בידוד והתמיינות של תאי כלי דם לתאי סטרומה בז'ים / Brite

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד אדיפוציטים ראשוניים ולגרום להתמיינות שלהם בתרבית לתאים בז' או בהירים. השלב הראשון הוא ניתוח רקמת שומן מעכברים. לאחר מכן, הרקמה מתעכלת בקולגנאז.

לאחר בידוד מקטע כלי הדם של הסטרומה, התאים מצופים. השלב האחרון הוא לגרום להתמיינות של התאים לתאים בז' או בהירים. בסופו של דבר, נעשה שימוש בשיטות אנליטיות כדי להראות ביטוי מוגבר של גנים ספציפיים לאדיפוציטים חומים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח ברקמות שומן חומות, וזה המנגנון המולקולרי המווסת את התפתחותם של תאים בהירים או להיות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהשמנת יתר ומחלות אורח חיים אחרות. מכיוון שמניפולציה של רקמת שומן חומה בבני אדם יכולה לשמש כהתערבות טיפולית פוטנציאלית, השלב הראשון הוא הכנת מדיום העיכול.

לאחר המתת חסד, מסירים את רקמת השומן. ראשית, בודדו את רקמת השומן החומה הבין-שכמה או העטלף על ידי חיתוך לאורך גב החיה עד הצוואר. ניתן למצוא שתי אונות של רקמת שומן חומה ממש מתחת לעור בין הכתפיים.

לאחר מכן, הסר בזהירות את שכבת השומן הלבן הדקה המכסה את העטלף. לאחר הבידוד, הנח את הרקמה ישירות לתוך PBS נקי. רקמת השומן הלבנה המפשעתית נמצאת ישירות מתחת לעור משני הצדדים.

הוא משתרע לחלק הפנימי של הירכיים ולמטה לכיוון האשכים. הסר את הטישו והניח ב-PBS נקי. השלבים הבאים מיושמים הן על דגימות העטלף והן על דגימות רטובות.

הסר במהירות את כל הזיהום כגון שיער, שרירי השלד ורקמת החיבור מקטעי הרקמות. לאחר מכן, יבש את הטישו במהירות על מגבת נייר כדי למנוע דילול של מדיום החיתוך בעזרת PBS והניח אותו על צלחת יבשה. מוסיפים את מדיום העיכול וטוחנים את הרקמה לחתיכות קטנות.

לאחר מכן, העבירו את הרקמה לצינור של 50 מיליליטר המכיל את שאר מדיום העיכול. הניחו את הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמדת למשך 40 עד 50 דקות לעיכול. בדוק כל 10 עד 15 דקות כדי לוודא שהעיכול מתנהל כשורה וכדי למנוע עיכול יתר.

לאחר שהרקמה מתעכלת היטב, הפסק את העיכול. על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיום שלם וערבוב היטב, התאים צריכים להיות הומוגניים כמעט לחלוטין. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב 700 פעמים G למשך 10 דקות.

שבר כלי הדם הסטרומלי אמור להיות גלוי כעת ככדור חום בתחתית הצינור שואב את שכבת השומן הבוגרת מלמעלה ואת רוב השכבה הנוזלית. לאחר מכן, ממיסים את הגלולה ב -10 מיליליטר, מדיום שלם ומערבבים היטב. לאחר הערבוב, הנח מסננת תאים על צינור חדש של 50 מיליליטר וסנן את מתלה התאים.

העבירו את מתלה התאים המסונן לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 700 פעמים G למשך 10 דקות. לאחר מכן, שאפו את המדיום והשעו מחדש את הגלולה. ב -10 מיליליטר של פיפטה בינונית שלמה ומערבבים היטב את התאים לפי הצורך.

בדרך כלל, חמישה עכברים יניבו שתי צלחות של 10 סנטימטרים של וואט מפשעתי וצלחת אחת של עטלף. שעה או שעתיים לאחר הציפוי. שאפו את הכביסה הבינונית עם PBS פעמיים והוסיפו מדיום טרי.

שלב זה חשוב מכיוון שהוא יכול להסיר כדוריות דם אדומות, תאי חיסון ומזהמים אחרים. אמצעי התחזוקה והאינדוקציה מוכנים מבעוד מועד. לאחר שהשומנים הראשוניים גדלו למפגש של 95 עד 97%, החלף את המדיום השלם הרגיל עם מדיום אינדוקציה.

לאחר 48 שעות, שנה את המדיום למדיום התחזוקה המכיל 0.5 מיקרו-מולרי RO glitazone. לאחר 48 שעות נוספות, החלף למדיום תחזוקה טרי המכיל גליטזון RO מיקרומולרי אחד למשך יומיים-שלושה נוספים. טיפות יופיעו כשלושה עד ארבעה ימים לאחר הזירוז כפי שניתן לראות כאן שישה עד שבעה ימים לאחר הוספת אמצעי האינדוקציה לראשונה.

התאים צריכים להיות מובחנים לחלוטין לתאי שומן בוגרים ויש למלא אותם בטיפות שמן. כעת ניתן לקצור תאים ולהשתמש בהם לניתוח נוסף. ניתן להעריך השחמה של אדיפוציטים ראשוניים על ידי מדידת mRNA של גנים ספציפיים או סלקטיביים של שומן חום על ידי Q-R-T-P-C-R כפי שניתן לראות כאן.

RO glitazone, UCP מושרה בחוזקה ביטוי mRNA אחד טיפול FORSKOLIN המוגדר כאן כ-A MP מחזורי. הגדיל עוד יותר את ה-RO glitazone גרם ל-UCP ביטוי אחד. Cdia. גן סלקטיבי נוסף של שומן חום גדל גם הוא בצורה תלוית מינון. טיפול ב-RO glitazone גם הגביר את הביטוי של FABP four וסמן אדיפוגני לשומן חום ולבן כאחד.

אפקט השחמה זה לא נבע רק משיפור של אדיפוגנזה כשלעצמה. מכיוון שהשראת UCP one וביטוי CDIA עדיין הייתה משמעותית, גם אם רמות ה-mRNA היו מנורמלות לאלו של FABP 4, כתם מערבי זה מאשר את רמת החלבון המוגברת של UCP one. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד פרה-אדיפוציטים וכיצד להבדיל תאים אלה לתאים בז' או בהירים בתרבית.