Name: מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב Xenopus ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: למדו שיטה לכימות פעילות Na,K-ATPase בביציות Xenopus באמצעות ספקטרופוטומטריית קליטה אטומית. שיטה זו מספקת חלופה בטוחה ורגישה לניסויים רדיואיזוטופיים מסורתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים לארנסט במברג (מכון מקס פלאנק לביופיזיקה, פרנקפורט, גרמניה) על תמיכתם הנדיבה בשלב הראשוני של פיתוח השיטה, לקזוהירו אבה (אוניברסיטת קיוטו, יפן) על דיונים פוריים רבים ולד"ר מיכאל קוהל (Analytik-Service, וולטרסדורף, גרמניה) על התמיכה הטכנית. המחברים מודים בהכרת תודה למימון של קרן המחקר הגרמנית DFG (אשכול המצוינות "איחוד מושגים בקטליזה"), שמימנה גם את מנגנון Perkin Elmer AAnalyst 800 (SFB 498).

<ol><li>Tavraz, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+plasma+membrane+targeting+or+protein+stability+by+certain+ATP1A2+mutations+identified+in+sporadic+or+familial+hemiplegic+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Impaired plasma membrane targeting or protein stability by certain ATP1A2 mutations identified in sporadic or familial hemiplegic migraine.</a> Channels (Austin). 3, 82-87 (2009).</li>
<li>Castillo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscape+of+the+reactions+governing+the+Na%2B+deeply+occluded+state+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+in+the+giant+axon+of+the+Humboldt+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Energy landscape of the reactions governing the Na+ deeply occluded state of the Na+/K+-ATPase in the giant axon of the Humboldt squid.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 20556-20561 (2011).</li>
<li>Friedrich, T., Bamberg, E., Nagel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2CK%2B-ATPase+pump+currents+in+giant+excised+patches+activated+by+an+ATP+concentration+jump%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Na+,K+-ATPase pump currents in giant excised patches activated by an ATP concentration jump.</a> Biophys J. 71, 2486-2500 (1996).</li>
<li>Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Dempski, R. E., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+E2+state+stabilization+by+specific+alpha%2Fbeta-subunit+interactions+of+Na%2CK-+and++H%2CK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional significance of E2 state stabilization by specific alpha/beta-subunit interactions of Na,K- and H,K-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 284, 3842-3854 (2009).</li>
<li>Dürr, K. L., Abe, K., Tavraz, N. N., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2P+state+stabilization+by+the+N-terminal+tail+of+the+H%2CK-ATPase+beta-subunit+is+critical+for+efficient+proton+pumping+under+in+vivo+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">E2P state stabilization by the N-terminal tail of the H,K-ATPase beta-subunit is critical for efficient proton pumping under in vivo conditions.</a> J. Biol. Chem. 284, 20147-20154 (2009).</li>
<li>Durr, K. L., Tavraz, N. N., Zimmermann, D., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Na%2CK-ATPase+and+H%2CK-ATPase+enzymes+with+glycosylation-deficient+beta-subunit+variants+by+voltage-clamp+fluorometry+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Na,K-ATPase and H,K-ATPase enzymes with glycosylation-deficient beta-subunit variants by voltage-clamp fluorometry in Xenopus oocytes.</a> Biochemistry. 47, 4288-4297 (2008).</li>
<li>Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gastric+H%2CK-ATPase+activity+by+cations%2C+voltage+and+intracellular+pH+analyzed+by+voltage+clamp+fluorometry+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control of gastric H,K-ATPase activity by cations, voltage and intracellular pH analyzed by voltage clamp fluorometry in Xenopus oocytes.</a> PLoS One. 7, e33645(2012).</li>
<li>Tavraz, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functional+consequences+of+mutations+in+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+alpha2-subunit+causing+familial+hemiplegic+migraine+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Diverse functional consequences of mutations in the Na+/K+-ATPase alpha2-subunit causing familial hemiplegic migraine type 2.</a> J. Biol. Chem. 283, 31097-31106 (2008).</li>
<li>Lorenz, C., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li>
<li>Koenderink, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2CK-ATPase+mutations+in+familial+hemiplegic+migraine+lead+to+functional+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Na,K-ATPase mutations in familial hemiplegic migraine lead to functional inactivation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1669, 61-68 (2005).</li>
<li>Price, E. M. J., Lingrel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+the+Na%2CK-ATPase+alpha+subunit%3A+site-directed+mutagenesis+of+glutamine-111+to+arginine+and+asparagine-122+to+aspartic+acid+generates+a+ouabain-resistant+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme.</a> Biochemistry. 27, 8400-8408 (1988).</li>
<li>Richards, R., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+conformational+dynamics+of+membrane+proteins+in+situ+with+site-directed+fluorescence+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling.</a> J. Vis. Exp. (2627), e2627(2011).</li>
<li>Lafaire, A. V., Schwarz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+dependence+of+the+rheogenic+Na%2B%2FK%2B+ATPase+in+the+membrane+of+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Voltage dependence of the rheogenic Na+/K+ ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus laevis.</a> J. Membr. Biol. 91, 43-51 (1986).</li>
<li>Morth, J. P., Pedersen, B. P., Toustrup-Jensen, M. S., Sorensen, T. L., Petersen, J., Andersen, J. P., Vilsen, B., Nissen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+sodium-potassium+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the sodium-potassium pump.</a> Nature. 450, 1043-1049 (2007).</li>
<li>Toustrup-Jensen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C+terminus+of+Na%2B%2CK%2B-ATPase+controls+Na%2B+affinity+on+both+sides+of+the+membrane+through+Arg935%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The C terminus of Na+,K+-ATPase controls Na+ affinity on both sides of the membrane through Arg935.</a> J. Biol. Chem. 284, 18715-18725 (2009).</li>
<li>Morth, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+Na%2B%2CK%2B-ATPase+and+mapping+of+isoform+differences+and+disease-related+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 364, 217-227 (2009).</li>
<li>Yaragatupalli, S., Olivera, J. F., Gatto, C., Artigas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Na%2B+transport+after+an+intracellular+alpha-subunit+deletion+reveals+strict+external+sequential+release+of+Na%2B+from+the+Na%2FK+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Altered Na+ transport after an intracellular alpha-subunit deletion reveals strict external sequential release of Na+ from the Na/K pump.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15507-15512 (2009).</li>
<li>Meier, S., Tavraz, N. N., Durr, K. L., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarization-activated+inward+leakage+currents+caused+by+deletion+or+mutation+of+carboxy-terminal+tyrosines+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%7Balpha%7D+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarization-activated inward leakage currents caused by deletion or mutation of carboxy-terminal tyrosines of the Na+/K+-ATPase {alpha} subunit.</a> J. Gen. Physiol. 135, 115-134 (2010).</li>
<li>Vedovato, N., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+C-terminal+tyrosines+stabilize+occluded+Na%2FK+pump+conformations+containing+Na+or+K+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The two C-terminal tyrosines stabilize occluded Na/K pump conformations containing Na or K ions.</a> J. Gen. Physiol. 136, 63-82 (2010).</li>
<li>Chakavarti, B., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+separation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic separation of proteins.</a> J. Vis. Exp. (16), e758(2008).</li>
<li>Kamsteeg, E. J., Deen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aquaporin-2+expression+levels+in+genotype+-phenotype+studies+in+nephrogenic+diabetes+insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aquaporin-2 expression levels in genotype -phenotype studies in nephrogenic diabetes insipidus.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279, 778-784 (2000).</li>
<li>Koenderink, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+analysis+of+the+mutated+Na%2CK-ATPase+cation+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological analysis of the mutated Na,K-ATPase cation binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 278, 51213-51222 (2003).</li>
<li>Gottardi, C. J., Caplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+requirements+for+the+cell-surface+expression+of+multisubunit+ion-transporting+ATPases.+Identification+of+protein+domains+that+participate+in+Na%2CK-ATPase+and+H%2CK-ATPase+subunit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular requirements for the cell-surface expression of multisubunit ion-transporting ATPases. Identification of protein domains that participate in Na,K-ATPase and H,K-ATPase subunit assembly.</a> J. Biol. Chem. 268, 14342-14347 (1993).</li>
<li>Mathews, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+and+functional+expression+of+the+mouse+and+frog+alpha-subunit+of+the+gastric+H%2B-K%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Primary structure and functional expression of the mouse and frog alpha-subunit of the gastric H+-K+-ATPase.</a> Am. J. Physiol. 268, 1207-1214 (1995).</li>
<li>Horisberger, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H%2CK-ATPase+beta-subunit+can+act+as+a+surrogate+for+the+beta-subunit+of+Na%2CK-pumps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The H,K-ATPase beta-subunit can act as a surrogate for the beta-subunit of Na,K-pumps.</a> J. Biol. Chem. 266, 19131-19134 (1991).</li>
<li>Guennoun-Lehmann, S., Fonseca, J. E., Horisberger, J. D., Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palytoxin+acts+on+Na%2B%2CK%2B-ATPase+but+not+nongastric+H%2B%2CK%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Palytoxin acts on Na+,K+-ATPase but not nongastric H+,K+-ATPase.</a> J. Membr. Biol. 216, 107-116 (2007).</li>
<li>Horisberger, J. D., Guennoun, S., Burnay, M., Geering, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation+stoichiometry+and+cation+pathway+in+the+Na%2CK-ATPase+and+nongastric+H%2CK-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci.%22%5BJournal%5D)">Cation stoichiometry and cation pathway in the Na,K-ATPase and nongastric H,K-ATPase.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci.. 986, 127-132 (2003).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

השיטה המתוארת למדידת כמות ה-Rb+ (או Li+) שנלקחה לביציות Xenopus בודדות המבטאות Na+,K+- או H+,K+-ATPase הוכיחה את עצמה כטכניקה רב-תכליתית, גמישה ומדויקת לקביעת הפרמטרים הקינטיים או התרמודינמיים של הובלה עבור ATPases מסוג P נגד קטיון1,4,5,7,8. זוהי אלטרנטיבה בטוחה ואמינה לבדיקות שטף עוקב רדיואקטיבי, ומאפשרת לענות על היקף גדול של שאלות ניסיוניות תוך זמן קצר משמעותית. בהתאם, רק נתונים מוגבלים מאוד נרכשו עם עוקבי רדיו24-27. שיטת A...

רצינו לפתח אלטרנטיבה רגישה, בטוחה וזולה לניסויי מעקב רדיואקטיביים כדי לחקור את פעילות ההובלה הספציפית של חלבוני ממברנה מעבירים יונים על מנת לעקוף מגבלות לגבי גישה למעבדות איזוטופים, דרישות בטיחות או שימוש ברדיואיזוטופים יקרים, שכמו במקרה של ליתיום עשויים אפילו להיות לא זמינים בגלל זמני דעיכה קצרים במיוחד. התענייננו במיוחד בקביעת הפעילות של הקיבה H+,K+-ATPase הפועל באופן אלקטרו-ניטרלי, מכיוון שהאנזים אינו מייצר זרם ולכן לא ניתן לטפל בפעילותו בשיטות אלקטרופיזיולוגיות. מכיוון ש-Na+,K+- ו-H+,K+-ATPase הובלה Rb+ יעילה כמו K+ (וגם Li+), הרגישות הגבוהה של טכניקת AAS לרובידיום או ליתיום אמורה להקל על זיהוי רגיש של פעילות תחבורה. ספקטרופוטומטרים של ספיגה אטומית הם מכשירים אנליטיים נפוצים, המופצים באופן נרחב במעבדות כימיות ואמורים להיות נגישים למספר רב של מדענים מעוניינים. יתר על כן, רצינו לנצל את מערכת ביטוי הביציות Xenopus, המשתמשת בתאים בודדים גדולים (בקוטר של כ-1.0-1.5 מ"מ) המאפשרים להשיג שונות נמוכה להפליא מתא לתא לגבי רמת ביטוי החלבון בתוך אצווה בודדת. חישוב פשוט מדגים את היתכנות בדיקת ה-AAS: גבול הזיהוי (מסה אופיינית) עבור רובידיום בטכניקת THGA-AAS הוא 10 pg או 1.2.10-13 מול (Rb: 85.47 g/mol), עבור ליתיום 5.5 pg או 7.9.10-13 מול (Li: 6.94 g/mol). עם ביטוי הטרולוגי של Na+,K+-ATPase בביציות Xenopus, ניתן להשיג זרמי משאבה של 100 nA (השווה לכ-6.2·1011 מטענים אלמנטריים לשנייה, או 1.03·10-12 מול s-1), ובכך לגרום להובלה של 6·10-6 מעלות צלזיוס של מטען תוך דקה אחת. מכיוון שהובלה של מטען נטו אחד תואמת את הספיגה של שני יוני Rb+ (עקב הסטוכיומטריה 3Na+/2K+), זרם של 100 nA למשך דקה אחת מתאים לספיגה של 1.2·10-10 מול Rb+. לפיכך, אפילו בדילול של פי 1,000 (הומוגניזציה של ביצית בנפח של כ-1 מיקרוליטר ב-1 מ"ל מים), דגימת THGA-AAS טיפוסית (20 מיקרוליטר) מכילה 2.4.10-12 מול Rb+ (או 204 pg), שהוא הרבה מעל סף הזיהוי. לכן, אפילו טרנספורטרים עם פעילות הובלה נמוכה פי 100 או ביטוי קרום פלזמה יכולים להיבדק בטכניקה על ידי התאמה מתאימה של זמן השטף של הניסוי.
מכיוון שקצב השאיבה תלוי ברגישות בטמפרטורה (אנרגיות הפעלה אופייניות עבור Na+,K+-ATPase הן בטווח של 90 kJ/mol עד 130 kJ/mol1-3, מה שמביא לעלייה של כ-30% בקצב התחלופה עם שינוי מ-20 מעלות צלזיוס ל-22 מעלות צלזיוס), חובה לבצע את מדידות השטף תחת בקרת טמפרטורה מדויקת (מיזוג אוויר) עם פתרונות חיץ מאוזנים היטב. יתר על כן, יש לבחור בקפידה ביציות לגבי גודל הומוגני לביטוי של מוביל יונים. עם אמצעי זהירות אלה, ניתן להשיג באופן שגרתי שגיאות תקן ניסיוניות של פחות מ-10 אחוזים עם כ-10 תאים לכל תנאי ניסוי. באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לקבוע למשל את זיקות ה-Rb+ לכאורה של הובלת קטיון4-6, את ההשפעה של pH חוץ-תאי ותוך-תאי7 ואת ההשפעה של מוטציות של שאריות המעורבות בתיאום הקטיונים במהלך ההובלה4,8. היתרון של הטכניקה הוא שניתן לקבוע שטפי יונים גם בשילוב עם הידוק מתח של שתי אלקטרודות של הביציות, מה שמבטיח מצד אחד שליטה מדויקת על פוטנציאל הממברנה במהלך ההובלה ומצד שני מאפשר לתאם שטף יונים עם זרם הממברנה. לפיכך, ניתן היה לאמת את הסטוכיומטריה 3Na+/2K+ של ה-Na+,K+-ATPase (ראה תוצאות לדוגמה להלן) ולקבוע את תלות המתח של הובלת הקטיונים של הקטיון של הקיבה H+/K+-ATPase7.

<table><tbody><tr><td>4.0 חומר תפר Ethicon Vicryl</td><td>ג'ונסון ג'ונסון</td><td>V633H</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מסוג 1A מ-Clostridium hystolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור מוצר PCR טהור גבוה</td><td>רוש מדע יישומי</td><td>11732676001</td><td> </td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>אמביון</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Kit SP6/ T7</td><td>Ambion</td><td>1340, 1344</td><td></td></tr><tr><td>Ouabain octahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3125</td><td></td></tr><tr><td>Tricain (מלח אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונט)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין מסוג III-O מחלבון ביצת עוף</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2011</td><td></td></tr><tr><td>SCH28080</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4443</td><td></td></tr><tr><td>AAnalyst 800</td><td>פרקין אלמר</td><td>0993-5256</td><td></td></tr><tr><td>WinLab32TM</td><td>פרקין אלמר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ביופוטומטר</td><td>אפנדורף</td><td>6131 000.012</td><td></td></tr><tr><td>נימים בורוסיליקט</td><td>מוצרי מדע</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>צינורות המטוקריט 3.5 אינץ'</td> <td>דראמונד סיינטיפיק</td><td>3 000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>מנורת קתודה חלולה ליתיום</td><td>פוטרון</td><td>P929LL</td><td></td></tr><tr><td>מנורת קתודה חלולה Rubidium</td><td>Photron</td><td>P945</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה </td><td>Narishige</td><td>דגם PC-10</td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטת ביציות RC-10</td><td>Warner Instr.</td><td>W4 64-0306</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II משאבת הזרקה</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP תוכנה</td> מכשירים <td></td><td></td><td>מולקולריים</td></tr><tr><td>דגימה פוליפרופילן (1.2 מ"ל)</td><td>Perkin Elmer</td><td>B0510397</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac - רכז דגם 5301</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.210</td><td> </td></tr><tr><td>צינור THGA</td><td>Perkin Elmer</td><td>B3000641</td><td></td></tr><tr><td>מגבר טורבו TEC-10CX</td><td>NPI אלקטרוניקה</td><td>TEC-10CX</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת תחבורת קטיון ידי na, k-ו-h, k-atpase ב<em&gt; xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

בעוד שניתן למדוד את הובלת הקטיונים על ידי טרנספורטר הממברנה האלקטרוגני Na+,K+-ATPase על ידי אלקטרופיזיולוגיה, קשה יותר לחקור את הקיבה הפועלת באופן אלקטרוניילי H+,K+-ATPase. בדיקות תחבורה רבות משתמשות ברדיואיזוטופים כדי להשיג יחס אות לרעש מספיק, עם זאת, אמצעי האבטחה הדרושים מטילים מגבלות חמורות לגבי חשיפה אנושית או תכנון בדיקה. יתר על כן, הובלת יונים על פני קרומי התאים מושפעת באופן קריטי מפוטנציאל הממברנה, שאינו נשלט באופן ישיר בתרבית תאים או בתכשירי פרוטאוליפוזום. כאן, אנו עושים שימוש ברגישות יוצאת הדופן של ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית (AAS) כלפי כמויות עקבות של יסודות כימיים כדי למדוד הובלת Rb+ או Li+ על ידי Na+,K+- או H+,K+-ATPase בקיבה בתאים בודדים. באמצעות ביציות Xenopus כמערכת ביטוי, אנו קובעים את כמות ה-Rb+ (Li+) המועברת לתאים על ידי מדידת דגימות של הומוגנטים של ביצית בודדת במכשיר AAS המצויד בתנור מרסס גרפיט מחומם לרוחב (THGA), הנטען מדגימה אוטומטית. מכיוון שהרקע של קליטת Rb+ לא ספציפית לביציות בקרה או במהלך יישום מעכבי ATPase ספציפיים הוא קטן מאוד, ניתן ליישם תוכניות בדיקה קינטיות מורכבות הכוללות מספר רב של תנאי ניסוי בו זמנית, או להשוות את יכולת ההובלה והקינטיקה של טרנספורטרים שעברו מוטציה ספציפית לאתר בדיוק גבוה. יתר על כן, מכיוון שקליטת הקטיונים נקבעת על תאים בודדים, ניתן לבצע את ניסויי השטף בשילוב עם הידוק מתח של שתי אלקטרודות (TEVC) כדי להשיג שליטה מדויקת על פוטנציאל הממברנה והזרם. זה איפשר למשל לקבוע כמותית את סטוכיומטריית ההובלה 3Na+/2K+ של ה-Na+,K+-ATPase ואיפשר לראשונה לחקור את תלות המתח של הובלת הקטיונים על ידי הקיבה הפועלת באופן אלקטרו-ניטרלי H+,K+-ATPase. באופן עקרוני, הבדיקה אינה מוגבלת לחלבוני ממברנה המובילים K+, אך היא עשויה לעבוד באותה מידה כדי לטפל בפעילות של מובילי מתכות כבדות או מעבר, או ספיגה של יסודות כימיים על ידי תהליכים אנדוציטוטיים.

כימות ספיגת Rb+ על ידי P-type ATPases המבצעות countertransport של K+ (או Rb+) על ידי AAS במערכת ביטוי של ציותות Xenopus מאפשר קביעה מהימנה של פרמטרים קינטיים של האנזים.
קביעת הסטוכיומטריה של ההובלה של ה-Na+/K+-ATPase
עבור ה-Na האלקטרוגני+/K+ATPase-, Rb+ ניתן לקבוע שטפי זרם בניסויי clamp-מתח בעלי שתי אלקטרודות, שמטרתם לבחון את המתאם בין הובלת מטען נטו (אינטגרל הזמן של זרם המ...

אנו מתארים שיטה לכימות הפעילות של ATPases מסוג P-countertransport K+ על ידי ביטוי הטרולוגי של האנזימים בביציות Xenopus ומדידת קליטת Rb+ או Li+ לתאים בודדים על ידי ספקטרופוטומטריית ספיגה אטומית. השיטה מהווה אלטרנטיבה רגישה ובטוחה לניסויי שטף רדיואיזוטופים המאפשרים מחקרים קינטיים מורכבים.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

הפרוצדורה משתמשת בתאי צפרדע כמערכת ביטוי in vivo. כדי לכמת את פעילות ההסעה של נשאי ממברנה מסוג P-type A למשאית אשלגן נגדית, TP, ais, או נשאי יסודות קורס שאתר אחרים, בטא את חלבון הנשא תחילה בתוך תאי צפרדע. לאחר מכן, גרה ספיגה של קטיונים על ידי דגירה של התאים בתמיסת זרימה המכילה ריכוז מסוים של הקטיונים המוסעים למשך זמן וטמפרטורה קבועים.לחלופין, בצעו את ניסוי הספיגה תחת בקרת פוטנציאל ממבנה באמצעות טכניקת clamp של מתח דו-אלקטרודי. לאחר שטיפת התאים, הומוגניזו ציטות בודדות במיליליטר אחד של מי מילפור (millipore water). לאחר מכן, מדדו את הדגימות בספקטרופוטומטר של בליעה אטומית המצויד בתנור אטומיזציה גרפיטי עם חימום רוחבי.בסופו של דבר, ניתן להשתמש בניתוח שטף סומנים באמצעות ספקטרומטריית בליעה אטומית כדי לקבוע קינטיקת הובלה או עיכוב, את התלות של ההובלה במתח חשמלי, ואת הסטוכיומטריה של ההובלה, וניתן להשתמש בשיטה זו בהמשך לסריקה פרמקולוגית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה חלופה מדויקת, זולה ובטוחה לניסויי שטף סומנים קונבנציונליים עם רדיו-איזוטופים.השיטה מציעה גם מדידה מדויקת של השפעת פוטנציאל הממברנה על תפקוד הנשא. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קשרים מבנה-תפקוד של TPAs מסוג P-type A, ניתן להחילה אותה גם על חלבונים נשאי ממברנה אחרים הספציפיים לספיגה של נחושת או יסודות קורס אחרים. הכ

measuring-cation-transport-nak-hk-atpase-xenopus-oocytes-atomic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בצמחים מדידה של שטפי חומרים מזינים ורעלים חיונית לחקר תזונת הצמח ורעילותו. כאן, אנו מכסים פרוטוקולי רדיו-מעקב לקביעת זרם ופליטה בשורשי צמחים שלמים, תוך שימוש בשטפי אשלגן (K+) ואמוניה/אמוניום (NH3/NH4+) כדוגמאות. נדונים יתרונות ומגבלות של טכניקות כאלה.

מדידת שטפים של חומרים מזינים ומינרליים רעלים בצמחים עם חומרים רדיואקטיביים

החלק הראשון של מאמר זה מראה כיצד לבחור קווי תאים מוטנטיים המבטאים מחליפי Na+/H+ שלפוחיתיים בקרום הפלזמה שלהם. החלק השני מספק פרוטוקולים המבוססים על מדידות pH תוך-תאיות וקליטת יונים מהירה, המשמשים לקביעת סלקטיביות היונים והפרמטרים הקינטיים של מחליפים אלה.

אפיון פונקציונלי של Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; מחליפי של תאיים תאים לשימוש Proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה

טרנספורטרים בקרומי התאים מאפשרים הפרדה דיפרנציאלית של יונים על פני קרומי התאים או שכבות התאים וממלאים תפקידים מכריעים במהלך פיזיולוגיה, תיקון ופתולוגיה של רקמות. אנו מתארים את המיקרו-אלקטרודה המתייחסת לעצמה סלקטיבית של יונים המאפשרת מדידה של שטפי יונים ספציפיים בתאים ורקמות בודדות in vivo.

מדידה של תאי יון שטפי שימוש בטכניקת microelectrode העצמית התייחסות יון סלקטיבי

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של assay רמזי למדידת שיעורי הפרשת נוזל מצינוריות Malpighian (כליות) מבודדות מmelanogaster תסיסנית. בנוסף, השימוש באלקטרודות יון ספציפי למדידת ריכוזי נתרן ואשלגן בנוזל המופרש, המאפשר חישוב של שטף יון transepithelial, מתואר.

שימוש של assay רמזי כדי למדוד את הפרשת נוזלים ויון שטף מחירים ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; אבובית Malpighian

מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ"א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספיקות כאורחים סביבה תאיים.

יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגלות תרכובות פעיל קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה.

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

באמצעות שיטת הסריקה (NADH)-ביחד התאמה ATPase הותאמה הקרנה חצי תפוקה גבוהה של מולקולה קטנה רירן מעכבי. זה שיטת הקינטי מופעל בפורמט 384-היטב אימונולוגיה עם כמויות התגובה הכולל של רק 20 μl לכל טוב. הפלטפורמה צריכה להיות ישימה כמעט כל הפקת האנזים.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. הקישור נמדד כהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים של טריניטרופניל לבין חלבון המסומן בחומצת אמינו פלואורסצנטית לא קנוני.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש את היישום של טכניקת כתם מערבית כדי לחקור את הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2. הפרוטוקול מתאר את חקירת הזרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז Thr906/1007 באמצעות כתם מערבי. כמו כן, שיטות נוספות לאישור פעילות KCC2 מודגשות בקצרה בטקסט זה.

חקר הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2 באמצעות כתם מערבי

למדו שיטה לכימות פעילות Na,K-ATPase בביציות Xenopus באמצעות ספקטרופוטומטריית קליטה אטומית. שיטה זו מספקת חלופה בטוחה ורגישה לניסויים רדיואיזוטופיים מסורתיים.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב

גלה סרטונים נוספים