Name: באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: למדו שיטת PCR בזמן אמת לכימות השתרשות תאי תורם זכרים בעכברות נקבות לאחר השתלת מח עצם תחרותית. השיטה רגישה, כלכלית ומתאימה למגוון רקעים גנומיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר צ&#39;רלס גרינברג לשימוש במכשיר ה-PCR בזמן האמת שלו. עבודה זו נתמכת על ידי מרכז לחקר סרטן MUSC הולינגס הפעלת קרן, הולינגס מרכז הסרטן ACS IRG, ASCO Conquer פרס פיתוח קריירת קרן הסרטן, NIH 1K08HL 103780-01A1, וNIH 3P30CA138313-01S3. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות או סוכני מימון אחרים.

1. בידוד תאי מח עצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים תורמים עכברי FVB / ניו ג&#39;רזי ועכברים ממין נקבת FVB / ניו ג&#39;רזי באמצעות שיטת 2 CO ואחרי עקירת צוואר רחם זכרים. התאים הנקביים FVB / ניו ג&#39;רזי מח העצם ישמשו כתאים תחרותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים ומלקחיים קטנים, לנתח את עצמות ירך וtibiaes מעכברים ולמקם אותם בצלחת תרבית רקמה 60 מ&quot;מימ המכילה 6 מ&quot;ל קר כקרח RPMI1640 עם FBS המומת חום 5%. השתמש רקמת kimwipe להסיר שרירים ורקמות אחרות. חותך את שני הקצוות של כל פיר עצם בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הקצה של העצם עם מחט 23 ז במזרק סמ&quot;ק 3, לשטוף את מח עצם עם RPMI1640 עם FBS המומת חום 5% למנה. Disaggregate רקמות מוח עצם על ידי שאיפות חוזרות ונשנות תוך שימוש באותה המחט. להעביר את השעית התא לצינור צנטריפוגה מ&quot;ל 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים למשך 5 דקות ב 400 XG, להסיר את supernatant, resuspend התאים ב1 מ&quot;ל של חיץ טמפרטורת חדר תאי דם אדום תמוגה (155 mM pיקרבונט otassium, כלוריד אמוניום 10 מ&quot;מימ, 0.1 מ&quot;מ של EDTA, pH = 7.4) ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ואז להוסיף 5-10 מ&quot;ל של RPMI 1640 עם FBS המומת חום 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים דרך מסננת תא. לאסוף את הזרימה דרך לצינור חדש. ספין למטה למשך 5 דקות ב 400 x גרם. הסר את supernatant; תא הגלולה לא תכיל כל צבע אדום. היעדר הצבע אדום מציין הסרה מלאה של תאי דם אדומים. Resuspend התא גלול ב 10 מ&quot;ל של RPMI1640 עם FBS המומת חום 5%. מערבולת בעדינות כדי לוודא השעית התא היא אחידה לחלוטין. קח aliquot וספירת התאים בhemacytometer. לחשב כמה נפח של תאים הנחוצים להשתלת מח עצם ומספיק תאי aliquot ולערבב תאי תורם גברים עם תאים נקביים מתחרים ביחס 05:02. ספין למטה למשך 5 דקות ב 400 XG, לשטוף עם PBS, resuspend ב PBS עם הריכוז הסופי של תאי תורם ב5 × 10 תאים 6 / מ&quot;ל ומתחרה ב2 × 10 6 </sup&gt; / מ&quot;ל. </li></ol> 2. השתלת מח עצם תחרותית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים ממין נקבה להקרין נמען (8-12 wks גיל) עם רדיאטור קרני גמא 137Cs במנה אחת של 4-6 שעות 11Gy לפני השתלת מח עצם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את נקבות עכברים המוקרנים בעוצרים עכבר. הזרק תורם המעורב ותאים מתחרים דרך וריד זנב ב0.1 מ&quot;ל של נפח באופן שכל עכבר מקבל 5 × 10 5 תאים תורמים ו2 × 10 5 תאי מח עצם מתחרה מוחלט. </li></ol> 3. אוסף מדגם שבועות זוגות לאחר השתלת מח עצם, לאסוף דגימות דם היקפיות (~ 50 μl) מעכבר נמען נשי על ידי דימום רטרו מסלולית בתנאי הרדמה. דגימות נאספות לתוך צינורות מצופים EDTA. דגימות BM יכולות גם להיות שנאספו בסוף הניסוי, לפחות 4 חודשי השתלת הודעה בדרך כלל, עם את הנוהל כמו שתואר קודם (שלב 1);% בדרך כלל 20-40 של1 תאי BM שוקה הם מספיק לעשות מספיק כמות של ה-DNA. דגימות דם או BM מגיל עכברים נורמלים נקביים וזכריים מתאימים גם נאסף להכין עקומת סטנדרט. 4. בידוד הדנ&quot;א הגנומי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 × נפח של טמפרטורת חדר RBC תמוגה חיץ (~ 200 μl) לכל דגימת דם. מערבב היטב ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. הוסף 1 מ&quot;ל של PBS, אז ספין למטה כדי להסיר את רוב RBC lysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד דנ&quot;א באמצעות ערכת חילוץ דנ&quot;א דם (ערכת חילוץ דם DNA QIAmp). החיץ טרום החם elution (ע&quot;א) על 37 מעלות צלזיוס כדי לשפר את התשואה של דנ&quot;א eluted. DNAs זכר ונקבה לעקומת סטנדרט מבודד באופן דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) הדנ&quot;א הגנומי יכול להיות מטוהר נוסף או מרוכז בשיטת משקעי EtOH בנוכחות נתרן יצטט M 3 (pH = 5.5). את כדורי DNA מכן resuspended במים מזוקקים 40-50 μl לניתוח באופן מיידי או מאוחסנים ב -20 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ה-DNA concentration עם פוטומטר הספקטרום Nanodrop ND-1000. דגימות עם OD 260/280 בין 1.8-2.0 משמשות לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל DNA עם DNAase החופשי H 2 O ל4ng/μl בהיקף כולל של 50 μl. </li></ol> 5. הכנת עקומת סטנדרט דלל DNA הגברי והנשי DNA לריכוז של 4 ng / μl, ולהפוך את תערובת ה-DNA על פי הטבלה 1 <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> % של ה-DNA הגברי ברקע נקבה </td><td> נפח (μl) של ה-DNA הגברי 4ng/μl </td><td> נפח (μl) של ה-DNA הנשי 4ng/μl </td><td> נפח כולל (μl) </td></tr><tr><td> 0.2 </td><td> 1 </td><td> 499 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> 1 </td><td> 199 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 195 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 12.5 </td><td> 25 </td><td> 175 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 87.5 </td><td> 175 </td><td> 25 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 200 </td><td> 0 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. הכנת דוגמאות לעקומת סטנדרט. עכברי זכרים ונקבה רגילים FVB / ניו ג&#39;רזי בגיל 8-12wks הוקרבו. תאי דם וBM נאספו. DNAs מתאים זכריים ותאים נקביים היינו מבודד ומחדש הושעה-בריכוז של 4ng/μl. את DNAs הזכר והנקבה היה מעורב ביחסים שונים על מנת ליצור את התערובות הסטנדרטיות מדגם DNA. 6. בזמן האמת PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צלחת תגובת PCR על ידי ערבוב ירוק מגיב SYBR supermix עם פריימרים וDNA גנומי. נפח הריאקציה (20 μl) מכיל 400 ננומטר של כל מאיץ ו5 μl של הדנ&quot;א הגנומי תאי דם (μl X5 4ng/μl = 20 ng) בכל תגובה. דנ&quot;א sampהלס וסטנדרטים הוקמו בשלושה עותקים. הרצפים של primers מוצגים בטבלה 2. </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם גן </td><td> קדימה </td><td> הפוך </td></tr><tr><td> Bcl2 </td><td> 5&#39;-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA </td><td> 5&#39;-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG </td></tr><tr><td> Zfy1 </td><td> 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA </td><td> 5&#39;-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC </td></tr></tbody></table> טבלת 2. רצף פריימר RT-PCR לBcl2 העכברי וZfy1. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע תגובת PCR שימוש במכשיר ה-PCR Biorad iQ5 בתנאים הבאים: 95 ° C 3 דקות, 42 מחזורי ההגברה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ואחרי התכה עקומה צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג סף ערכי מחזור (CT) על ידי מערכת Bio-Rad iQ5 2.1 Standard Edition אופטית. החישוב δCt (CT Zfy1 &lt;/ Sup&gt;-CT Bcl2) ערך, ורמת הביטוי Zfy1 מחושבת כערך של Ct 2-δ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים עקומות סטנדרטיות עבור כל סדרת תגובה באמצעות קריאה 2-δCt מתערובות ידועות גברים / נשים רגילות. העקומות הרגילות נוצרות על ידי קשירת קשר ערך הממוצע של 2-δCt של triplicates ל% DNA הגברי הידוע בתערובת עם הולם רגרסיה לינארית. </li></ol>

<ol><li>McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells%2C+determined+by+quantitative+marrow+transplantation+into+irradiated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat.+Res%22%5BJournal%5D)">The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice.</a> Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119, 4898-4907 (2012).</li>
<li>Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+enhancement+of+donor+hematopoietic+cell+engraftment+by+the+CXCR4+antagonist+AMD3100+in+a+mouse+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model.</a> PLoS One. 5, e11316(2010).</li>
<li>Sadeghi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GVHD+after+chemotherapy+conditioning+in+allogeneic+transplanted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice.</a> Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).</li>
<li>Taketo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FVB%2FN%3A+an+inbred+mouse+strain+preferable+for+transgenic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).</li>
<li>Morisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+analysis+using+a+Y-chromosome-specific+probe+following+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation.</a> Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).</li>
<li>Lo, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+fetal+DNA+in+maternal+plasma+and+serum%3A+implications+for+noninvasive+prenatal+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis.</a> Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).</li>
<li>Byrne, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimerism+analysis+in+sex-mismatched+murine+transplantation+using+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR.</a> Biotechniques. 32, 279-280 (2002).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+recipient-derived+cells+in+allograft+neointima+formation+and+the+response+to+stent+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation.</a> PLoS One. 3, e1894(2008).</li>
<li>Bosio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+real-time+quantitative+PCR+and+DNA+hybridization+for+quantitation+of+male+DNA+following+myoblast+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation.</a> Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).</li>
<li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li>
<li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+%28Zfy-1+and+Zfy-2%29+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes & development. 4, 63-74 (1990).</li>
<li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+PIM+serine%2Fthreonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li>
</ol>

אין לנו מתחרים אינטרסים כספיים לחשוף.

מטרת המחקר הנוכחי שלנו היא לספק לקהל טכניקה מבוססת PCR לכמת engraftment תא התורם במודל תחרותי עכברי מח עצם השתלה. מספר מחקרים שדיווחו על השימוש בRT-PCR לזיהוי תאי תורם במודלי השתלה 9-10. קבוצתו של ד&quot;ר Schwarzenberger פותחה לראשונה מודל עכברי השתלת מח עצם באמצעות PCR בזמן אמת כדי להגביר כרומוזום Y ספציפי 8. שיטה זו משמשת ללמוד פונקצית Gli-1 בפעילות HSC 11. אז אנחנו שונים נוספים הפרוטוקול וספקנו פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד ניסיוני בתבנית חזותית....

מודל Murine מח עצם (BM) השתלה פותח לראשונה ב -1960 1. דגם זה כבר נעשה שימוש נרחב לחקר התא תורם גזע hematopoietic (HSC) בביולוגית עכבר נמען מארח. מודל השתלת מח העצם Murine ספק לנו ידע רב ערך על פונקציות HSC והרגולציה שלהם והכרחי במחקר HSC. מודל allogeneic השתלת מח עצם כמו C57Bl/6J H2B-BALB / C H2d או מודל ההשתלה congenic כמו C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 משמש במעבדות רבות כדי ללמוד את תפקוד הגן על פעילות HSC 2, השפעה של טיפול תרופתי על תפקוד 3 או השתלת HSC מחלות נלוות כגון מחלת שתל נגד מארח (GVHD) 4. סמנים בתא שטח כגון haplotype MHC או CD45.1 משמשים בדרך כלל לתאים מייחדים תורם הנגזרים מתאי נמען מקורם-. C57Bl/6J H2B, CD45.2 </sup&gt;, BALB / C H2d וB6.SJL CD45.1 הם זני העכבר הנפוץ ביותר בהשתלת מח עצם, כי תרומת התא התורם ניתן להעריך בקלות על ידי הזרימה cytometry מדידת CD45.1 לעומת CD45.2 או H2B לעומת H2d. עם זאת, זנים רבים אחרים, כגון FVB / ניו ג&#39;רזי 5 ו C3H הם גם משמשים לעתים קרובות כדי לייצר מהונדסים בהנדסה גנטית או עכברים בנוקאאוט. עכברים אלו ניתן backcrossed לקו לדה ומתוחזק ברקע מעורב גנטי / MHC. במקרים אלה, קביעת engraftment תא תורם ותפקוד HSC יכולה להיות קשה כסמני שטח ספציפיים בתאים תורמים לא יהיו זמינים. באמצעות בדיקת כרומוזום Y-DNA ספציפית כדי לזהות את תאי תורם גברים על ידי כתם דרומי בהשתלת מח עצם מין חוסר התאמה שפותח לראשונה על ידי הקבוצה של ד&quot;ר Miwa 6. ואז, PCR בזמן אמת לקביעת מין האזור Y-נמצא שיטה מדויקת וספציפית מאוד לכמת maתאים עובריים le במערכת הדם האם 7. רעיון זה אומץ על ידי קבוצתו של ד&quot;ר Schwarzenberger לפיתוח של טכניקה בזמן אמת PCR במודל עכברי השתלת מח עצם כדי לקבוע engraftment התא התורם 8. אנחנו שונים בשיטה זו נוספת למדידת engraftment תא התורם במודל FVB / ניו ג&#39;רזי עכבר השתלת מח עצם. שיטה זו כיום שימוש נרחב בקבוצה שלנו ללימוד התפקיד של Pim1 קינאז בביולוגית HSC.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> חום מומת </td></tr><tr><td> אמוניום כלוריד </td><td> חבר הפרלמנט Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> יקרבונט אשלגן </td><td> דיג </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA הדם MINIKIT </td><td> Qiagen </td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td> מסננת תא </td><td> BD מדעי חיים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBR הירוק supermix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> מכונת ה-PCR בזמן אמת iQ5 </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ספקטרה פוטומטר </td><td> Nanodrop ND-1000 </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

באמצעות pcr כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי murine מח עצם השתלה

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

מודלי השתלת מח עצם Murine לספק כלי חשוב במדידה סלולרית פונקציות hematopoietic גזע (HSC) וגנים הקובעים / מולקולות המווסתות HSCs. במערכות מודל השתלות אלה, הפונקציה של HSCs נקבעת על ידי היכולת של תאים אלה נקלטים ולגבש מחדש עכברי נמען קטלני מוקרנים. בדרך כלל, התרומה / engraftment התא התורם נמדד על ידי נוגדנים לחלבונים בתא שטח תורם ספציפי באמצעות cytometry זרימה. עם זאת, שיטה זו תלויה במידה רבה על הספציפיות ואת יכולתו של סמן תא השטח כדי לבדל תאי תורם המופקים מתאי נמען מקורם-, אשר עשוי שלא להיות זמין עבור כל הזנים של העכברים. בהתחשב ברקע השונה של זני עכבר מהונדס גנטי בשוק, משטח זה תא / זרימת cytometry שיטה מבוססת יש מגבלות משמעותיות במיוחד בזני עכברים שאין סמנים מוגדרים היטב על פני שטח לתורם בתאים נפרדים מcongenic הנמען ceLLS. כאן, אנו מדווחים טכניקת PCR מבוססת כדי לקבוע engraftment / תרומת התא התורם בעכברי השתלה. אנו הושתלנו HSCs מח עצם התורם גברים לנקבות העכברים congenic קטלני מוקרנים. דגימות דם היקפיות נאספו בהשתלת הודעה שונה נקודתי זמן. דגימות מח עצם התקבלו בתום הניסויים. הדנ&quot;א הגנומי היה מבודד וגן כרומוזום Y הספציפי, Zfy1, הוגבר שימוש בזמן אמת PCR כמותית. Engraftment של תאים זכריים תורם המופקים בעכברי הנמען הנשים חושב על עקומת סטנדרט עם אחוז ידוע של גברי DNAs לעומת נקבה. Bcl2 שמש גן התייחסות לנרמל את כמות הדנ&quot;א המוחלטת. הנתונים שלנו הציעו כי גישה זו אמינה קובעת engraftment תא התורם ומספקת שיטה יעילה, פשוטה אך במדידת הכינון מחדש של תאי hematopoietic במודלים של השתלת מח עצם Murine. השיטה שלנו יכולה להיות מבוצעת באופן שגרתי ברוב המעבדות כי אףציוד יקר כגון cytometry זרימה נדרש.

איור 1 ו 2 הראו דוגמאות לעקומות סטנדרטיות זממו עם ערכים ממוצעים של 2-δCt נגד אחוזי DNA הגברי. האיור 1A הראה טמפרטורת התכה ספציפית לBcl2 וZfy1 amplicons מותאם ב78.5 המעלות צלזיוס ו88.5 ° C, בהתאמה. Bcl2 משמש כגן התייחסות לנרמל את הסכום הכולל של ה-DNA הטעון בכל תגובת PCR. Bcl2 עקומות הגברה (התחבר תצוגה) לכל דגימה סטנדרטית להתמזג עם כל עצמאי שני של ריכוז ה-DNA גברי, המציין כמות שווה של דנ&quot;א טעון (1B איור). עם זאת, עקו...

קביעת engraftment תא התורם מציגה אתגר במודלי עכבר השתלות מח עצם שאין מוגדרים היטב סמני phenotypical. אנו תארנו המתודולוגיה לכמת engraftment תא התורם גברי בעכברי השתלה נשיות. שיטה זו ניתן להשתמש בכל זני העכבר לחקר פונקציות HSC.

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע טכניקה המבוססת על PCR לכימות השתחת תאי תורם במודל תחרותי של השתתה מחולשח bone marrow, דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע השתחת bone marrow בעכברי רקפי נקבה תוך שימוש בתאי תורם זכרים. לאחר מכן, נאסף דם פריפריאלי מעכברי הרקפי בנקודות זמן שונות ומובודל ה-genomic DNA. הדגימות מוכנות עבור עקומת סטנדרט.לבסוף, מבוצע PCR בזמן אמת (real-time PCR) עם דגימות סטנדרטיות ודגימות בדיקה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את השתרשותם של תאים שמקורם בתורם זכר בעכברי רקיבה נקבה, באמצעות חישוב מול עקומת סטנדרט עם אחוז ידוע של DNA זכרי לעומת נקבי. היתרון המכריע של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטה המבוססת על ציטומטריית זרימה, הוא שהיא רגישה יותר, כלכלית יותר וניתן לאחסן את הדגימות למשך זמן רב.החשוב מכל הוא שהטכניקה שלנו אינה תלויה ברצף נתונים ויכולה לשמש עבור כל רקע גנומי של עכברים, בדומה לסמן פני-תאי מוגדר היטב להבחנה בין תאי התורם לתאי המקבל. לאחר הדשתו של תורם זכר ומקבלית נקבה מזן FVB nj, תחת מCaper flow hood, השתמשו במספריים קטנים ובפינצטה כדי לחלץ את עצמות הירך (femur) והשוק (tibia) והניחו אותן בצלחת תרבית רקמות של 60 מילימטר המכילה 6 מיליליטר של RPMI 1640 קר בקרח עם 5% FBS שעבר נטרול חום. השתמשו בנייר ניגוב מסוג Kim wipe כדי להסיר שרירים ורקמות אחרות, וחתכו את שני קצותיו של כל גוף העצם בתוך הצלחת. לאחר מכן, חברו את קצות העצמות למחט במידה 23 Gauge המחוברת למזרק של 3 cc מלא ב-RPMI 1640 עם 5% FBS שעבר נטרול חום, ושטפו החוצה את מוח העצם.השתמש באותה מחט כדי לפרק את רקמת מחית העצם על ידי שאיפות חוזרות. העבר את תרחיף התאים לשפופרת צנטריפוגה של 15 מיליליטר וסבב אותה למשך חמש דקות ב-400 G. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), השהה את התאים במיליליטר אחד של בופר לליזה של תאי דם אדומים בטמפרטורת החדר, והדגר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפני הוספה של 5 עד 10 מיליליטר של RPMI 1640 עם 5% FBS שעבר אינאקטיבציה בחום; העבר את התאים דרך מסננת תאים ואסוף את הנוזל שעבר לשפופרת חדשה. לאחר סבוב של התאים למשך חמש דקות ב-400 G והסרת הנוזל העליון, המשקע (pellet) לא צריך להיות בעל צבע אדום, מה שמעיד על הסרה מלאה של תאי דם אדומים; השהה את התאים ב-10 מיליליטר של RPMI 1640 עם 5% FBS שעבר אינאקטיבציה בחום, ולאחר ערבוב עדין בוורטקס, הוסף מנה קטנה להמוסייטומטר וספור את התאים.חשבו את נפח התאים הנדרש לערבוב עם תאי נקבה מתחרים ביחס של חמישה לשניים לצורך השתלת מחית עצם. כשלב סופי להכנת התאים להזרקה, ערבבו את תאי התורם והתאים המתחרים, רסבו את התאים, שטפו ב-PBS והשעיקו מחדש ב-PBS בריכוז סופי של 5×10⁶ למ"ל עבור תאי התורם ו-2×10⁶ למ"ל עבור התאים המתחרים, ארבע עד שש שעות לפני השתתלת מחית העצם. הקרינו עכברי נקבה מקבלים בקרינת גמא של cesium 137 במינון בודד של 11 grays.מקמו את העכברות הזכריות שהוקרנו במקבע לעכברים והזריקו את התערובת של תאי התורם ותאי המתחרים דרך וריד הזנב בנפח כולל של 0.1 milliliter, כך שכל עכברה תקבל 5 × 10⁵ תאי תורם ו-2 × 10⁵ תאי מחול מחולקי מתחרים לצורך דגימת דם. לאחר הרדמה, אספו כ-50 µL של דם לתוך מבחנות מצופות EDTA באמצעות דימום רטרו-אורביטלי. אספו דגימות גם מעכברים ומהעכברות בנים ובנות בגיל תואם.בשלב הבא נבודד DNA גנומי מעכברי הניסוי והעכברים. עבור עקומת הסטנדרט, יש להוסיף כ-200 microliters של בופר ליזיס של RBC בטמפרטורת החדר לכל דגימת דם ולהדגיר למשך חמש דקות. יש להוסיף מיליליטר אחד של PBS ולסבב במערכת צנטריפוגה כדי להסיר את מרבית תאי ה-RBC שעברו ליזיס.לאחר מכן, השתמשו בערכה להפקת DNA מדם כדי לבודד את ה-DNA, תוך חימום מוקדם של תמיסס השחרור (elution buffer) ל-37 °C. כדי להגביר את התוצאה, מדדו את ריכוז ה-DNA של כל דגימה. דגימות עם יחס OD 260/280 שבין 1.8 ל-2.0 ישמשו להמשך הניתוח.להקמת עקומת סטנדרט, דללו את ה-DNA הזכרי והנקבאי לריכוז של 4 ng/µL והכינו את תערובת ה-DNA בהתאם להנחיות אלו. הכינו את פלטת תגובת ה-PCR על ידי ערבוב של ריאגנט cyber green super mix עם הפריימרים המוצגים כאן ועם DNA גנומי. כל תגובה בנפח של 20 µL מכילה 400 nM מכל פריימר וחמישה µL של DNA גנומי מתאי דם, המורצים בשלוש חזרות.בצע PCR בהתאם לתנאים המפורטים בפרוטוקול הטקסט והשג את ערכי סף המחזור או ערכי ה-CT. חשב את delta CT כפול הכמות CT בחזקת ZY one פחות CT בחזקת BCL two ואת רמות הביטוי של ZY one או 2 בחזקת מינוס delta CT; צור עקומות סטנדרט על ידי שרטוט הממוצע של ערכי השלישייה 2 בחזקת delta CT אל מול אחוזי ה-DNA הזכרי הידועים בתערובת, עם התאמה של רגרסיה ליניארית המוצגת בגרף. להלן דוגמאות לעקומות סטנדרט ששורטטו עם ערכים ממוצעים של 2 בחזקת delta CT אל מול אחוזי ה-DNA הזכרי.גרף זה כולל טמפרטורת התכה ספציפית עבור אמפליקונים של BCL two ו-ZFY one הממוקמות ב-78.5 ו-88.5 מעלות צלזיוס בהתאמה. BCL two משמש כגן ייחוס לנורמליזציה של הכמות הכוללת של ה-DNA שהועמס בכל תגובת PCR. עקומות ההגברה של BCL two עבור כל דגימת סטנדרט מתמזגות זו עם זו ללא תלות בריכוז ה-DNA הזכרי, דבר המעיד על כמויות שוות של DNA שהועמסו.עם זאת, עקומות ההגברה של ZFY הזיזו שמאלה עם הגדלת כמויות ה-DNA הזכרי בתאי השבם ההמטופואטיים של הדגימה מעכברי PIM TKO, אשר סובלים מפגמים בשחזור עכברים שהקרינו באופן קטלני; וכצפוי, בעכברים מקבלים שהושתלו תאי PIM TKO היה אחוז נמוך בהרבה של תאי זכר בהשוואה לעכברים שהושתלו תאי wild type. כדי לתקף את שיטתנו, בדקנו השתחה של תאי תורם זכריים בעכברות נקבה מושתלות, שקיבלו תאי מחית עצם מעכברי wild type לעומת עכברי PIM triple knockout או TKO בנקודות זמן שונות לאחר ההשתלה, הן בדם פריפריאלי בשבוע השישי והן בדגימות מחית עצם בשבוע ה-16. אלו נותחו לאחר צפייה בסרטון זה.עליך להחזיק בהבנה טובה של אופן השימוש בשיטת PCR לכימות השתרשות תאי התורם במודל תחרותי של השתלת מוח עצם ימי.

using-quantitative-real-time-pcr-to-determine-donor-cell-engraftment

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

השתלת מח עצם Murine היא טכניקה בשימוש נרחב ללמוד מנגנונים אימונולוגיים המסדירים את מחלת שתל נגד מארח בבני אדם. היכולת לעקוב אחר דפוסי סחר בתא...

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

השתלת מח עצם מספקת דרך לשנות את הגנוטיפ של תאים שמקורם במח עצם. אם הגן של העניין בא לידי ביטוי בשני תאי מח עצם ותאים שמקורם במח שאינם נגזרים עצם, השתלת מח עצם יכולה לשנות את התאים שמקורם במח עצם לגנוטיפ שונה מבלי לשנות את גנוטיפ התאים לא נובע מח העצם.

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

סרטון זה מדגים את השראת מחלת השתל נגד המאכסן של המעי, GvHD, בעכבר מושתל המוקרן באופן קטלני באמצעות תאי גזע המטופויטיים אלוגניים ולימפוציטים מסוג T אלוריאקטיביים מעוררי GvHD. פרוטוקול זה מסייע לבסס מודל GvHD חמור במעי כדי להבין את מנגנון המחלה ולפתח אפשרויות טיפוליות חדשניות.

השראת מחלת השתל לעומת המאכסן במודלים של עכברים באמצעות השתלת מח עצם אלוגנית והשתלת תאים טחול

המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני תא המבוססים על ביטוי חלבון.

כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

אנו מציגים פרוטוקול מהיר וגמיש למערכת ביטוי רטרו-ויראלית מבוססת קולטן תאי T יחיד (TCR).  וקטורים רטרו-ויראלים משמשים להתמרת תאי אב של מח עצם כדי לחקור את התפתחות תאי T ותפקודם של TCR יחיד in vivo כחלופה לעכברים טרנסגניים TCR.

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

פרוטוקול זה מספק הנחיות שלב אחר שלב להגדרת ניסויים תחרותיים בהשתלת מח עצם של עכבר כדי לחקור את תפקוד תאי הגזע/אב המטופויאטיים ללא טיהור מוקדם של תאי גזע על ידי מיון תאים.

השתלות תחרותיות להערכת כושר תאי גזע Hematopoietic

כתב יד זה מספק תיאור של המתודולוגיה המשמשת להקמת מודלים של עכברי התמרה-השתלה. ניתן תיאור מפורט של טעויות טכניות שיש להימנע מהן בעת ביצוע השתלות מח עצם. יש להשיג הבנה ברורה של החשיבות של טיטר ויראלי גבוה, טרנספקציה/התמרה והקרנה.

התמר-השתלה במודל עכבר של מחלה מיילופרוליפרטיבית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום ולצבור מחלות ב-xenogeneic השתל-מול-מארח (Xenogeneic) מודל. xenoGVHD מספק מודל vivo כדי ללמוד דיכוי חיסוני של תאים האדם T. בנוסף, אנו מתארים כיצד לזהות תאים האדם T ברקמות עם PCR דיגיטלי ככלי כדי לכמת את הדיכוי החיסוני.

אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי

אנו מתארים שלוש שיטות של השתלת מח עצם (BMT): BMT עם הקרנת גוף כוללת, BMT עם הקרנה מוגנת, ושיטת BMT ללא מיזוג מראש (BMT מאמץ) לחקר המטופוזיס שיבוטים במודלים של עכבר.

הליכים השתלת מח עצם בעכברים ללמוד Hematopoiesis שיבוט

פרוטוקול זה מתאר הזרקה תוך-פמורלית של כמה תאי גזע המטופויטיים או לוקמיים, כולל תאים ערוכים גנטית, במודלים של קסנוגרפט מורין, אשר לא רק יאפשרו השתלה מהירה ובטוחה של תאים אלא גם ניתוחים סדרתיים של מח העצם.

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

למדו שיטת PCR בזמן אמת לכימות השתרשות תאי תורם זכרים בעכברות נקבות לאחר השתלת מח עצם תחרותית. השיטה רגישה, כלכלית ומתאימה למגוון רקעים גנומיים.

באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה

גלה סרטונים נוספים