בטיחות ביולוגית בעת ביצוע פרוצדורה זו.