מבוא לצנטריפוגה

הצנטריפוגה היא מכשיר המשמש כמעט בכל מעבדת מחקר ביו-רפואית ברחבי העולם.

צנטריפוגציה היא תהליך שבו נעשה שימוש בצנטריפוגה כדי להפריד רכיבים של תערובת מורכבת.

על ידי סבב של דגימות מעבדה במהירויות גבוהות מאוד, רכיבי תערובת נתונה נחשפים לכוח צנטריפוגלי, הגורם לחלקיקים צפופים יותר לנדוד הרחק מציר הסיבוב ולחלקיקים קלים יותר לנוע לעברו. חלקיקים אלו יכולים לשקוע בתחתית המבחנה במה שמכונה pellet, ודגימה מבודדת זו, או התמיסה שנותרה, ה-supernatant, יכולים לעבור עיבוד או ניתוח נוספים.

הרכיב העיקרי של צנטריפוגה הוא הרוטור, שהוא החלק הנע המסתובב במהירויות גבוהות.

רוטורים יכולים להיות קבועים במקומם, או שצנטריפוגה יכולה להשתמש במספר רוטורים המקובעים מעל חלק הנקרא הציר (spindle).

בדרך כלל, לרוטור של הצנטריפוגה יהיה מכסה המהודק היטב כדי למנוע מהדגימות לעוף החוצה.

בצנטריפוגות רבות תהיה יחידת קירור המאפשרת לשלוט בטמפרטורה הפנימית במהלך הסבוב.

כמו כן, יש להן כפתורים או כפתורי סיבוב להזנת הפרמטרים לכל הרצה, אשר יכולים לכלול את משך הסבוב, הטמפרטורה, ועוצמת הסבוב במונחים של מהירות או כוח יחסי.

מהירות הסבוב נמדדת כ-RPM, או סיבובים לדקה. RPM הוא ערך מורכב, כיוון שלא מהירות הצנטריפוגה היא שגורמת לחלקיקים להיפרד מתערובת, אלא הכוח הפועל על חלקיקים אלה.

הכוח הפועל על חלקיק קשור לרדיוס של רוטור הצנטריפוגה, ומכיוון שלצנטריפוגות שונות יש גדלי רוטור שונים, כוחות שונים יכולים להיות מופעלים באותה מהירות, או RPM.

ניתן לכמת את עוצמת הצנטריפוגציה גם ככוח צנטריפוגלי יחסי, או RCF. RCF מוצג בדרך כלל כמכפלה של תאוצת הכבידה של כדור הארץ.

RCF מבוטא כמכפלה של רדיוס הרוטור בריבוע המהירות הזוויתית, חלקי תאוצת הכבידה של כדור הארץ.

ניתן לקשר בין RCF ל-RPM באמצעות המשוואה הבאה, כאשר r מייצג את רדיוס הצנטריפוגה הנמדד בסנטימטרים.

שימוש במשוואה זו יכול להיות ההבדל בין ניסוי שנכשל לניסוי מוצלח, אך אין צורך להחיל חישוב זה עבור כל פרוטוקול חדש. צנטריפוגות מגיעות לעיתים קרובות עם נומוגרמות שיכולות לסייע בהמרה של RCF ל-RPM בקלות רבה. השתמשו בסרגל כדי לחבר בין רדיוס הצנטריפוגה לערך RPM נתון, כדי לקבל את ה-RCF.

לפני תחילת סבב הצנטריפוגה של הדגימות, יש להתחשב בטמפרטורה. אם אתם משתמשים בצנטריפוגה מקוררת, רצוי להמתין עד שהטמפרטורה הפנימית של המכשיר תגיע לערך הרצוי לפני תחילת הסבב, או להשתמש בדרכים אחרות לקירור הרוטור.

ממש לפני תחילת הסבב, ודאו שכל הפקקים של המבחנות מהודקים ומאובטחים.

בעת טעינת המבחנות, ודאו שכל דגימה מאוזנת על ידי דגימה אחרת הנמצאת ישירות מולה.

אם יש לכם מבחנה אחת בלבד, הכינו מבחנה נוספת שתשמש כמשקולת מאזנת.

אם יש לכם שלוש מבחנות, ניתן לסדר אותן בצורת משולש כך שיהיו במרחקים שווים זו מזו.

איזון המשקולות בצנטריפוגה הוא קריטי. רוטורים של צנטריפוגות מגיעים למהירויות גבוהות ובעלי אנרגיה קינטית רבה. אם האיזון לקוי, יחידת הצנטריפוגה כולה עלולה להיזרק ממקומה ולגרום לנזק חמור.

לאחר שווידאתם שהרוטור והמכסה מאובטחים, הפעילו את הצנטריפוגה והמתינו בסמיכות למכשיר עד שיגיע למהירות הרצויה. אם הבחנתם בבעיה, קראו לבן צוות מנוסה במעבדה שיסייע לכם.

בסיום תהליך הצנטריפוגה, תוכלו לראות את הדגימה הביולוגית בתחתית המבחנה כמשקע (pellet), אשר נפרד משאר התמיסה, שהיא הנוזל העליון (supernatant).

ניתן להסיר את הנוזל העליון על ידי דקנטציה (decanting) – מונח מקצועי למזיגה, או על ידי אספירציה (aspiration) – מונח מקצועי להסרה באמצעות שאיבה.

ניתן להחזיר את הדגימה המזוקקת לתמיסה בתהליך הנקרא ריסספנסיה (resuspending). חזרות על תהליכי צנטריפוגה של תאים, ולאחריהן אספירציה של התאים וריסספנסיה בבופר, מכונות לעיתים קרובות שטיפת תאים.

כעת, לאחר שראיתם כמה מיסודות הצנטריפוגציה, הגיע הזמן לבחון חלק מסוגי הצנטריפוגות הקיימות ואת הפרוטוקולים שניתן לבצע באמצעותן.

צנטריפוגות בעלות רוטור בזווית קבועה הן ככל הנראה הסוג הנפוץ ביותר של מכשיר זה שתפגשו במעבדה. צנטריפוגות שולחניות רבות נכללות בקטגוריה זו.

צנטריפוגות אלו, שבהן המבחנות ממוקמות בתנוחה קבועה ובזווית, משמשות בפרוטוקולים של צנטריפוגציה דיפרנציאלית. בפרוטוקולים אלה, ניתן להשתמש בסדרה של סבבי צנטריפוגציה במהירויות שונות כדי לטהר דגימות ביולוגיות, כגון תאי בעלי חיים. בדרך כלל, פרוטוקולים אלו כוללים מספר שלבי שטיפת תאים.

בניגוד לרוטורים בזווית קבועה, לרוטורים נתיכים (swing rotors) יש מחזיקי מבחנות גמישים המאפשרים לדגימות להסתובב כלפי חוץ. רוטורים אלו מועילים ביישומים כגון צנטריפוגציה במדרג צפיפות, שבה דגימות ביולוגיות נודדות לשכבות מובחנות של מדיום במדרג. סוג זה של צנטריפוגציה שימושי לבידוד מהיר של סוג תא אחד מאחר, או לבידוד אבוןלים בודדים.

לבסוף, האולטרה-צנטריפוגה היא ה"אח הגדול" של כל הצנטריפוגות שתמצאו במעבדה. היא יכולה להסתובב במהירות העולה על 70,000 rpm, מה שהופך אותה למתאימה מאוד לבידוד חלקיקים קטנים, כגון DNA או וירוסים.

בשל המהירויות הגבוהות של צנטריפוגה זו, יש לנקוט משנה זהירות כדי להבטיח שהעומסים מאוזנים כראוי ושהרוטור והמכסה סגורים היטב.

צפיתם כעת במבוא של JoVE לצנטריפוגציה. בסרטון זה סקרנו: מהי צנטריפוגה וכיצד היא פועלת, כיצד להפעיל ולהריץ צנטריפוגה, מספר אמצעי זהירות ויישומים שונים של תהליך הצנטריפוגציה. תודה לצפייתכם וזכרו לאזן את המבחנות שלכם.