באמצעות PCR כמוני בזמן אמת לקביעת engraftment תא התורם במודל תחרותי Murine מח עצם השתלה
7 במרץ 2013
קביעת engraftment תא התורם מציגה אתגר במודלי עכבר השתלות מח עצם שאין מוגדרים היטב סמני phenotypical. אנו תארנו המתודולוגיה לכמת engraftment תא התורם גברי בעכברי השתלה נשיות. שיטה זו ניתן להשתמש בכל זני העכבר לחקר פונקציות HSC.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע טכניקה המבוססת על PCR לכימות השתחת תאי תורם במודל תחרותי של השתתה מחולשח bone marrow, דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע השתחת bone marrow בעכברי רקפי נקבה תוך שימוש בתאי תורם זכרים. לאחר מכן, נאסף דם פריפריאלי מעכברי הרקפי בנקודות זמן שונות ומובודל ה-genomic DNA. הדגימות מוכנות עבור עקומת סטנדרט.
לבסוף, מבוצע PCR בזמן אמת (real-time PCR) עם דגימות סטנדרטיות ודגימות בדיקה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את השתרשותם של תאים שמקורם בתורם זכר בעכברי רקיבה נקבה, באמצעות חישוב מול עקומת סטנדרט עם אחוז ידוע של DNA זכרי לעומת נקבי. היתרון המכריע של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטה המבוססת על ציטומטריית זרימה, הוא שהיא רגישה יותר, כלכלית יותר וניתן לאחסן את הדגימות למשך זמן רב.
החשוב מכל הוא שהטכניקה שלנו אינה תלויה ברצף נתונים ויכולה לשמש עבור כל רקע גנומי של עכברים, בדומה לסמן פני-תאי מוגדר היטב להבחנה בין תאי התורם לתאי המקבל. לאחר הדשתו של תורם זכר ומקבלית נקבה מזן FVB nj, תחת מCaper flow hood, השתמשו במספריים קטנים ובפינצטה כדי לחלץ את עצמות הירך (femur) והשוק (tibia) והניחו אותן בצלחת תרבית רקמות של 60 מילימטר המכילה 6 מיליליטר של RPMI 1640 קר בקרח עם 5% FBS שעבר נטרול חום. השתמשו בנייר ניגוב מסוג Kim wipe כדי להסיר שרירים ורקמות אחרות, וחתכו את שני קצותיו של כל גוף העצם בתוך הצלחת. לאחר מכן, חברו את קצות העצמות למחט במידה 23 Gauge המחוברת למזרק של 3 cc מלא ב-RPMI 1640 עם 5% FBS שעבר נטרול חום, ושטפו החוצה את מוח העצם.
השתמש באותה מחט כדי לפרק את רקמת מחית העצם על ידי שאיפות חוזרות. העבר את תרחיף התאים לשפופרת צנטריפוגה של 15 מיליליטר וסבב אותה למשך חמש דקות ב-400 G. לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), השהה את התאים במיליליטר אחד של בופר לליזה של תאי דם אדומים בטמפרטורת החדר, והדגר בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לפני הוספה של 5 עד 10 מיליליטר של RPMI 1640 עם 5% FBS שעבר אינאקטיבציה בחום; העבר את התאים דרך מסננת תאים ואסוף את הנוזל שעבר לשפופרת חדשה. לאחר סבוב של התאים למשך חמש דקות ב-400 G והסרת הנוזל העליון, המשקע (pellet) לא צריך להיות בעל צבע אדום, מה שמעיד על הסרה מלאה של תאי דם אדומים; השהה את התאים ב-10 מיליליטר של RPMI 1640 עם 5% FBS שעבר אינאקטיבציה בחום, ולאחר ערבוב עדין בוורטקס, הוסף מנה קטנה להמוסייטומטר וספור את התאים.
חשבו את נפח התאים הנדרש לערבוב עם תאי נקבה מתחרים ביחס של חמישה לשניים לצורך השתלת מחית עצם. כשלב סופי להכנת התאים להזרקה, ערבבו את תאי התורם והתאים המתחרים, רסבו את התאים, שטפו ב-PBS והשעיקו מחדש ב-PBS בריכוז סופי של 5×10⁶ למ"ל עבור תאי התורם ו-2×10⁶ למ"ל עבור התאים המתחרים, ארבע עד שש שעות לפני השתתלת מחית העצם. הקרינו עכברי נקבה מקבלים בקרינת גמא של cesium 137 במינון בודד של 11 grays.
מקמו את העכברות הזכריות שהוקרנו במקבע לעכברים והזריקו את התערובת של תאי התורם ותאי המתחרים דרך וריד הזנב בנפח כולל של 0.1 milliliter, כך שכל עכברה תקבל 5 × 10⁵ תאי תורם ו-2 × 10⁵ תאי מחול מחולקי מתחרים לצורך דגימת דם. לאחר הרדמה, אספו כ-50 µL של דם לתוך מבחנות מצופות EDTA באמצעות דימום רטרו-אורביטלי. אספו דגימות גם מעכברים ומהעכברות בנים ובנות בגיל תואם.
בשלב הבא נבודד DNA גנומי מעכברי הניסוי והעכברים. עבור עקומת הסטנדרט, יש להוסיף כ-200 microliters של בופר ליזיס של RBC בטמפרטורת החדר לכל דגימת דם ולהדגיר למשך חמש דקות. יש להוסיף מיליליטר אחד של PBS ולסבב במערכת צנטריפוגה כדי להסיר את מרבית תאי ה-RBC שעברו ליזיס.
לאחר מכן, השתמשו בערכה להפקת DNA מדם כדי לבודד את ה-DNA, תוך חימום מוקדם של תמיסס השחרור (elution buffer) ל-37 °C. כדי להגביר את התוצאה, מדדו את ריכוז ה-DNA של כל דגימה. דגימות עם יחס OD 260/280 שבין 1.8 ל-2.0 ישמשו להמשך הניתוח.
להקמת עקומת סטנדרט, דללו את ה-DNA הזכרי והנקבאי לריכוז של 4 ng/µL והכינו את תערובת ה-DNA בהתאם להנחיות אלו. הכינו את פלטת תגובת ה-PCR על ידי ערבוב של ריאגנט cyber green super mix עם הפריימרים המוצגים כאן ועם DNA גנומי. כל תגובה בנפח של 20 µL מכילה 400 nM מכל פריימר וחמישה µL של DNA גנומי מתאי דם, המורצים בשלוש חזרות.
בצע PCR בהתאם לתנאים המפורטים בפרוטוקול הטקסט והשג את ערכי סף המחזור או ערכי ה-CT. חשב את delta CT כפול הכמות CT בחזקת ZY one פחות CT בחזקת BCL two ואת רמות הביטוי של ZY one או 2 בחזקת מינוס delta CT; צור עקומות סטנדרט על ידי שרטוט הממוצע של ערכי השלישייה 2 בחזקת delta CT אל מול אחוזי ה-DNA הזכרי הידועים בתערובת, עם התאמה של רגרסיה ליניארית המוצגת בגרף. להלן דוגמאות לעקומות סטנדרט ששורטטו עם ערכים ממוצעים של 2 בחזקת delta CT אל מול אחוזי ה-DNA הזכרי.
גרף זה כולל טמפרטורת התכה ספציפית עבור אמפליקונים של BCL two ו-ZFY one הממוקמות ב-78.5 ו-88.5 מעלות צלזיוס בהתאמה. BCL two משמש כגן ייחוס לנורמליזציה של הכמות הכוללת של ה-DNA שהועמס בכל תגובת PCR. עקומות ההגברה של BCL two עבור כל דגימת סטנדרט מתמזגות זו עם זו ללא תלות בריכוז ה-DNA הזכרי, דבר המעיד על כמויות שוות של DNA שהועמסו.
עם זאת, עקומות ההגברה של ZFY הזיזו שמאלה עם הגדלת כמויות ה-DNA הזכרי בתאי השבם ההמטופואטיים של הדגימה מעכברי PIM TKO, אשר סובלים מפגמים בשחזור עכברים שהקרינו באופן קטלני; וכצפוי, בעכברים מקבלים שהושתלו תאי PIM TKO היה אחוז נמוך בהרבה של תאי זכר בהשוואה לעכברים שהושתלו תאי wild type. כדי לתקף את שיטתנו, בדקנו השתחה של תאי תורם זכריים בעכברות נקבה מושתלות, שקיבלו תאי מחית עצם מעכברי wild type לעומת עכברי PIM triple knockout או TKO בנקודות זמן שונות לאחר ההשתלה, הן בדם פריפריאלי בשבוע השישי והן בדגימות מחית עצם בשבוע ה-16. אלו נותחו לאחר צפייה בסרטון זה.
עליך להחזיק בהבנה טובה של אופן השימוש בשיטת PCR לכימות השתרשות תאי התורם במודל תחרותי של השתלת מוח עצם ימי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה המבוססת על PCR לכימות השתקחות של תאי תורם זכרים בעכברים נקבות לאחר השתקת מחיתיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה של השתלה
רקע
- כימות של השתקעות תאי תורם מהווה אתגר במודלים של עכברים.
- ייתכן ששיטות קיימות חסרות רגישות או דורשות סמנים ספציפיים.
- PCR בזמן אמת (Real-time PCR) מהווה חלופה חסונה לכימות.
- ניתן להחיל שיטה זו על רקעים גנומיים שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לכימות השתרשות של תאי תורם.
- שיפור הרגישות וההיתכנות הכלכלית בהשוואה לציטומטריית זרימה.
- תיקוף השיטה על פני זני עכברים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתלת מח עצם בעכברים נקביים באמצעות תאי תורם זכרים.
- איסוף דם פריפריאלי ובידוד DNA גנומי.
- הכנת עקומות סטנדרט עבור אנליזת PCR.
- Real-time PCR לכימות תאים שמקורם בתורם זכר.
תוצאות עיקריות
- השיטה כמתה בהצלחה את רמות השביית (engraftment) של תאים זכריים בתוך מקבלות נקביות.
- התוצאות הדגימו רגישות גבוהה יותר בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- עקומות סטנדרט נקבעו כדי להקריב בין ריכוזי DNA לבין רמת השבייה.
- הטכניקה תוקפה על פני זני עכברים שונים.
מסקנות
- השיטה המבוססת על PCR יעילה לכימות השתקפות של תאי תורם.
- גישה זו יכולה לשפר מחקרים על תפקודי תאי גזע המטופויטים.
- היא מספקת כלי ורסטילי לחוקרים בביולוגיה של השתלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
PCR כמותי בזמן אמת (Quantitative real-time PCR) לבדיקת השתכנות של תאי תורם במודלים של השתקת מחיתיים בעכברים נותן מענה לצורך קריטי במדידה רגישה ובלתי תלויה בסמנים של תפקוד תאי גזע המטופואטיים. גישה זו מאפשרת תיקוף איתור חזק והפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים ובמחקר הפרה-קליני, במיוחד כאשר ציטומטריה זרימה קונבנציונלית מוגבלת בשל זמינות סמנים ספציפיים לזן. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי ותומכת בהחלטות תיק מבוססות סיכון בצינורות הפיתוח של מחקר ופיתוח בתחומי ההמטופואזיס והטיפול הגני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה כמותית של השתבשות (engraftment) של תאי גזע המטופואטיים על רקעים גנטיים מגוונים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מועמדים לגנים או מולקולות המווסתים את הביולוגיה של HSC.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת מדידה ישירה של תרומת תאי התורם.
- משפר את הביטחון החזוי לקידום יעדים בתיקי מחקר המטופואטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק בדיקה סטנדרטית וניתנת לשחזור למדידת השתקעות של תאי תורם ללא הסתמכות על סממנים של פני השטח של התא.
- מאפשר התרחבות של הבדיקה ושימוש חוזר בפלטפורמה על פני מספר זני עכברים ומודלים גנטיים.
- מספק פלטים כמותיים המתאימים לניתוח השוואתי ולסריקה של מודיפיקציות גנטיות או התערבויות טיפוליות.
- מפחית את המורכבות התפעולית והעלות בהשוואה לשיטות המבוססות על ציטומטריית זרימה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים הרלוונטיים למחלה לצורך הערכת שיקום המטו-פואטי ויעילות של טיפולים גנטיים.
- מבטיח רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות אפשור מדידה עקבית של השתרשות (engraftment).
- תומך בקבלת החלטות על קידום הפרויקט בהתאם לסיכון, בהתבסס על נתונים כמותיים הניתנים לשחזור.
- מקל על פיתוח ביומרקרים תרגומיים עבור טיפולים בתאי המטופואטיים.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד
שיטה זו לכימות השתקפות (engraftment) המבוססת על PCR משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשרת בדיקה מוקדמת של היפותזות, תיקוף של מועמדים מובילים (lead validation) ומחקר תרגומי במסלולי פיתוח של טיפולים גנטיים והמטופויה המטופויה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי כימות תרומת תאי התורם במודלים של השתקה תחרותית.
- סינון: מספק מוכנות של הבדיקה ושחזוריות להערכת התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות ותוצרי פלט המבוססים על עקומת סטנדרט להשוואה סטטיסטית חסונה.
- מחקר תרגומי: מאפשר המשכיות פרה-קלינית והתאמה של סמנים ביולוגים במחקרי שחזור המטופואטי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע יכולת רחבת יישום, שאינה תלויה בסמן, עבור מודלים עכבריים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תפקוד של HSC.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מדידת השתבצות, שיפור השחזוריות והורדת עלויות הציוד.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון באמצעות אספקת נתונים כמותיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון וקידום של תוכניות לטיפול גנטי ולהמטופואטי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ב-quantitative PCR ובמיצוי genomic DNA.
- נדרשת גישה למכשור real-time PCR ולסטים של פריימרים מתוקפים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת דגימות וניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה עבור זני עכברים ורקעים גנטיים שחסרים בהם סממנים סביבתיים ספציפיים.
- תלוי ביצירה מדויקת של עקומת סטנדרט ובבקרות נורמליזציה.
