ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים בתרומה של הרנטה סנו בהריון הפרוטוקול הראשוני. Ad&#39;A. מחזיק את התכשיטים לילדים (JFC) ניחן קתדרה לגנטיקה וריפוי גנטי. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי מענקי NIH GM60905, DK52025 וCA021764, ואת הצדקה האמריקנית הלבנונית הסורית, המזוהית (ALSAC).

<html> הפרוטוקול הבא מיועד לבידוד והטיהור של MAMs ופנינים ממוח העכבר פתרונות הנדרשים לבידוד, MAMs ופניני מיטוכונדריה חלוקה להשיג הכנת המיטוכונדריה גולמית: פתרון: סוכרוז 0.32 מ &#39;, 1 המ&quot;מ 3 NaHCO, 1 המ&quot;מ MgCl 2, 0.5 מ&quot;מ CaCl 2 + מעכבים פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך) פתרון ב &#39;: סוכרוז 0.32 מ&#39;, 1 המ&quot;מ NaHCO 3 + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך) בידוד MAMs: בידוד בינוני: 250 המ&quot;מ מניטול, pH 5 המ&quot;מ HEPES 7.4, 0.5 המ&quot;מ EGTA, 0.1% BSA מאגר השיפוע: 225 המ&quot;מ מניטול, pH 25 המ&quot;מ HEPES 7.5, 1 המ&quot;מ EGTA, 0.1% BSA (ריכוז סופי) בידוד פנינים: תוכן &quot;&gt; הצפת חילוץ GEM: 25 HEPES mM pH 7.5, 0.15 מ &#39;NaCl, 1% Triton X-100 + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך) מאגר GEM Solubilising: 50 mM טריס-HCl, 8.8 pH, 5 המ&quot;מ EDTA, 1% SDS + מעכבי פרוטאז (להוסיף טרי, לפי צורך). 1. היפוך חלוק ראשון שלב subcellular: הסרה של גרעינים, תאי Unlysed ופסולת ניידת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בתא 2 CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להסיר מוח, לחצות, להניח ב2 צינורות מ&quot;ל על קרח ולשקול. </li></ol> שים לב: שמור על חצי מוח נפרד לאורך כל ההליך. להלן חל על הטיפול בחצי מוח אחד. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוח מניח מחצית במטחנה מראש מצוננת 2 מיליליטר זכוכית Dounce רקמות המכילה א פתרון 1 מ&quot;ל הקר הומוגני עם 15 משייכות כוללות של עלי פינוי גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לצינור 15 מ&quot;ל בז, על קרח, ולדללhomogenates עד 10 כרכים w / v, למשל 0.225 גרם לרמה של 2.25 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב 1400 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant והעברה לצינור צנטריפוגה זכוכית עגולה עם תחתית 30 מ&quot;ל, על קרח. הקפד לא להפריע לגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגלולה באותן 10 כרכים של פתרון. הומוגני באותה המטחנה, עם 3-6 משייכות של עלי סיקול קטן, 1 מ&quot;ל בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לצינור טרי 15 מ&quot;ל בז וצנטריפוגה XG ב 710 עבור 10 דקות ב 4 ° C. התוצאה היא גלולה של גרעינים ופסולת של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant וברכה עם supernatant שמר בשלב 1.6. </li></ol> 2. שלב שנייה: בידוד המיטוכונדריה גולמי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatants ב13800 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, על קרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 10 כרכי פתרון. הומוגני באותה המטחנה, עם 3-6 משייכות של עלי סיקול קטן, 1 מ&quot;ל בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כצעד 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2-2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגלולה המתקבלת היא שבריר המיטוכונדריה מועשרת. ברכה את supernatants (cytosol ומיון), מכסה בparafilm ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגלולה עם 6 משייכות של עלי סיקול קטן, ב4.8 המ&quot;ל / גרם (ז נקרא משקל המוח המקורי) של הפתרון של B, בhomogeniser טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettes הזכוכית פסטר, להכין Gradient סוכרוז רציף בצינורות צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, והוסיף מאוחר יותר לחלק התחתון של הצינור כדלקמן, בזהירות, להבטיח ללא בועות נוצרות: Resupended הגלולה (0.32 סוכרוז M) 3 המ&quot;ל סוכרוז 850 מ&quot;מ (במ&quot;מ 3 NaHCO 1) 3 סוכרוז מ&quot;ל 1 M (במ&quot;מ 3 NaHCO 1) 3 1.2 המ&quot;ל סוכרוז M (במ&quot;מ NaHCO 13) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 82500 ל2 שעות ב 4 ° C. הפרדת התוצאה בסוף השיפוע תהיה לייצר שלוש להקות וגלולות: 1) המיאלין ומזהמים אחרים בממברנה (0.32 מ - 0.85 ממשק M), 2) ER, Golgi, קרום פלזמה (0.85 מ &#39;- 1 ז ממשק); 3) synaptosomes (1 מ - 1.2 מ &#39;ממשק): 4) גולמי המיטוכונדריה (גלולה) המשמש לטיהור הצעדים הבאים </li></ol> 3. בידוד של ממברנה ER-המיטוכונדריה משויכת, MAMs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גולמי מיטוכונדריה המבודדת טרי מהחצי מוח אחד, בבידוד בינוני מ&quot;ל 2 המכילים מעכבי פרוטאז הוסיפו טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 30% שיפוע עם Percoll מיליליטר Gradient המאגר 8 לכל חצי מהמוח, ומקום בTube צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear. </li></ol> * הערה: ודא חיץ שיפוע מרוכז יותר (1.43 ימים) כדי להשיג ריכוז סופי נכון אחרי דiluting Percoll עד 30%. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית המיטוכונדריה שכבה על גבי שיפוע מוכן לאט, כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 95000 למשך 30 דקות, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבר הכבד (רצועה תחתונה) הראשון עם זכוכית פיפטה פסטר ולהעביר לצינור זכוכית עגולה בתחתית טרי, על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את בר האור (רצועה העליונה) השני עם זכוכית פיפטה פסטר אחר ולהעביר לשפופרת זכוכית נפרדת טריה ישבן עגול, על קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למהול שני השברים שנאספו בשלב 3.5 עם 10 מ&quot;ל בינוני בידוד וצנטריפוגה XG ב 6300 עבור 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השליכו את supernatant מהבר הכבד הושג בשלב 3.6, resuspend הגלולה עם בידוד בינוני עוד 10 מ&quot;ל וסרכזת שוב, כצעד 3.6. הגלולה שתתקבל תהיה חלק המיטוכונדרי הטהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant מfrac האורtion הושג בשלב 3.6 ל Tube צנטריפוגה Beckman-Ultra Clear, על קרח. השלך את הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני בידוד מספיק כדי supernatant הושג בשלב 3.8 למלא את הצינורית וצנטריפוגה XG ב 100.000 ל1 שעות, 4 ° C. הגלולה שתתקבל תהיה שבריר MAMs. מוציא בזהירות ולהשליך supernatant. </li></ol> הערה: בשלב זה, ייתכן שגם חובצה ב -100,000 XG ל1 שעות, 4 ° C supernatant הציל בשלב 2.6. הגלולה תהיה שבריר ER וsupernatant שבריר cytosolic. 4. הפקת Glycosphingolipid מועשר-Microdomains, אובניים החן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse שברי מיטוכונדריה ו / או MAM טהורים ב500 מ&quot;ל μl-1 של הצפת חילוץ עבור 20 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysates ב15300 XG עבור 2 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף supernatants (X-100 חומרי טריטון מסיסים) וגלולות מחדש צנטריפוגותעבור 2 דקות שנותר כדי להסיר חומרים מסיסים. (טריטון X-100 חולץ המיטוכונדריה ו / או טריטון X-100 MAMs חולץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize כדורים בSolubilising מאגר. חומרי solubilized זה מייצג את שברי GEM ויכולים לשמש לניתוח נוסף. </li></ol>

<ol><li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2%2B+signaling+in+smooth+muscle%3A+why+two+membranes+are+better+than+one%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li>
<li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+%28SOCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li>
<li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum%3A+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li>
<li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca%282%2B%29-dependent+mitochondrial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li>
<li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot%3A+The+mitochondria-associated+membrane+%28MAM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li>
<li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li>
<li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li>
<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+with+high+Ca2%2B+close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li>
<li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li>
<li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li>
<li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER-mitochondria+interface%3A+the+social+network+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li>
<li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li>
<li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li>
<li>Pizzo, P., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+lipid+rafts%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte lipid rafts: structure and function.</a> Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).</li>
</ol>

אף אחד מהמחברים יש ניגודי עניינים שיכריזו.

האתרים של מגע בין קרומים תאיים או בין האברונים וקרום הפלזמה של תאים מייצגים פלטפורמות איתות דינמיות לתהליכים תאיים בסיסיים. האפיון המדויק של התפקוד ובהרכב שלהם תחת שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים דורש פרוטוקולי טיהור אמינות ושחזור. השיטות, כמפורט כאן כבר מותאמות במיוחד על ידי המעבדה שלנו לבידוד והטיהור של MAMs והפנינים המקבילות שלהם ממוח העכבר הבוגר. פרוטוקול זה יושם בהצלחה לזיהוי המולקולרי והשפיע המציין microdomains אלה, ומונחים ביסוד מורד המסלול אפופטוטיים של Ca 2 + ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> חלוקה </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד, Hexahydrate </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> כלוריד סידן, dihydrate </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-מניטול </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> M9546-250 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> E4378-250 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, V בר, הלם חום, Lyophilizate </td><td> רוש </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> פנינה </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T9284-500 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> כלוריד הנתרן </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> טריס בסיס </td><td> רוש </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> סולפט Dodecyl נתרן (SDS) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> משותף </td></tr><tr><td> טבליות מעכבי פרוטאז, שלמות EDTA חינם </td><td> רוש </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> 2 מטחנות רקמות מ&quot;ל Douce כל הזכוכית </td><td> קימבל צ&#39;ייס </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 צינורות מ&quot;ל פוליפרופילן חרוטי צנטריפוגות, BD פלקון </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 צינורות זכוכית צנטריפוגות ישבן עגול מ&quot;ל </td><td> קימבל צ&#39;ייס </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ישבן עגול הזכוכית Centri מ&quot;לצינורות fuge </td><td> קימבל צ&#39;ייס </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> צינורות Ultracentrifuge, Ultra-ברור, Thinwall, מ&quot;מ 14x89 </td><td> Beckman-קולטר </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> קולמן לבן זוג </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> פנוי ורוסיליקט זכוכית פסטר Pipets, 9 &quot; </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 13-678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

ממברנות המיטוכונדריה הקשורים er (mams) וmicrodomains glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

האברונים תאיים הם מבנים דינמיים מאוד עם צורות שונות ובהרכב, שכפופים לרמזים פנימיים וחיצוניים של תאים ספציפיים. הקרומים שלהם לעתים קרובות באתרי juxtaposed מגע מוגדר, אשר הופכים לרכזות חילופי מולקולות איתות ורכיבי קרום 1,2,3,4. את microdomains הקרום בין organellar שנוצרו בין reticulum endoplasmic (ER) ואת המיטוכונדריה בפתיחת Ca IP3 הרגיש 2 + ערוץ ידוע כמו קרומים קשורים-ER מיטוכונדריה או MAMs 4,5,6. רכב חלבונים / שומנים והתכונות הביוכימיות של אתרי מגע קרום אלה נחקרו רבים בעיקר בהקשר לתפקידם בוויסות התאי Ca 2 + 4,5,6. ER משמש כחנות העיקרית של Ca 2 + התאי, ובמסגרת זו מווסתת מספר עצום של תהליכים תאיים במורד זרם של Ca 2 + איתות, כוללuding מתקפל וחלבון maturation7 חלבון שלאחר translational. המיטוכונדריה, לעומת זאת, לשמור על Ca 2 + הומאוסטזיס, על ידי אגירת cytosolic Ca 2 + ריכוז ובכך למנוע את החניכה של מסלולים אפופטוטיים במורד הזרם של Ca 2 + איזון 4,8. האופי הדינמי של MAMs הופך אותם אידיאליים אתרים לנתח מנגנונים תאיים בסיסיים, כולל Ca 2 + איתות ובקרה של המיטוכונדריה Ca 2 + ריכוז, ביוסינתזה שומנים ותחבורה, חילוף חומרים של אנרגיה ותא הישרדות 4,9,10,11,12. כמה פרוטוקולים שתארו לטיהור microdomains אלה מרקמת כבד ותאים בתרבית 13,14. לוקח שיטות שפורסמו בעבר בחשבון, יש לנו מותאם פרוטוקול לבידוד של המיטוכונדריה וMAMs ממוח העכבר הבוגר. להליך זה יש לנו הוספתי שלב נוסף טיהור, כלומר מיצוי x100 טריטון, שדוארnables הבידוד של שבריר glycosphingolipid המועשר microdomain (GEM) של MAMs. הכנות GEM אלה חולקים מספר מרכיבי חלבון עם רפסודות caveolae ושומנים בדם, הנגזרות מקרום הפלזמה או קרומים תאיים אחרים, והציעו לשמש איסוף נקודות עבור האשכולות של חלבוני הקולטן ולאינטראקציות בין חלבונים 4,15.

בהתבסס על הניסיון שלנו בשימוש בפרוטוקול זה אנו יכולים בבטחה ממליצים עליו לבידוד והטיהור של MAMs, אובניים חן ופיצולי המיטוכונדריה ממוח עכבר. ההליך כפי שמתואר הוא שחזור ומתואם היטב. באיור 1 אנו מראים תמונה מייצגת של דרך שכבת המיטוכונדריה וMAMs הטהורה בשיפוע Percoll (שלב 3.4). להקה מוגדרת, חלבית המכילה מטוהרת מבדלת מיטוכונדריה (מיטו-P) בתחתית של תחתית ultracentrifuge, תוך שבריר MAM מפצה להקה מפוזרת ורחבה מעל למיטוכונדריה. לאחר התאוששות זהירה של להקות השיפוע הבודדות, ...

הליך זה מדגים כיצד לבודד מהמוח המבוגר עכבר קרומי המיטוכונדריה או MAMs הקשורים ER וmicrodomain המועשרים glycosphingolipid השברים מMAMs ותכשירי המיטוכונדריה.

ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד את המיטוכונדריון, ממבנה הרשת האנדופלזמית, מיקרו-דומיינים, או MAMs ממוח של עכבר. MAMs מבודדים עוברים מיצוי נוסף כדי להשיג פראקציות של מיקרו-דומיינים עשירים בליפידים מסוג glyco finger או gems. פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי נתיחה של מוח העכבר, אשר לאחר מכן עובר הומוגניזציה בבופר ספציפי באמצעות הומוגנייזר דהנז (Dounce homogenizer). ההומוגנאט המתקבל עובר סבב צנטריפוגה במהירות נמוכה כדי להסיר גרעינים, תאים לא מפוצצים ושאריות תאיות.השלב השני הוא הכנת פראקציה מיטוכונדריאלית גולמית. באמצעות צנטריפוגציה נוספת של העילאי, המשקע המתקבל מסומסס מחדש ומופר further באמצעות מדרג סוכרוז לא רציף. לאחר מכן, הפראקציה המיטוכונדריאלית הגולמית מועברת למדרג Percoll.לאחר צנטריפוגציה ומספר שלבי שטיפה, מתקבלים הפרקציה המיטוכונדריאלית הטהורה וה-MAMs. השלב הסופי הוא טיפול של ה-MAMs בתמיסה המכילה TRITTON X 100 כדי למצות את פרקציית המיקרו-דומיין העשירה בליפידי glyco finger. לבסוף, טוהר הפרקציות מאושר באמצעות אנליזות western blot תוך שימוש בנוגדנים נגד סמני חלבון המאפיינים את פרקציות האברונים השונות.היתרון המרכזי של הליך זה על פני שיטות קיימות הוא שהותאם הוא לבידוד של פראקציות ממברנה פנימית ומטריקס של מיטוכונדריה ממוח של עכבר בוגר, תוך שימוש בכמות קטנה יחסית של חומר מחקר. הליך מותאם זה הוא בעל הדירות גבוהה ומאפשר בידוד של כמויות מספיקות של פראקציות אורגנלות שונות לשימוש על ידי חוקרים, במיוחד אלה בתחום הנוירוביולוגיה. לצורך ניתוח החלבונים הרלוונטיים, את ההליך תדגים טכנאית מהמעבדה שלי.לאחר הוצאת המוח מעכבר שהורדם באמצעות פחמימן דו-חמצני, התחילו את הפרוצדורה על ידי חיתוך המוח לשני חצאים. העבירו כל חצי לשפרונג נפרד בנפח 2 mL על קרח. שקלו את השפרונגים תוך שימוש בשפרונג ריק בנפח 2 mL שקוירר מראש לצורך איפוס המאזניים, ואחסנו אותם על קרח.העבירו מחצית מהמוח למטחנת רקמות זכוכית בנפח 2 milliliters שקוללה מראש ומכילה 1 milliliter של תמיסת פרקציונציה קרה. ביצעו הומוגניזציה באמצעות 15 תנועות כוללות של עמש עם מרווח גדול. העבירו את ההומוגנאט למבחנת Falcon סטרילית בנפח 15 milliliters על קרח ודללו עד ל-10 נפחים של תמיסת פרקציונציה קרה A בהתבסס על משקל הדגימה.לאחר מכן, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-1,400 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant), תוך הקפדה לא להפריע למשקע, והעבירו אותו לתוך מבחנת צנטריפוגה מזכוכית בעלת תחתית עגולה בנפח של 30 milliliters על קרח. לאחר מכן, השעיקו מחדש את המשקע ב-10 נפחים של תמיסת הפרדה (fractionation solution).הומוגניזו את המשקע שהושעה באותו גרינדר, מיליליטר אחד בכל פעם. הפעם השתמשו בשלושה עד שישה תנועות של פסטל בעל מרווח קטן. העבירו את התוצר ההומוגני לפלסון (Falcon) של 15 מיליליטר וסבבו בצנטריפוגה ב-710 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.תוצאה זו היא גרעינים ושיירי תאים. הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) ואחדו אותו עם הנוזל העליון שנשמר מהצנטריפוגה הקודמת; כדי להתחיל בבידוד המיטוכונדריה, הצנטריפגו את הנוזלים העליונים ב-13,800 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון למבחנה של צנטריפוגת UltraClear Beckman על קרח.יש להשעות את המשקעים המכילים את פראקציית המיטוכונדריה ב-10 נפחים של תמיסת פראקציונציה A ולבצע הומוגניזציה של מיליליטר אחד בכל פעם. הפעם השתמשו בשלושה עד שישה תנועות של פסטל עם מרווח קטן, תוך איסוף ההומוגנאטים למבחנה זכוכית חדשה של 30 מיליליטר בעלת תחתית עגולה על קרח. טהרו את הדגימה באופן נוסף על ידי חזרה על שלבים אלו פעם אחת נוספת.סנטריפוגו את ההומוגנאט. הסירו את הסופרנאטנטים (S) ובצעו הומוגניזציה חוזרת למשקע התאים, פעם אחת לכל מיליליטר, לאחר השעייתו ב-10 נפחים של תמיסה A. השלב הבא הוא השעייה חוזרת של המשקע המכיל את פראקציית המיטוכונדריה המועשרת ב-4.8 מיליליטר של תמיסת פראקציונציה B לכל גרם של משקל מוח מקורי; בצעו הומוגניזציה באמצעות שישה מכות של פסטל בעל מרווח קטן בהומוגנייזר נקי ושמרו הומוגנאט זה על קרח. לאחר מכן, הכינו מדרג סוכרוז לא רציף בתוך מבחנה לסנטריפוגה מסוג UltraClear Beckman.ראשית, הוסיפו את המשקע לאחר השביעה, ולאחריו שלושה מיליליטרים של סוכרוז בריכוז 850 millimolar, שלושה מיליליטרים של סוכרוז בריכוז 1 molar, ולבסוף שלושה מיליליטרים של סוכרוז בריכוז 1.2 molar. הקפידו להוסיף את התמיסה באיטיות מהתחתית כדי להבטיח שלא ייווצרו בועות. לבסוף, סבבו בצנטריפוגה ב-82,500 ×g למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 °C.ההפרדה שתתבצע תניב שלושה פסים ומשקע. המשקע מכיל את המיטוכונדריה הגולמיות שישמשו בשלבי הטיהור הבאים. סספנדו את המיטוכונדריה הגולמיות שבודדו acabado מחצי מוח אחד ב-2 mL של מצע בידוד.בשלב הבא, הוסיפו שמונה מיליליטר של מדרג 30% Percoll לפקעת צנטריפוגה UltraClear Beckman נקייה. העבירו את תרחיף המיטוכונדריה מעל המדרג שהוכן באיטיות רבה כדי למנוע היווצרות בועות. לאחר מכן, בצעו צנטריפוגה ב-95,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס (°C) בעקבות הפרדת המדרג.ראשית, הסר את הפракציה הכבדה, שהיא הפס התחתון, באמצעות פיפטת פסטה מזכוכית, והעבר אותה לנבובת זכוכית בעלת תחתית עגולה נקייה. שמור את הנבובת על קרח. לאחר מכן, הסר את הפракציה הקלה, שהיא הפס העליון, באמצעות פיפטת פסטה מזכוכית חדשה והעבר אותה לנבובת זכוכית נפרדת בעלת תחתית עגולה נקייה.הניחו גם מבחנה זו על קרח. דללו את שני השברים עם 10 milliliters של מצע בידוד וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 6,300 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius. השליכו את העילג (supernatant) מהשבר הכבד והשעו שוב את המשקע עם 10 milliliters נוספים של מצע בידוד.סבב את הדגימה שוב בצנטריפוגה תחת אותם תנאים. המשקע שיתקבל יהיה הפרקציה המיטוכונדריאלית הטהורה. לאחר מכן, העבר את הנוזל העליון מהפרקציה הקלה למבחנת צנטריפוגה מסוג UltraClear Beckman על קרח.את המשקע משבר זה שולכים, כיוון שהוא מכיל מיטוכונדריה מזוהמות. יש להוסיף מצע בידוד מספיק לנוזל העליון של השבר הקל עד למילוי המבחנה, ולסבב בצנטריפוגה ב-100,000 times G למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס (°C). המשקע שיתקבל יכיל את קרומי הרשת האנדופלזמית הקשוריים למיטוכונדריה (MAMs).הסר בזהירות והשלך את השכבה העליונה. התחל במיצוי של מיקרו-דומיינים עשירים בליפידים (glyco finger lipid enriched micro domains) או gems על ידי אינקובציה של פראקציית ה-MAM ב-500 µL עד 1 mL של באפר מיצוי על קרח למשך 20 דקות. לאחר מכן, סבב את הליזאט בצנטריפוגה ב-15,300 ×g למשך שתי דקות ב-4 °C.אספו את הנוזל העליון (supernatant) וסובבו את המשקע בצנטריפוגה למשך שתי דקות כדי להסיר את כל החומר הממיס שנותר ב-tritons 100, ובסוף השעיקו מחדש את המשקע עם בופר ההמסה. חומר מומס זה מייצג את מקצרי ה-gem וניתן להשתמש בו לצורך אנליזה נוספת. בוצעו Western blots כדי לבדוק את הניקיון וההתפלגות של סמנים לרשתית האנדופלזמית, חלבונים ציטוזוליים וסמנים מיטוכונדריאליים בחלק הציטוזולי.פракציית הרשת האנדופלזמית, פракציית המיטוכונדריה הטהורה ופракציית ה-MAMs. בדיקות Western blots הראו גם כי הגמנים (gems) היו חיוביים ל-cavi in one, סמן של cli, ושליליים לחלבונים של הרשת האנדופלזמית והמיטוכונדריה. מנגד, ה-MAMs שחולצו באמצעות Triton X 100 היו חיוביים לסמני רשת אנדופלזמית ומיטוכונדריה והראו מעט cavi in one במהלך ניסיון ביצוע פרוצדורה זו.חשוב לזכור להשתמש ברקמת מוח שחולצה במיד לפני השימוש, ולשמור לאחר מכן את כל התמיסות, הדגימות והמבחנות על קרח. כמו כן, מומלץ לשמור כמות קטנה מהדגימה מכל שלב בתהליך הפרדת השברים (fractionation), כדי שניתן יהיה לקבוע באמצעות immune blotting את מידת ההצלחה הכללית של הליך הניקוי.

mitochondria-associated-er-membranes-mams-glycosphingolipid-enriched

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הדמיה וניתוח מיטוכונדריאלי מרקמת מוח של יונקים היא משימה מאתגרת. כאן, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בניתוח שחזור תלת מימדי (תלת מימד) ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוק סדרתי (SBFSEM) כדי לקבל תובנות על הניתוח המורפולוגי והנפחי של אברון ייצור אנרגיה קריטי זה.

ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח המושרים תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים והשימוש בהם בדוגמנות מחלות מיטוכונדריאליות.

דור אורגנוידים במוח האדם למידול מחלות מיטוכונדריאליות

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

אנו מציגים פרוטוקול דו-שלבי לבידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה התואם לגילוי וכימות חלבונים בקנה מידה של פרוטאום. הפרוטוקול שלנו אינו דורש הנדסה גנטית ולכן מתאים לחקר מיטוכונדריה מכל תא ורקמות ראשוניים.

בידוד דו-שלבי ללא תגים של מיטוכונדריה לשיפור גילוי וכימות חלבונים

כאן, אנו מתארים את מדידת קצב ההובלה האקסונלית של מייצבים מכוננים של ממברנות רשתית אנדופלזמית (ER) הקשורות למיטוכונדריה (MAMs) על ידי הגדלה או שמירה על יצירת β-עמילואיד (Aβ) נוירוטוקסית מנוירונים של מחלת אלצהיימר (AD) בזמן אמת כדי לשמש כמדד ישיר וכמותי למדידת ייצוב MAM ולסייע בפיתוח טיפולים במחלת אלצהיימר.

ניתוח כמותי של ייצוב קרום הרשתית האנדופלזמית (MAM) הקשור למיטוכונדריה במודל עצבי של מחלת אלצהיימר (AD) 

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים 

פותח פרוטוקול להכנת מיטוכונדריה מטוהרת מתאי מיקרוגליה, בידוד חלבונים מיטוכונדריאלים לשחרור N-גליקן, וזיהוי מהיר של גליקנים תת-תאיים, מיטוכונדריאלים באמצעות יינון אלקטרו-ספריי לייזר בעזרת מטריצת אינפרא אדום יחד עם ספקטרומטריית מסה מדויקת ברזולוציה גבוהה.

הכנה מיטוכונדריאלית ממיקרוגליה לניתוח גליקן

למדו לבודד ממברנות ER הקשורים למיטוכונדריה (MAMs) ומיקרו-דומיינים עשירים בגליקוספינגוליפידים (GEMs) ממוח עכבר בוגר. שיטה זו משלבת ניתוח, הומוגניזציה וצנטריפוגציה בגרדיאנט סוכרוז לא רציף לבידוד מרכיבים תאיים חיוניים למחקר בתחום הנוירוביולוגיה והביולוגיה התאית.

ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

גלה סרטונים נוספים