תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133 + תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבסס תרביות תאים שמקורן בחולה ממלנומות מממאירות ולבודד תאי גזע סרטניים חיוביים CD 1 33. זה מושג על ידי הכנת תאים בודדים של מלנומה ראשונית מרקמת גידול לאחר דלדול אריתרוציטים מכדור התא. במידת הצורך, אפיינו את תרבית התאים הראשונית ודלדלו את הפיברובלסטים.

השלב האחרון הוא ביצוע מיון תאים מגנטיים של תאי מלנומה חיוביים CD 1 33 ו- CD 1 33 שליליים. בסופו של דבר, הליך מקסימלי אופטימלי זה הוא שיטה מצוינת להשגת אוכלוסיות מועשרות מאוד וברות קיימא של תאים חיוביים CD 1 33 ו-CD 1 33 שליליים. תחילה השתמשנו בטכניקה כדי לאמת נתוני אינסקו ברפואה מותאמת אישית שבה אנו מנסים לחזות תגובה לתרופות של חולי סרטן ולשם כך לא ניתן להשתמש בקו תאים זמין מסחרית.

היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שיש לנו גישה מהירה לתאים חיוביים CD 1 33, שהם תאי גזע סרטניים משוערים במלנומה ממאירה. הטכניקה תוצג על ידי קתרין דייוויס, טכנאית מעבדה מהמעבדה שלי. העברת רקמת הגידול המבודדת הטרייה מהניתוח למעבדת תרבית רקמות ב-PBS סטרילי המכיל 1% פניצילין סטרפטומיצין.

העבירו את רקמת הגידול לצלחת פטרי סטרילית, שאפו את התמיסה העודפת. לאחר מכן מוסיפים תערובת דיסוציאציה של 500 מיקרוליטר וטוחנים את הגידול לחתיכות קטנות של שניים עד ארבעה מילימטרים בעזרת אזמלים סטריליים טריים. כעת העבירו שניים עד ארבעה גרם של רקמת גידול טחון לתוך שפופרת מקסימום C עדינה המכילה תערובת דיסוציאציה של חמישה מיליליטר.

שוטפים את צלחת הפטרי בתערובת דיסוציאציה נוספת של 4.5 מיליליטר ומוסיפים שברי רקמות שנותרו לצינור המקסימום C העדין. סגור את הצינור, חבר אותו הפוך על שרוול הדיסוציאציה והפעל את התוכנית H גידול אפס אחד. לאחר מכן, דגרו את הדגימה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס בסיבוב רציף במהירות הריצה הגבוהה ביותר.

כעת חבר את הצינור הפוך על שרוול הדיסוציאציה והפעל את התוכנית H tumor אפס שתיים. לאחר מכן דגרו את הדגימה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס בסיבוב רציף ב-12 סל"ד. לאחר מכן, הפעל את תוכנית המקסימום העדינה H גידול אפס שלוש.

השעו מחדש את הדגימה והעבירו את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר. במידת הצורך, מערבבים את מתלה התאים עם קצה מסנן סטרילי עד שהמתלה המלא עובר. שטפו את מסננת התאים עם חמישה מיליליטר קוונטי 2 6 3 כדור בינוני את תרחיף התאים למשך חמש דקות ב -300 גרם והשליכו את הסופרנטנט.

אם נראה שחיך התא נקרא עקב כמות גבוהה של טיקים ושקרים, כדוריות דם אדומות כמפורט בפרוטוקול הטקסט הנלווה. סובב מחדש את תאי הגידול בקוואנטום 2 6 3 וזרע תרבית באופן שגרתי מעבר תאים כאשר הם מגיעים למפגש של 80%. נתח את הפנוטיפ של תרבית התאים העיקרית באמצעות מיקרוסקופ.

לאחר מכן קצרו כמות קטנה מתרבית התאים הראשונית למיצוי RNA לאחר סינתזת CD NA ובצעו R-T-P-C-R עם פריימרים למלנומה ניאופלסטית, תאי גזע וגנים של סמני תאי סטרומה. הגנים החשובים ביותר לניתוח הם סמן הפיברובלסטים CD 90, סמן המלנומה והמלנוציטים קורעים את סמן תאי הגזע הסרטניים CD 1 33, הסמן לתאים דנדריטיים בוגרים, CD 83, וגן משק בית כמו HPRT או GAAP dh. אם הניתוח המיקרוסקופי המשולב ו-R-T-P-C-R חשף זיהום פיברבלסט גבוה של תרבית המלנומה הראשונית, המשך לרוקן את הפיברובלסטים באמצעות האנטי-פיברובלסטים, המיקרו-חרוזים ועמודות ה-LD.

שטפו 80% תאי מפגש עם PBS חם מראש, הוסיפו כמות מתאימה של אקוטן ודגרו עד שהתאים מתנתקים משטח התרבית. קצרו את התאים במדיום קוונטי 2 6 3 והעבירו לצינור של 50 מיליליטר. ספרו את התאים ואז צנטריפוגה את מספר התאים הנדרש למשך חמש דקות ב-300 גרם וארבע עד שמונה מעלות צלזיוס.

שאפו סופרנטנט לחלוטין והחייאו. השעו עד פעם אחת 10 עד התאים השמיניים במאגר מקסימלי של 350 מיקרוליטר הוסיפו 100 מיקרוליטר מגיב חוסם FCR ו-50 מיקרוליטר CD 1 33. ביוטין אחד.

מערבבים היטב ודוגרים על ארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. שוטפים את התאים עם מאגר מקסימלי של 10 מיליליטר, ואחריו צנטריפוגה למשך חמש דקות בחום של 300 גרם וארבע עד שמונה מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין לאחר שטיפה שנייה.

השעו מחדש את גלולת התא ב-400 מיקרוליטר של מאגר מקסימלי. מוסיפים 100 מיקרוליטר מיקרו-חרוזים נגד ביוטין ומערבבים היטב בדגירה בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. בינתיים, כדי להכין את המפריד המקסימלי להפרדה המגנטית, חבר את ה-quadro max למעמד המולטי-מפריד המקסימלי.

הכנס את המספר הנדרש של עמודות LS עם כנפי העמודים מלפנים בשדה המגנטי של ה-quadro max. הנח מסנן הפרדה מראש לכל עמודת LS וצינור איסוף מתאים. מתחת לכל עמודה, שטפו את המסנן והעמודה עם מאגר מקסימלי של שלושה מיליליטר והשליכו את הזרימה.

לאחר שטיפת התאים במאגר מקסימלי כמתואר קודם לכן, השעו מחדש את התאים במאגר מקסימלי של 500 מיקרוליטר והניחו את תרחיף התאים על עמודת ה-LS המוכנה שלהם. יש לשטוף שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר מקסימום מאגר לכל עמודה. אסוף את סך כל העשירים של שבר התאים השלילי cd 1 33 ללא תווית.

לאחר מכן, השליכו את מסנן ההפרדה מראש. הסר את העמוד מהמפריד והניח אותו על צינור איסוף מתאים. החל מאגר מקסימלי של חמישה מיליליטר.

שטוף מיד את התאים החיוביים CD 1 33 המסומנים על ידי דחיפה חזקה של הבוכנה לתוך העמודה כדי להגביר את טוהר השבר השלילי. החל את תרחיף התא על עמודת LS מאוזנת חדשה ואסוף את השבר השלילי CD 1 33. גרורות בבלוטות הלימפה שנכרתו התקבלו מחולה מלנומה בשלב מאוחר.

לאחר דיסוציאציה מכנית ואנזימטית של הרקמה, גלולת התאים המסוננים הכילה זיהום גבוה באריתרוציטים. לאחר מכן, דלדול תאי הדם האדומים הביא לכדורית תאים בצבע חום בהיר. תאים אלה תורבבו כאן במדיום קוונטי 2 6 3, R-T-P-C-R של מלנוציטים ומלנומה, פיברובלסטים, דנדריטים וסמן תאי גזע.

גנים משמשים כדי לוודא שהתאים מקורם בגידול ולא בסטרומה שמסביב. מלנוציטים בוגרים שימשו כתאי בקרה נורמליים לדמעה וקו תאי הקרצינומה העוברית N-C-C-I-T כבקרה חיובית לסמן תאי הגזע CD 1 33. נתונים אלה מגלים כי חלק מהתאים הראשוניים אכן חיוביים לדמעה ולכן ממקור מלנוציטי.

התרבית שלילית גם ל-CD 83, הסמן של תאים דנדריטיים בוגרים. מעניין לציין שקו תאי מלנומה זה מבטא CD 1 33, גן חיוני לחלוקת תאים אסימטרית, וסמן ידוע של תאי גזע סרטניים. מוצג כאן מיקרוגרף שדה בהיר של תרבית תאים ראשונית מזוהמת מאוד בפיברובלסטים לאחר טיפול בדלדול פיברובלסטים, התרביות מייצגות תאי מלנומה ראשוניים.

תאי המלנומה הראשוניים מוינו לתאים חיוביים CD 1 33 ו- CD 1 33 שליליים. נתונים אלה מניתוח אימונו-פלואורסצנטי, צביעה וכתמים מערביים מצביעים על יעילות מיון וטוהר גבוהים. לגישה זו יש השלכות גדולות על הרפואה המותאמת אישית מכיוון שכעת אנו יכולים להשתמש ברקמות ובתאים שמקורם בחולה כדי לחזות טוב יותר את התגובה לתרופות של כל מטופל בנפרד.

שיטה זו תעזור לנו לענות על שאלות מפתח כמו מהיכן נובע הגידול? כיצד ניתן לטפל בחולים? וזה יעזור להגדיר מחדש טוב יותר גישות ביולוגיה מערכתית על ידי אימות הניסויים שלהם.